豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立

于　靜，勞秀杰，陳彥永，何小江，代　兵，趙阿勇，王曉杜，宋厚輝（浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江臨安311300）

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豬圓環(huán)病毒2型實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立

于靜，勞秀杰，陳彥永，何小江，代兵，趙阿勇，王曉杜，宋厚輝
（浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，浙江臨安311300）

摘要：豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus 2, PCV2），是感染豬Sus scrofa domestica的一種單鏈DNA病毒。建立一種快速、靈敏的檢測方法，對于PCV2感染豬的篩選和疾病預(yù)防非常重要。根據(jù)PCV2 ORF2基因保守區(qū)，設(shè)計(jì)了熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）引物，利用SYBR Green作為熒光染料建立了一種定量檢測PCV2的PCR方法。結(jié)果表明：該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，每微升的最低檢測限低至101拷貝DNA。利用該方法對34份PCV2陽性臨床樣本進(jìn)行檢測，檢測符合率為100%，明顯高于普通PCR方法的50.0%。因此，本研究建立的PCV2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法為該疾病的預(yù)防和控制提供一種有效的檢測工具。圖4表4參26

關(guān)鍵詞：動(dòng)物學(xué)；豬；豬圓環(huán)病毒2型；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

豬圓環(huán)病毒2（porcine circovirus 2，PCV2），是最小的DNA病毒，斷奶仔豬Sus scrofa domestica多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS）的主要病原，成為嚴(yán)重阻礙養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要病原之一［1-3］。國內(nèi)外針對PCV2致病機(jī)制、診斷方法以及疫苗研制等方面開展了大量的研究［1, 4］。然而，PCV2依然阻礙著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，主要原因可能是其臨床發(fā)病與亞臨床感染豬群中病毒量的不同，檢測過程容易造成漏檢，導(dǎo)致錯(cuò)誤診斷。因此，發(fā)展一種高靈敏度、快速檢測PCV2的方法尤為重要。豬圓環(huán)病毒（PCV）分為PCV1和PCV2等2種基因型，它們基因組結(jié)構(gòu)相似，均含有ORF1和ORF2等2個(gè)主要的開放閱讀框。ORF1是引起PCV1和PCV2抗原交叉反應(yīng)的主要原因，其變異很小，同源性高達(dá)85%；而ORF2基因是PCV2的重要抗原基因，編碼病毒衣殼蛋白（Cap蛋白）［5］，其變異較大，在兩型PCV之間不存在抗原交叉反應(yīng)，被視為PCV1和PCV2的特異性鑒別抗原［6-8］，并在臨床檢測中取得了良好的效果?；贠RF2的較大變異，可以設(shè)計(jì)特異性引物對PCV的2個(gè)基因型進(jìn)行鑒定，已成為PCR方法鑒定PCV2的重要靶基因［9］?；贠RF2的這些優(yōu)勢，本研究也選擇ORF2作為鑒定引物設(shè)計(jì)的首選基因。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法簡單、方便、快速、敏感，在疾病檢測中廣泛應(yīng)用，但其高假陽性和易污染的缺點(diǎn)依然存在。PCV2的抗體檢測，敏感性和特異性都比較好，但是價(jià)格昂貴，技術(shù)要求較高。像多重PCR、巢式PCR等技術(shù)，雖然也可以達(dá)到很高的靈敏度，但是卻不能定量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，不僅操作簡便、敏感性高、重復(fù)性好、省時(shí)和可定量分析等優(yōu)點(diǎn)，是病毒檢測的重要方法。因此，本試驗(yàn)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)構(gòu)建快速、靈敏檢測PCV2的方法，以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室和臨床中對PCV2的實(shí)時(shí)定量檢測。

1　材料與方法

1.1材料和臨床病料

PCV2，豬藍(lán)耳病毒（PRRSV，lelystad virus），豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，PPV）和豬瘟病毒（CSFV，hogcholera virus）等菌株由浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物預(yù)防醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生實(shí)驗(yàn)室保存。19份病灶樣品采自杭州國茂生態(tài)農(nóng)業(yè)科技開發(fā)有限公司（簡稱：國茂），11份陽性病料和4份陰性對照由杭州檢疫中心（杭州國正檢測技術(shù)有限公司，簡稱：國正）惠贈。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成

ORF2是PCV2的主要免疫原基因，也是主要用于PCR鑒別的基因［9］。根據(jù)GenBank公布的PCV2 ORF2基因序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)ORF2基因全長克隆、普通PCR以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，并通過BLAST對其特異性進(jìn)行分析。引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列詳見表1。

