局灶性腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究

姜立剛，李　雪，李海平，李　威

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林　132011)

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局灶性腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究

姜立剛，李雪，李海平，李威

(北華大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 吉林132011)

摘要：目的 研究局灶性腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡及其大鼠腦組織不同時(shí)間病理學(xué)改變情況.方法 隨機(jī)選取66只成年Wistatr大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字法分3組，對(duì)照組(假手術(shù)組，n=6)、觀察1組(腦缺血組，n=24)、觀察2組(腦缺血再灌注組，n=36).采用線栓法制造大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，手術(shù)后HE染色，并分別采用TUNEL法和電鏡觀察大鼠缺血灌注損傷后神經(jīng)元凋亡情況和細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化.結(jié)果 大鼠缺血再灌注后0～63 h時(shí)其神經(jīng)功能損傷最為嚴(yán)重，伴隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸能得到輕微緩解和改善，再灌注24 h后神經(jīng)功能明顯好轉(zhuǎn)，之后再次出現(xiàn)加重的趨勢(shì).研究發(fā)現(xiàn)：再灌注后神經(jīng)元會(huì)出現(xiàn)凋亡，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞集中在灌注后病灶中心的邊緣區(qū)域以及皮層區(qū).結(jié)論 線栓法制備動(dòng)物腦組織缺血灌注模型能有效用于腦組織缺血再灌注后的臨床分析，局灶區(qū)的神經(jīng)元以凋亡、壞死為主，其中輕度腦缺血主要以神經(jīng)凋亡為主，中重度缺血主要以壞死為主.

關(guān)鍵詞：再灌注損傷；局灶性腦缺血；神經(jīng)細(xì)胞凋亡；神經(jīng)功能

【引用格式】姜立剛，李雪，李海平，等.局灶性腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞凋亡的研究[J].北華大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2016，17(2)：205-208.

為探討局灶性腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況，本研究選用自制局灶性大鼠腦缺血再灌注模型，觀察大鼠腦組織不同時(shí)間病理學(xué)改變和神經(jīng)功能評(píng)分的關(guān)系，并分別應(yīng)用TUNEL法和電鏡觀察大鼠缺血灌注損傷后神經(jīng)元凋亡情況和細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化.

1資料與方法

1.1動(dòng)物資料及分組

選取Wistatr成年健康大鼠66只，均為雄性，體質(zhì)量252～282 g.隨機(jī)分為3組，對(duì)照組(假手術(shù)組，n=6)；觀察1組(腦缺血組，n=24)，依據(jù)腦缺血時(shí)間點(diǎn)不同，缺血后0.5，1，2，4 h各6只；觀察2組(腦缺血再灌注組，n=36)，依據(jù)再灌注時(shí)間點(diǎn)不同，再灌注0.5，3，6，12，24，48 h各6只.

1.2模型制備和手術(shù)操作

根據(jù)ZeaLonga線栓法制備MCA(大腦中動(dòng)脈)阻塞模型，改進(jìn)后制備大鼠局灶性缺血后再灌注模型.采用濃度為10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，300 mg/kg，取仰臥位固定，除毛消毒后，選頸部正中作切口，并暴露分離CCA，ICA(頸內(nèi)動(dòng)脈)、ECA(頸外動(dòng)脈)、PPA(翼腭突動(dòng)脈)，術(shù)中盡量避免刺激迷走神經(jīng).用血管夾關(guān)閉ECA遠(yuǎn)端和CCA近端，于ECA遠(yuǎn)端開(kāi)口，用肝素浸泡單絲尼龍線，浸泡后插入開(kāi)口處并加熱圓鈍，避免對(duì)血管內(nèi)膜造成損傷.模型栓線經(jīng)ICA進(jìn)入顱部，插入約18～21 mm，遇阻后退出0.5 mm，至前動(dòng)脈近端，完全阻斷中動(dòng)脈大腦血供.去除血管夾恢復(fù)血供，并固定栓線.根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求抽出栓線，觀察不同時(shí)間點(diǎn)的缺血情況，制造出再灌注模型.術(shù)中室溫25 ℃左右，對(duì)照組操作同上，但栓線不插入.

