運(yùn)動(dòng)下調(diào)左心室β2-AR/β1-AR對(duì)MI大鼠心臟的保護(hù)效應(yīng)

陳婷，田振軍

（1.西藏民族大學(xué) 體育學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712082；2.陜西師范大學(xué) 運(yùn)動(dòng)生物學(xué)研究所 運(yùn)動(dòng)與心血管研究室，陜西 西安 710062）

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運(yùn)動(dòng)下調(diào)左心室β2-AR/β1-AR對(duì)MI大鼠心臟的保護(hù)效應(yīng)

陳婷1，2，田振軍224

（1.西藏民族大學(xué) 體育學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712082；2.陜西師范大學(xué) 運(yùn)動(dòng)生物學(xué)研究所 運(yùn)動(dòng)與心血管研究室，陜西 西安 710062）

摘 要：探討心臟β2-AR/β1-AR變化在運(yùn)動(dòng)減輕心梗后心肌纖維化中的作用。將雄性SD大鼠36只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(S)、心肌梗死組(MI)、心梗后有氧運(yùn)動(dòng)組(ME)，每組12只。MI組采用結(jié)扎心臟左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)法，建立MI模型。S組僅穿線而不結(jié)扎LAD，ME組在MI后1周進(jìn)行4周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。第1周適應(yīng)性訓(xùn)練(速度10 m/min，坡度0)，第2周運(yùn)動(dòng)速度15 m/min，坡度3%，第3周速度20 m/min，坡度3%，第4周速度25 m/min，坡度5%。運(yùn)動(dòng)總時(shí)間均為60 min，每周訓(xùn)練5 d，連續(xù)4周。訓(xùn)練結(jié)束后開(kāi)胸摘取心臟，免疫組化法檢測(cè)左心室β2-AR蛋白表達(dá)；熒光免疫組化法檢測(cè)左心室Nox4蛋白表達(dá)；Western Blot法檢測(cè)β1-AR，β2-AR及Nox4蛋白水平；DHE法檢測(cè)心肌超氧陰離子水平；Masson染色測(cè)定心肌膠原容積百分比(CVF)。結(jié)果：與S組比較，MI后可見(jiàn)心肌β2-AR、Nox4陽(yáng)性染色，大面積超氧陰離子紅色熒光及藍(lán)色心肌膠原纖維。MI后LV中β2-AR/β1-AR比例顯著上調(diào)(P<0.01)，心肌Nox4蛋白表達(dá)、超氧陰離子水平、CVF值顯著增加(P<0.05、P<0.01、P<0.01)。與MI組比較，ME組可見(jiàn)心肌β2-AR、Nox4陽(yáng)性染色，而超氧陰離子紅色熒光及藍(lán)色膠原纖維明顯減少。運(yùn)動(dòng)后LV中β2-AR/β1-AR比例顯著下調(diào)(P<0.01)，心肌Nox4蛋白表達(dá)、超氧陰離子水平及CVF顯著降低(P<0.05、P<0.05、P<0.01)。且LV中β2-AR/β1-AR與心肌CVF呈顯著正相關(guān)(r=0.419，P<0.05)。結(jié)果表明：有氧運(yùn)動(dòng)可下調(diào)左心室β2-AR/β1-AR比例，抑制Nox4-ROS通路，減輕心梗大鼠心肌纖維化程度。運(yùn)動(dòng)對(duì)心梗后心肌纖維化的抑制和β2-AR/β1-AR比例降低有關(guān)。

關(guān) 鍵 詞：運(yùn)動(dòng)生理學(xué)；心臟β腎上腺素能受體；心肌纖維化；心肌超氧陰離子水平；有氧運(yùn)動(dòng)；心肌梗死；大鼠