表1　實(shí)驗(yàn)中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3陽性質(zhì)粒的制備與稀釋

將擴(kuò)增的ORF2片段與pZERO-blunt載體連接，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌Escherichia coli DH5α，提取重組質(zhì)粒，并進(jìn)行測序。用紫外分光光度計(jì)測定重組質(zhì)粒的吸光度D（260）和D（280），計(jì)算出重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)，用EASY Dilution試劑將陽性重組質(zhì)粒稀釋到1010拷貝·μL-1，再進(jìn)行10倍梯度稀釋，以108，107，106，105，104，103，102，101，100拷貝·μL-19個(gè)拷貝數(shù)梯度作為標(biāo)準(zhǔn)模板，-20℃凍存?zhèn)溆?。質(zhì)粒質(zhì)量濃度（g·L-1）=D（260）×50（g·L-1）/1 000×準(zhǔn)模板釋稀釋倍數(shù)。

拷貝數(shù)計(jì)算公式：拷貝數(shù)（拷貝·μL-1）=質(zhì)粒濃度（g·μL-1）×阿弗加德羅常數(shù)/重組質(zhì)粒分子量。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量反應(yīng)條件

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)采用20 μL體系，其組分如下：SYBRRPremix Ex Taq GC（2×）10 μL，qP1 （10 μmol·L-1）0.4 μL，qP2（10 μmol·L-1）0.4 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL，雙蒸水7.8 μL，模板1 μL。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性30 s，按95℃10 s，60℃20 s，72℃30 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以重組質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)品，進(jìn)行10倍梯度稀釋，取108～100拷貝·μL-1質(zhì)粒為模板，用優(yōu)化的實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系及程序進(jìn)行檢測，同時(shí)設(shè)空白對照，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品及空白對照均為3個(gè)平行重復(fù)。以起始模板拷貝數(shù)為x軸，循環(huán)閾值（Ct）值為y軸做回歸曲線，建立PCV2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的重復(fù)性分析

對不同比例的標(biāo)準(zhǔn)品DNA 104, 103和102拷貝·μL-1進(jìn)行批間和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)。樣本有3個(gè)平行重復(fù)（批內(nèi)重復(fù)），分別進(jìn)行3次重復(fù)（批間重復(fù)）。對所得Ct值的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)進(jìn)行分析。

1.7敏感性和特異性分析

敏感性分析：以不同梯度標(biāo)準(zhǔn)品為模板，分析最低檢出限，比較常規(guī)PCR與實(shí)時(shí)熒光定量PCR的敏感性差別。特異性分析：用所建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對已知陽性樣品豬圓環(huán)病毒2（PCV2），豬細(xì)小病毒（PPV），豬瘟病毒（CSFV）和豬藍(lán)耳病毒（PRRSV）病毒DNA（或cDNA）進(jìn)行檢測，確定該方法的特異性。

1.8臨床樣本的檢測

對采集的34份臨床樣品進(jìn)行檢測。用試劑盒提取DNA，用上述建立的方法進(jìn)行檢測。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的制備

以PCV2 DNA為模板，ORF2全長引物ORF2-F與ORF2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的片段大小為702 bp，連接到pZERO-blunt載體上，并用載體上的酶切位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切，出現(xiàn)載體片段和目的基因片段大小與預(yù)期一致，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確（圖1）。測序結(jié)果與目的片段序列也完全一致。抽提重組質(zhì)粒，并梯度稀釋為108，107，106，105，104，103，102，101，100拷貝·μL-19個(gè)比例的質(zhì)粒為標(biāo)準(zhǔn)模板。

2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以梯度稀釋重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。根據(jù)PCV2擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線，系統(tǒng)自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，拷貝數(shù)（x）與循環(huán)閾值（Ct）之間的線性關(guān)系曲線表達(dá)式（圖2C）為：Ct=-3.38× lgx + 35.98，其斜率為-3.38，相關(guān)系數(shù)（R2）為1，表明該標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性度較好；PCR的擴(kuò)增效率為97.6%，且表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR最低檢測線為101拷貝·μL-1。擴(kuò)增曲線平滑（圖2A），每個(gè)樣品之間間隔均勻，陽性樣品Ct值均在33以下，陰性對照樣品沒有擴(kuò)增，最低檢出限為101，因此，可以認(rèn)為Ct值為33時(shí)是陰性樣品和陽性樣品的臨界值，即Ct≤33可判為陽性，Ct＞33判為陰性。溶解曲線分析可以反映擴(kuò)增產(chǎn)物的正確性，是否有非特異性以及熒光信號是否由引物二聚體造成。本實(shí)驗(yàn)溶解曲線（圖2B）特征峰單一，Tm值（解鏈溫度）在86℃左右，表明是特異擴(kuò)增。由此可以證明本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測PCV2方法完全可信，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的重復(fù)性分析