1.3模型成功判定

手術(shù)順利，操作無(wú)誤；大鼠清醒后左側(cè)表現(xiàn)出Hprner征，右側(cè)上肢表現(xiàn)偏癱則顯示為手術(shù)成功[1-2].

1.4神經(jīng)功能評(píng)分

根據(jù)2001年Harrison六級(jí)神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估[3-5]：未出現(xiàn)神經(jīng)功能異常為0分;大鼠右前抓無(wú)法完全伸直為1分;被推時(shí)大鼠抵抗力減少或右抓無(wú)法完全抓緊為2分;自發(fā)行走或轉(zhuǎn)圈時(shí)偏向一側(cè)為3分;僅受刺激時(shí)行走為4分;意識(shí)下降、無(wú)法自發(fā)行走為5分;意識(shí)喪失、出血量過(guò)多、術(shù)后1 h呼吸困難、無(wú)神經(jīng)損傷癥狀者均需補(bǔ)充目標(biāo)大鼠.

1.5標(biāo)本制備

1)HE染色標(biāo)本：根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組要求在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)灌注后注射濃度為10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉處理，暴露心臟，快速灌洗，再用濃度為4%的多聚甲醛PBS緩沖液灌注約30 min，切開(kāi)腦組織，選取位于視交叉區(qū)域0.5 mm左右處組織，在固定液中保存24 h，制切片，切片厚度約為5 μm，并保存在4 ℃冷庫(kù)中備用.2)電鏡檢測(cè)所需標(biāo)本制備：選取缺血側(cè)大鼠海馬區(qū)組織1 mm×1 mm切塊，用戊二醛(2.5%)固定后，給予脫水包埋處理，最后應(yīng)用電鏡進(jìn)行觀察分析.3)TUNEL法：使用TUNEL檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格按照其檢測(cè)步驟操作，其中的黃色顆粒判定為陽(yáng)性.

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)

左側(cè)缺血神經(jīng)損傷表現(xiàn)：臨床主要癥狀是右上肢出現(xiàn)偏癱，同側(cè)出現(xiàn)Hprner征(+).大鼠右前抓無(wú)法完全伸直，右抓無(wú)法完全抓緊，自行運(yùn)動(dòng)時(shí)偏向于右側(cè)，嚴(yán)重者行走能力和意識(shí)喪失.再灌注發(fā)生6 h內(nèi)大鼠神經(jīng)損傷最為嚴(yán)重，伴隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸得到輕微緩解和改善，再灌注24 h后神經(jīng)功能明顯好轉(zhuǎn)，之后再次出現(xiàn)加重的趨勢(shì).由表1可知：各組間神經(jīng)功能缺損情況通過(guò)秩和檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說(shuō)明再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能評(píng)分差異不明顯.

表1　大鼠局灶性缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損評(píng)分

2.2病理學(xué)改變

2.2.1肉眼下觀察

對(duì)照組腦組織無(wú)明顯變化，色澤形態(tài)正常；觀察1組、2組腦組織表現(xiàn)為蒼白腫脹.

2.2.2HE染色鏡下觀察

對(duì)照組腦組織膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元及其組織毛細(xì)血管等形態(tài)結(jié)構(gòu)均無(wú)明顯變化，細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整、清晰可見(jiàn).在局灶性缺血周圍區(qū)域可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核染色較深，褶皺收縮，呈三角形，且細(xì)胞中染色細(xì)胞質(zhì)具有強(qiáng)烈嗜酸性.而在局灶中心區(qū)域，胞膜破裂，細(xì)胞核褶皺收縮，核膜分散碎裂，且細(xì)胞中染色細(xì)胞質(zhì)表現(xiàn)為輕度嗜酸性，有部分局灶區(qū)域，細(xì)胞結(jié)構(gòu)直接消失，呈質(zhì)化改變.腦組織缺血灌注后缺血側(cè)部分區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞核結(jié)構(gòu)不清楚，染色顏色較淡，且細(xì)胞核數(shù)量較少，灶性細(xì)胞出現(xiàn)壞死(如溶解、腫脹等)特征，與缺血中心區(qū)域表現(xiàn)相似.紋狀體內(nèi)側(cè)區(qū)域及其腦組織額葉皮層區(qū)域細(xì)胞體積明顯減小，而染色質(zhì)則邊緣聚集、收縮，同時(shí)細(xì)胞核也固縮，與缺血外周區(qū)相似.再灌注后早期缺血中心區(qū)域染色較淡，神經(jīng)元輕度皺縮，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)清晰可辨.再灌注24 h后，缺血中心區(qū)域神經(jīng)元壞死凝固，細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)不清，細(xì)胞質(zhì)呈嗜酸性改變，染色顏色較深，細(xì)胞排列錯(cuò)亂，正常區(qū)與缺血區(qū)分界明顯，染色顏色較淡，白質(zhì)較為疏松，且伴有空泡.再灌注48 h后，缺血中心區(qū)域灶性細(xì)胞壞死凝固，伴有大量空泡形成，白質(zhì)變得更加疏松.