心臟β腎上腺素能受體(β-AR)調(diào)節(jié)紊亂在心肌梗死(MI)后心功能惡化中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MI后交感神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)激活，導(dǎo)致心肌β1-AR表達(dá)下調(diào)[1]，相應(yīng)β2-AR 在β-AR中所占比例增高，且β1-AR和β2-AR脫敏、脫偶聯(lián)[2]，使得β1-AR和β2-AR的正性肌力作用受損。其中β2-AR比例的增高與激活[3]，與惡性心律失常風(fēng)險(xiǎn)性的增加呈正相關(guān)[2，4]。文獻(xiàn)梳理發(fā)現(xiàn)，在病理心臟中，β2-AR參與心肌纖維化[5]、心臟氧化應(yīng)激[5]、病理性左心室(LV)重塑過(guò)程[4，6]。心臟β2-AR過(guò)表達(dá)(100倍和350倍)可導(dǎo)致心肌纖維化[7]。而其機(jī)制與心肌NADPH氧化酶Nox2、Nox4上調(diào)，ROS水平增加，P38MAPK信號(hào)通路激活關(guān)系密切[5]。β2-AR激活可造成病理性心室重塑的惡性循環(huán)[7，8]?；诖?，研究假設(shè)采用手段下調(diào)β2-AR比例的激活，可能對(duì)MI后心肌纖維化有著改善效果。

近年來(lái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)改善MI疾病的研究備受關(guān)注[9-10]。運(yùn)動(dòng)鍛煉可減輕心肌纖維化程度，提升MI心臟功能[11-12]，此觀點(diǎn)已被廣泛證實(shí)[13]。而在運(yùn)動(dòng)減輕MI后心肌纖維化中，β2-AR激活是否發(fā)揮作用，其研究報(bào)道少見(jiàn)。以往研究表明，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可增加病理心臟β1-AR蛋白表達(dá)(48%)及mRNA水平[11]，降低β2-AR應(yīng)答性[4，14]。本研究前期成果發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)可恢復(fù)MI后心臟β2-AR/β1-AR均衡性[15]。而運(yùn)動(dòng)后β2-AR的變化，而對(duì)梗死心臟形態(tài)及功能上的影響并未深入探討。因此本研究采用4周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)方式，探討其對(duì)MI后LV中β2-AR/β1-AR、Nox4-ROS通路，及對(duì)MI大鼠心肌纖維化的影響，旨在闡明心臟β2-AR/β1-AR變化在運(yùn)動(dòng)減輕MI后膠原過(guò)度增生中的作用，為運(yùn)動(dòng)改善MI疾病，探索安全有效治療預(yù)防MI的運(yùn)動(dòng)康復(fù)方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

主要儀器：奧林巴斯光學(xué)顯微鏡、尼康熒光顯微鏡、凝膠成像儀等。主要試劑DHE超氧化物熒光探針購(gòu)于碧云天公司，兔抗大鼠多克隆抗體β2-AR、Nox4購(gòu)于GeneTex公司；抗體β1-AR購(gòu)于Cell Signaling Technology公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

3月齡雄性Sprague Dawley大鼠36只，體重185～215 g，購(gòu)于由西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：陜醫(yī)動(dòng)證字08-004號(hào))。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(S)、心肌梗死組(MI)、心梗+有氧運(yùn)動(dòng)組(ME)，每組12只。大鼠采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物干燥飼料喂養(yǎng)，自由飲食，動(dòng)物室內(nèi)溫度18～25 ℃，濕度50%～60%。MI組采用左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)結(jié)扎法，建立MI模型；S組大鼠實(shí)施假手術(shù)；ME組進(jìn)行4周的小動(dòng)物跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。

1.3 心梗模型制備

大鼠采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%戊巴比妥鈉腹腔麻醉(30 mg/kg)，用小動(dòng)物呼吸機(jī)連接自制面罩輔助呼吸，參數(shù)調(diào)至呼吸頻率為65次/min，吸呼比為2∶1，潮氣量為10 mL。開(kāi)胸暴露心臟，于肺動(dòng)脈圓錐左緣和左心耳根部交界下2 mm處結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支(LAD)，結(jié)扎后肉眼可見(jiàn)結(jié)扎遠(yuǎn)端心肌顏色逐漸變淺或變白，主要局限在LV，靠近心尖部最為明顯。多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄大鼠心電圖，監(jiān)測(cè)評(píng)價(jià)MI模型，大鼠MI后心電圖出現(xiàn)S-T段抬高或T波倒置現(xiàn)象，可斷定MI造模成功。之后逐層縫合關(guān)胸。S組大鼠僅穿線而不結(jié)扎LAD。ME組大鼠在MI模型成功后1周開(kāi)始訓(xùn)練。