實(shí)驗(yàn)重復(fù)性是方法穩(wěn)定性的標(biāo)志。為了驗(yàn)證本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的重復(fù)性，我們以不同比例的標(biāo)準(zhǔn)品DNA 104，103和102拷貝·μL-1進(jìn)行批間重復(fù)性試驗(yàn)，3份模板的3次批內(nèi)（表2）和批間（表3）重復(fù)檢測的Ct值誤差均不到0.5，變異系數(shù)均小于2%，結(jié)果表明該方法具有較高的重復(fù)性。

表2　實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2　Repetitive experimental results of intra-assay ofreal-time PCR method

表3　實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Repetitive experimental results inter-assay of real-time PCR method

2.4特異性分析

PCR擴(kuò)增易出現(xiàn)假陽性，會造成誤檢，給生產(chǎn)帶來負(fù)面效應(yīng)。因此，我們對本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法特異性進(jìn)行分析，結(jié)果表明（圖3）：經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，只有PCV2在Ct為18左右出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，而檢測的豬細(xì)小病毒（PPV），豬瘟病毒（CSFV），豬藍(lán)耳病毒（PRRSV）等樣品Ct值均大于33或無擴(kuò)增，被判定為陰性。以上結(jié)果證明：本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測PCV2的方法特異性高，可以用于后續(xù)臨床樣品分析。

圖3　特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 3　Result of specific analysis

2.5敏感性分析

敏感性對評價(jià)檢測方法的靈敏性非常重要，因此，我們分析了普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR這2種方法的敏感性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：普通PCR有擴(kuò)增條帶的模板濃度為104拷貝·μL-1，而實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法在模板比例為101拷貝·μL-1（圖4）時(shí)有擴(kuò)增，也就表明實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測PCV2的敏感性比普通PCR的敏感性高1 000倍。以上結(jié)果表明：本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測PCV2的方法敏感性高。

圖4　敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Figure 4 Results of sensitivity analysis

2.6臨床樣本的檢測

臨床樣品檢測是技術(shù)推廣的前提。本研究從杭州周圍豬場采集的34份樣品，其中陽性病灶樣品30份，陰性樣品4份，通過檢測發(fā)現(xiàn)普通PCR檢測方法符合率為50.0%，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測符合率為100%（表4），且?guī)Р悠返目截悢?shù)為101～104拷貝·μL-1。以上結(jié)果表明：本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測PCV2方法比普通PCR方法靈敏度高，能完全適合豬場疾病的檢測，且能夠定量分析樣品的病毒量。

表4　臨床樣品檢測結(jié)果Table 4 Analysis of clinical samples

3　討論

Ⅱ型豬圓環(huán)病毒可以引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS），育肥豬皮炎與腎病綜合征（PDNS），增生性壞死性肺炎（PNP），豬呼吸道綜合征，懷孕母豬的繁殖障礙、新生仔豬的先天性震顫（CT）和新生仔豬腹瀉病等疾?。?, 10-14］。中國很多地方豬養(yǎng)殖場PCV2陽性率高達(dá)100%，仔豬死亡率高達(dá)30%。目前，對PCV2引起疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)、致病機(jī)理以及對病毒本身的防治研究還不清晰［15］。PCV2引起疾病的預(yù)防主要通過注射疫苗，但是免疫效果不理想。

PCV2引起疾病的診斷主要采用臨床癥狀、病理剖解和實(shí)驗(yàn)室診斷等，這些方法診斷結(jié)果準(zhǔn)確，但耗時(shí)長、工作量大，實(shí)際生產(chǎn)中難以推廣應(yīng)用［16］。此外，這些方法對亞臨床感染豬的診斷經(jīng)常會遭遇困難。為了解決這些問題，實(shí)驗(yàn)室開展了血清中和實(shí)驗(yàn)、ELISA、膠體金試紙和PCR等方法用于檢測PCV2［17-21］。研究發(fā)現(xiàn)，豬圓環(huán)病毒2-dCap-ELISA抗體檢測試劑盒在檢測PCV2中具有成本低、不需要特殊儀器且能滿足基層需要的優(yōu)點(diǎn)［18］，但是操作過程比較繁瑣，中間環(huán)節(jié)可能會帶來污染。而瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和圓環(huán)病毒抗體膠體金試紙條檢測PCV2的方法，雖然特異性、穩(wěn)定性、符合率等都很高［17］，但是依然存在較高假陽性問題。近年來，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法在疾病檢測方面的應(yīng)用，進(jìn)一步提高了檢測的靈敏度，縮短了檢測時(shí)間。