2.2.3透射電鏡下觀察

再灌注后神經(jīng)元主要表現(xiàn)為凋亡體征，在電鏡下顯示神經(jīng)元染色質(zhì)在灶區(qū)邊緣集中，在細(xì)胞核內(nèi)凝聚的染色質(zhì)形成質(zhì)環(huán)，呈現(xiàn)不規(guī)則形狀.質(zhì)環(huán)內(nèi)均勻分布細(xì)小顆粒狀物以及低電子密度的核質(zhì)，伴有透明空泡，胞質(zhì)收縮，而細(xì)胞質(zhì)中的線粒體結(jié)構(gòu)形態(tài)則無(wú)明顯變化.

2.2.4TUNEL法檢測(cè)結(jié)果

TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞核呈棕黃色，表現(xiàn)為陽(yáng)性，對(duì)照組的腦組織僅有很少一部分細(xì)胞凋亡，而觀察1組腦組織中心以及周圍區(qū)域均分布有凋亡細(xì)胞.TUNEL法檢測(cè)再灌注后6 h陽(yáng)性細(xì)胞才開(kāi)始分散，出現(xiàn)在局灶中心區(qū)域，12 h后集中出現(xiàn)在中心區(qū)的邊緣部分，呈簇狀，中心部分較少呈分散狀分布；而24 h后在壞死病灶的皮層和周邊區(qū)域陽(yáng)性細(xì)胞大量出現(xiàn).而半暗帶區(qū)細(xì)胞出現(xiàn)死亡的形式集中以凋亡為主.大鼠腦再灌注后不同時(shí)間段的TUNEL檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2.由表2可知：再灌注后3 h凋亡指數(shù)略高于對(duì)照組，但組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；再灌注后6 h凋亡指數(shù)顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且隨著灌注后時(shí)間的推移，凋亡指數(shù)不斷升高，差異不斷增加，TUNEL檢測(cè)陽(yáng)性率明顯升高，缺血再灌注后48 h凋亡指數(shù)明顯高于其他時(shí)間段指數(shù)情況，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).

表2　　　　大鼠腦缺血1 h再灌注不同時(shí)間段TUNEL檢

注：與對(duì)照組相比，*：P<0.05；與再灌注48 h后相比，#：P<0.05

3討論

目前，制備局灶性腦血?jiǎng)游锬Ｐ捅容^成熟的方法有自體血凝塊注入、MCA等，兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，能滿足不同的實(shí)驗(yàn)要求[6-7].采用線栓法阻斷血供建立動(dòng)物缺血再灌注模型具有術(shù)中創(chuàng)傷小、存活時(shí)間較長(zhǎng)、手術(shù)時(shí)長(zhǎng)較短、缺血位置恒定且無(wú)需開(kāi)顱手術(shù)等優(yōu)點(diǎn)，能準(zhǔn)確按照實(shí)驗(yàn)要求控制灌注、缺血的時(shí)間點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)中[8-10].