1.4 大鼠運(yùn)動(dòng)方案

有氧運(yùn)動(dòng)方案參照Patel KP等的研究進(jìn)行[16-17]。ME組大鼠在MI手術(shù)后1周進(jìn)行4周有氧遞增跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)。第1周適應(yīng)性訓(xùn)練，運(yùn)動(dòng)速度10 m/min，坡度0；第2周運(yùn)動(dòng)速度15 m/min，坡度3%；第3周運(yùn)動(dòng)速度20 m/min，坡度3%；第4周運(yùn)動(dòng)速度25 m/min，坡度5%。ME組運(yùn)動(dòng)時(shí)間均為60 min(運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為50%～80% VO2max)，每周訓(xùn)練5 d，連續(xù)訓(xùn)練4周。4周運(yùn)動(dòng)結(jié)束后次日，采用多導(dǎo)生理記錄儀記錄心電圖，數(shù)據(jù)采集完畢后，迅速開(kāi)胸摘取心臟，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 心臟樣品處理

隨機(jī)選取大鼠腹腔麻醉后，經(jīng)左心室-升主動(dòng)脈實(shí)施心臟灌流術(shù)(先灌注PBS，然后灌注質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%多聚甲醛)，取心臟置于多聚甲醛后固定，然后轉(zhuǎn)移到30%蔗糖溶液中浸泡脫水至組織沉底，之后用OCT包埋，制冰凍切片(厚15 μm)。另隨機(jī)取大鼠心臟，放于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%中性甲醛溶液固定后，經(jīng)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)石蠟切片(厚5 um)用于HE，Masson染色，免疫組化和免疫熒光實(shí)驗(yàn)。另取大鼠心臟置于液氮冷凍后，移至-80 ℃低溫冰箱保存，用于Western Blot實(shí)驗(yàn)。

1.6 免疫組化實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)按照SABC免疫組化染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。石蠟切片脫蠟至水，抗原修復(fù)后用山羊血清在濕盒中37 ℃封閉60 min。滴加一抗(兔抗大鼠多克隆抗體β2-AR，1∶60)，4 ℃過(guò)夜。之后滴加二抗(1∶250)。37 ℃濕盒中孵育60 min。之后孵育SABC復(fù)合物(37℃，40 min)，PBS清洗，DAB顯色，純水洗滌終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染、封片。設(shè)置陰性對(duì)照(PBS代替一抗)。

1.7 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

石蠟切片58 ℃預(yù)熱，脫蠟至水。抗原修復(fù)后用山羊血清在濕盒中37 ℃封閉60 min。滴加一抗(兔抗大鼠多克隆抗體Nox4，1∶100)，4 ℃過(guò)夜。室溫復(fù)溫30 min。之后滴加TRITC標(biāo)記二抗(1∶250)。37 ℃濕盒中孵育60 min。滴加DAPI避光孵育5 min，PBS沖洗，封片。設(shè)置陰性對(duì)照(PBS取代一抗)。采用熒光顯微鏡觀察，400倍鏡下拍照。

1.8 Western Blot實(shí)驗(yàn)

采用RIPA提取總蛋白，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。等量蛋白質(zhì)采用12%SDS聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)至NC膜上，麗春紅染膜，室溫封閉(3% BSA)50 min后，分別加入兔抗β1-AR(1∶1 000)、β2-AR(1∶500)、Nox4(1∶800)多克隆抗體，4 ℃過(guò)夜，之后加入二抗(Jackson，1∶8 000)孵育50 min，洗膜后用ECL進(jìn)行發(fā)光顯跡。計(jì)算目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶的積分光密度(Integral Optical Density，IOD)，內(nèi)參為GAPDH。

1.9 DHE染色

DHE染色用于檢測(cè)心肌超氧陰離子水平。取冰凍切片，將超氧化物熒光探針DHE負(fù)載于切片上，避光孵育20 min，熒光探針DHE在超氧化物生成處被氧化為溴化乙錠，與DNA結(jié)合后，激發(fā)出紅色熒光。用熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.10 數(shù)據(jù)采集與統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果膠片用Image Quant TLv2005軟件分析處理，組織切片經(jīng)光鏡觀察，用Image Pro-plus 6.0軟件進(jìn)行測(cè)量分析。所得數(shù)據(jù)用GraghPad Prism 5.0軟件轉(zhuǎn)換作圖。所有數(shù)據(jù)均運(yùn)用SPSS 17.0軟件包進(jìn)行處理，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。采用單因素方差分析進(jìn)行顯著性差異分析。P＜0.01為差異極顯著，P＜0.05為差異顯著。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1 左心室β1-AR及β2-AR表達(dá)的觀察結(jié)果