本研究根據(jù)PCV2 ORF2基因設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物。ORF2編碼病毒的核衣殼蛋白（Cap），該蛋白可引起感染豬產(chǎn)生高含量的抗體，且在2個(gè)血清型（PCV1和PCV2）之間無交叉反應(yīng)性，是檢測病毒抗體水平的良好抗原［22］。因此，ORF2也成為PCR鑒別PCV2的重要基因［9］。郭慧娟等［23］根據(jù)ORF2設(shè)計(jì)TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，建立了PCV2檢測方法，其靈敏度高達(dá)到4.53×102拷貝·μL-1，而曹偉偉等［16］TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的最低檢測限度為5.06拷貝·μL-1。而SYBR Green I Realtime PCR檢測方法的靈敏度基本在10～100拷貝·μL-1，比普通PCR檢測方法檢測靈敏度提高100～1 000倍［24-25］。

本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測PCV2的方法能夠?qū)μ幱趤喤R床狀態(tài)豬進(jìn)行檢測，可以為該病的治療搶得寶貴時(shí)間。本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法與普通PCR相比，靈敏度提高了1 000倍，和已報(bào)道實(shí)時(shí)熒光定量PCR［16, 23, 25-26］檢測PCV2的靈敏度相似?？傮w來說，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測費(fèi)用較高，所需儀器和操作環(huán)境要求較高。但是，本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測PCV2的方法重復(fù)性和特異性高，不會造成錯(cuò)診，會大大減少因病毒蔓延導(dǎo)致的豬場經(jīng)濟(jì)損失。此外，本研究建立的實(shí)時(shí)熒光定量PCR還可以對PCV2進(jìn)行準(zhǔn)確定量，對感病豬的早期診斷和豬場分類防治管理提供了重要的依據(jù)。

4　參考文獻(xiàn)

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A real-time PCR method for detection of porcine circovirus 2

YU Jing, LAO Xiujie, CHEN Yanyong, HE Xiaojiang, DAI Bing, ZHAO Ayong, WANG Xiaodu, SONG Houhui

（School of Animal Science and Technology, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, Zhejiang, China）

Abstract:To develop an accurate and rapid detection method for disease screening and prevention with porcine

circovirus type 2（PCV2）, a single-strand DNA virus that infects pigs, primers targeted to the ORF2 fragment of the PCV2 conserved region were designed.A real time polymerase chain reaction（PCR）method was developed using SYBR Green as a fluorescent dye and serial dilutions of ORF2 recombinant plasmid to construct a standard curve for an absolute quantification.Results showed that the detection limit was obtained with 101

copy DNA per microliter.This method exhibited 1 000 times higher sensitivity than conventional PCR, only specific identification of PCV2, and better repeatability with the less than 2% variation coefficient of intra- or inter-assay experiments.A total of 34 PCV2 positive clinical samples were confirmed using this real time PCR method, demonstrating 100% agreement in comparison with the conventional PCR having only 50% agreement.This real time PCR method could provide a valuable tool for PCV2 prevention and control.［Ch, 4 fig.4 tab.26 ref.］

Key words:zoology; porcine; porcine circovirus 2; real-time PCR

作者簡介：于靜，講師，博士，從事畜禽遺傳與疾病控制研究。E-mail: yujing_2009@163.com。通信作者：宋厚輝，研究員，博士，從事動(dòng)物疫病防控和公共衛(wèi)生研究。E-mail: songhh@zafu.edu.cn

基金項(xiàng)目：浙江省科學(xué)技術(shù)公益項(xiàng)目（2014C32061）；浙江農(nóng)林大學(xué)人才啟動(dòng)項(xiàng)目（2011FR025，2013FR077）；浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LQ14C010007）；浙江農(nóng)林大學(xué)大學(xué)生科技創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201301017）；浙江農(nóng)林大學(xué)面上基金項(xiàng)目（2013FK001）

收稿日期：2015-04-19；修回日期：2015-06-22

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.02.023

中圖分類號:S852.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：2095-0756（2016）02-0357-07