本研究中我們采用拴線法制備的動(dòng)物缺血再灌注模型，其梗死臨床表現(xiàn)與人類梗死接近，具有研究意義[11-13].通過(guò)分組研究可知：大鼠缺血再灌注后0～6 h時(shí)神經(jīng)功能缺損情況最為嚴(yán)重，隨著時(shí)間的推移逐漸緩解改善，24 h后明顯好轉(zhuǎn)，隨后再次加重.說(shuō)明缺血再灌注可能會(huì)引發(fā)繼發(fā)性腦損傷.在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，再灌注后神經(jīng)元會(huì)表現(xiàn)為凋亡，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞集中在灌注后病灶中心的邊緣區(qū)域以及皮層區(qū).在動(dòng)物模型研究[14-15]中指出：局灶區(qū)部分神經(jīng)元死亡，組織學(xué)表現(xiàn)為染色質(zhì)分裂破碎或固聚，DNA裂解，膜結(jié)構(gòu)完整，且顯示為陽(yáng)性.在缺血早期，輕度損傷半暗帶區(qū)檢出細(xì)胞凋亡，證實(shí)了局灶區(qū)神經(jīng)元以凋亡、壞死為主，而輕度缺血以凋亡為主，神經(jīng)元凋亡后仍具有組織學(xué)體征，但部分組織被破壞或出現(xiàn)空泡、腫脹.

通過(guò)TUNEL檢測(cè)顯示：再灌注后6 h凋亡指數(shù)顯著高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；且隨著灌注后時(shí)間的推移，凋亡指數(shù)不斷升高，差異不斷增加.TUNEL法檢測(cè)陽(yáng)性率明顯升高，提示局灶性腦缺血再灌注能有效抑制神經(jīng)元凋亡.

綜上所述，線栓法制備動(dòng)物腦組織缺血灌注模型能有效用于腦組織缺血再灌注后的臨床分析，局灶區(qū)神經(jīng)元以凋亡、壞死為主，其中輕度腦缺血主要以神經(jīng)凋亡為主，中重度缺血主要以壞死為主.

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【責(zé)任編輯：陳麗華】

Research on the Nerve Cell Apoptosis Induced byReperfusion in Rats with Focal Cerebral Ischemia

Jiang Ligang，Li Xue，Li Haiping，Li Wei

(AffiliatedHospitalofBeihuaUniversity，Jilin132011，China)

Abstract：Objective To research the nerve cell apoptosis induced by reperfusion injury in rats with focal cerebral ischemia and the pathological alteration of the brain tissue at different times in rats.Methods The selected 66 adult Wistar rats were randomly divided into three groups，the control group(sham-operation group，n=6),the observation group 1(cerebral ischemia group，n=24)，and the observation group 2(cerebral ischemia reperfusion group，n=36).The model rats with focal cerebral ischemia reperfusion were established by suture method.After operation and HE staining，the condition of neuritis apoptosis and the morphological changes of apoptosis were determined by TUNEL method and electron microscope.Results The most serious nerve function deficit appeared during 0～63 h after ischemia reperfusion in rats，which would slightly relived and improved along with the passage of time.The neurological function improved markedly after 24 h reperfusion，and then appeared the tendency of exacerbation.The research showed that nerve cells would appear apoptosis after reperfusion，the TUNEL positive cells were concentrated at the marginal area and tegument region after reperfusion.Conclusion The model rats established by suture method are effective for the clinical analysis on cerebral ischemia reperfusion.The major death ways of the nerve cells in focus are apoptosis and necrosis，the primary cause of mild cerebral ischemia is nerve apoptosis，and the primary cause of moderately severe cerebral ischemia is necrosis.

Key words：reperfusion injury；focal cerebral ischemia；nerve cell apoptosis；neurological function

中圖分類號(hào)：R743.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

作者簡(jiǎn)介：姜立剛(1978-)，男，博士，副教授，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事腦血管病臨床研究，E-mail：beihua78726@163.com；通信作者：李威(1959-)，女，博士，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科學(xué)研究，E-mail：liwei1535@sina.com.

基金項(xiàng)目：吉林省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2013441)；吉林省衛(wèi)生廳基金項(xiàng)目(2012Z102).

收稿日期：2015-10-23

文章編號(hào)：1009-4822(2016)02-0205-04

DOI：10.11713/j.issn.1009-4822.2016.02.013