β2-AR免疫組化結(jié)果顯示，S、MI、ME組LV中均可見(jiàn)β2-AR陽(yáng)性染色，呈棕黃色，主要位于心肌細(xì)胞膜。Western Blot結(jié)果顯示，LV中β2-AR蛋白表達(dá)在S、MI、ME組均無(wú)顯著差異(見(jiàn)圖1、圖2)。

圖1 大鼠心肌β2-AR免疫熒光染色結(jié)果(×400)

圖2 大鼠心肌β1-AR及β2-AR Western Blot結(jié)果

β1-AR的Western Blot結(jié)果顯示，與S組相比，MI組LV中β1-AR蛋白表達(dá)顯著減少(P＜0.05)。與MI組相比，ME組β1-AR蛋白表達(dá)顯著增高(P＜0.05)(見(jiàn)圖2)。而MI后LV中β2-AR/β1-AR比例較S組顯著上調(diào)(均P＜0.01)。ME組β2-AR/β1-AR比例較MI組顯著下調(diào)(P＜0.01)。

2.2 左心室Nox4表達(dá)的觀察結(jié)果

Nox4免疫熒光結(jié)果顯示，S組LV中Nox4陽(yáng)性染色較少。MI組、ME組均可見(jiàn)Nox4陽(yáng)性染色，呈亮紅色，分布于縱行心肌纖維胞漿，位于藍(lán)色細(xì)胞核周圍(見(jiàn)圖3)。

圖3 大鼠心肌Nox4免疫熒光染色結(jié)果(×400)

Western Blot結(jié)果顯示，與S組相比，MI組LV中Nox4蛋白表達(dá)顯著增加(P＜0.05)；與MI組相比，ME組Nox4蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.05)(見(jiàn)圖4)。

圖4 大鼠心肌Nox4的Western Blot結(jié)果

2.3 左心室冰凍切片DHE染色結(jié)果

DHE染色結(jié)果顯示，LV中超氧陰離子呈紅色熒光，在細(xì)胞核表達(dá)。S組紅色熒光顆粒較少。與S組相比，MI組梗死區(qū)可見(jiàn)大量紅色熒光顆粒，密集分布(見(jiàn)圖5)。

圖5 大鼠心肌DHE染色圖(×200)

數(shù)據(jù)顯示MI組大鼠LV中超氧陰離子水平較S組顯著增加(P＜0.01)。而ME組梗死區(qū)紅色熒光顆粒較少，超氧陰離子水平較MI組顯著下降(P＜0.05)(見(jiàn)圖6)。

圖6 大鼠心肌DHE染色熒光光密度結(jié)果

2.4 HE染色觀察結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，S組大鼠心肌細(xì)胞排列緊密，結(jié)構(gòu)整齊。MI組大鼠梗死區(qū)心肌細(xì)胞大量壞死，心肌纖維排列紊亂，出現(xiàn)替代性纖維化，形成瘢痕組織。ME組大鼠梗死區(qū)部分心肌細(xì)胞斷裂，瘢痕組織中出現(xiàn)紅色心肌，纖維化程度降低(見(jiàn)圖7)。

圖7 大鼠心肌組織HE染色(×400)

2.5 Masson染色觀察結(jié)果

Masson染色結(jié)果顯示，S組大鼠紅色心肌纖維排列整齊，藍(lán)色膠原纖維少見(jiàn)。MI后心肌細(xì)胞壞死，心肌組織結(jié)構(gòu)紊亂，梗死區(qū)可見(jiàn)大面積藍(lán)色膠原纖維。ME組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)有一定程度改善，梗死區(qū)紅色心肌細(xì)胞與藍(lán)色膠原交互分布，膠原纖維明顯減少(見(jiàn)圖8)。

圖8 大鼠心肌組織Masson染色(×400)

膠原容積百分比(CVF)用于反映心肌間質(zhì)纖維化。數(shù)據(jù)顯示，與S組比較，MI后CVF((55.35±6.99)%，P＜0.01)較S組((5.71±3.88)%)顯著增加。與MI組比較，ME組CVF((32.7±3.55)%，P＜0.01)顯著降低(見(jiàn)圖9)，表明4周有氧運(yùn)動(dòng)可減輕MI后心肌纖維化程度。

圖9 大鼠心肌組織CVF結(jié)果

2.6 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，LV中β2-AR/β1-AR與心肌CVF具有中等程度相關(guān)(r=0.419)，有顯著性(P=0.047)，表明心臟β2-AR/β1-AR比例與心肌纖維化關(guān)系有關(guān)，有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)MI后心肌纖維化的減輕可能與β2-AR/β1-AR比例降低有關(guān)。

3 討論

3.1 心梗后運(yùn)動(dòng)干預(yù)可下調(diào)左心室β2-AR/β1-AR比例

β-AR是調(diào)節(jié)心臟功能強(qiáng)有力的生物靶標(biāo)。人類心臟中β1-AR/β2-AR比例為7:3[18]，其作為G蛋白偶聯(lián)受體超家族的一員，心臟β1-AR通過(guò)Gs-AC-cAMP-PKA通路引起心率加快、心肌收縮力增強(qiáng)及傳導(dǎo)速度加快。β2-AR可同時(shí)與Gs和Gi形成雙偶聯(lián)，發(fā)揮正性肌力和細(xì)胞保護(hù)兩方面的作用[19]。β-AR調(diào)節(jié)紊亂在MI后心功能惡化中發(fā)揮重要作用，研究發(fā)現(xiàn)MI后交感神經(jīng)系統(tǒng)持續(xù)激活，心肌β1-AR密度下調(diào)，導(dǎo)致cAMP產(chǎn)生減少，造成心臟收縮功能降低[1]。而β2-AR密度雖無(wú)明顯變化，但β2-AR所占比例相應(yīng)由17%升高到38%，使得MI后交感神經(jīng)激動(dòng)對(duì)β2-AR的依賴程度明顯升高[20]。而β2-AR比例的增加與激活[2]，與MI后惡性心律失常發(fā)生關(guān)系密切[3]。

長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可提高M(jìn)I后心臟交感神經(jīng)和迷走神經(jīng)均衡性，加強(qiáng)自主神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)功能[21]，并對(duì)心臟β-AR表型產(chǎn)生有益影響。以往研究表明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可增加病理心臟β1-AR蛋白表達(dá)(48%)及mRNA水平[11]，增加cAMP水平(36%)[11]，降低β2-AR應(yīng)答性[4，14]。BILLMAN等研究表明運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可恢復(fù)易患猝死犬β1-AR/β2-AR均衡性[4]，但該研究中并未檢測(cè)β1-AR和β2-AR蛋白表達(dá)及密度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MI后LV中β1-AR蛋白表達(dá)減少，β2-AR雖無(wú)顯著變化，但心肌β2-AR/β1-AR比例顯著上調(diào)，β2-AR所占比例的研究意義更大。而4周運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，心肌β1-AR表達(dá)增高，β2-AR無(wú)明顯變化，相應(yīng)ME組β2-AR/β1-AR比例降低，表明有氧運(yùn)動(dòng)可下調(diào)LV中β2-AR/β1-AR比例，恢復(fù)β-AR均衡性。這與本實(shí)驗(yàn)組前期研究結(jié)果一致[15]。而運(yùn)動(dòng)恢復(fù)受體均衡性的機(jī)制，以及MI后運(yùn)動(dòng)下調(diào)β2-AR/β1-AR，其對(duì)心臟形態(tài)及功能上的影響并未深入研究。而本研究重點(diǎn)從β2-AR與心肌纖維化的角度，探討運(yùn)動(dòng)對(duì)MI大鼠心臟的保護(hù)效應(yīng)。

3.2 運(yùn)動(dòng)后β2-AR/β1-AR降低與心梗后Nox4-ROS通路下調(diào)，心肌纖維化程度減輕有關(guān)

MI后心臟發(fā)生心室結(jié)構(gòu)和功能改變，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞壞死和凋亡、間質(zhì)纖維化、心肌細(xì)胞代償性肥大、心臟收縮功能下降等。研究發(fā)現(xiàn)MI后大量產(chǎn)生的ROS可促進(jìn)心肌間質(zhì)纖維化[22]。心肌NADPH氧化酶族(Nox)是心血管系統(tǒng)中ROS的主要來(lái)源之一，且Nox產(chǎn)生的ROS可激發(fā)其他來(lái)源ROS的生成[23]。研究發(fā)現(xiàn)，Nox敲除小鼠在MI后梗死面積減小，心肌纖維化得到改善[22]。而位于心肌細(xì)胞線粒體的Nox4是衰竭心臟氧化應(yīng)激產(chǎn)生的主要來(lái)源，Nox4敲除小鼠氧化應(yīng)激水平降低，心肌纖維化，細(xì)胞凋亡水平均顯著降低，心功能得到改善[24]。而心臟β-AR，作為G-蛋白偶聯(lián)受體，是MI后激活Nox的因素之一[25]。在病理心臟中，β2-AR激活參與心肌纖維化，心臟氧化應(yīng)激[5]，細(xì)胞凋亡[6]，病理性心臟重塑[4]，心律失常過(guò)程[2]。其中β2-AR與心肌纖維化關(guān)系密切。研究表明β2-AR過(guò)表達(dá)(60倍)可增強(qiáng)心臟收縮功能，不會(huì)惡化為心力衰竭。而β2-AR過(guò)表達(dá)(100倍和350倍)可造成心肌纖維化[7，26]。其機(jī)制與心肌Nox2，Nox4上調(diào)，ROS水平增加，P38MAPK信號(hào)通路有關(guān)激活[5]。β2-AR激活可導(dǎo)致病理性心室重塑的惡性循環(huán)[8]。因此本研究假設(shè)采用手段下調(diào)β2-AR比例的激活，可能對(duì)MI后心肌纖維化起到改善效果。

近年來(lái)運(yùn)動(dòng)干預(yù)改善MI疾病的研究備受關(guān)注。規(guī)律的運(yùn)動(dòng)鍛煉對(duì)于心室重構(gòu)改善，MI患者心功能提高、MI發(fā)病率降低均具有積極意義[27]。運(yùn)動(dòng)可減輕心肌纖維化程度，提升MI心臟功能，此觀點(diǎn)已得到廣泛證實(shí)[9-12]。本文主要關(guān)注心臟β2-AR在運(yùn)動(dòng)減輕MI后心肌纖維化中的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MI后LV中Nox4蛋白表達(dá)，超氧陰離子水平，心肌膠原纖維顯著增加。而四周運(yùn)動(dòng)干預(yù)后，LV中Nox4蛋白表達(dá)，超氧陰離子水平及心肌膠原纖維明顯減少。且心臟β2-AR/β1-AR比例與CVF呈顯著正相關(guān)。提示有氧運(yùn)動(dòng)可抑制心肌Nox4-ROS通路，減輕MI大鼠心肌纖維化程度。且運(yùn)動(dòng)對(duì)MI后心肌纖維化的抑制與β2-AR/β1-AR比例降低有關(guān)。但目前關(guān)于心臟β2-AR的研究存在爭(zhēng)議，β2-AR過(guò)度激活除發(fā)揮心臟毒性外，另有研究認(rèn)為其具備心肌保護(hù)作用[26]。在心肌細(xì)胞凋亡方面，β2-AR可偶聯(lián)Gi通過(guò)PI3K/Akt通路發(fā)揮抗凋亡作用[28]。而選擇性刺激β2-AR可激活cAMP/PKA/Akt/eNOS通路，增加NO生物利用率，降低心肌細(xì)胞死亡[6]。通過(guò)文獻(xiàn)梳理，筆者認(rèn)為心肌β2-AR的正性肌力及心臟毒性作用主要是通過(guò)偶聯(lián)Gs發(fā)揮的[29]，而β2-AR的抗心肌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞保護(hù)作用主要是與Gi偶聯(lián)所介導(dǎo)[28]。但運(yùn)動(dòng)后病理心臟中這兩方面作用之間的關(guān)系，平衡及機(jī)制研究還需要進(jìn)一步深入探討。

綜上所述，心梗后進(jìn)行4周有氧運(yùn)動(dòng)干預(yù)可下調(diào)左心室β2-AR/β1-AR比例，抑制Nox4-ROS通路，減輕心梗大鼠心肌纖維化程度。運(yùn)動(dòng)對(duì)心梗后膠原過(guò)度增生的抑制與β2-AR/β1-AR比例降低有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

[1]LEOSCO D，RENGO G，IACCARINO G，et al.Exercise promotes angiogenesis and improves beta-adrenergic receptor signalling in the post-ischaemic failing rat heart[J].Cardiovasc Res，2008，78(2)，385-394.

[2]BILLMAN G E，CASTILLO L C，HENSLEY J，et al.Beta2-adrenergic receptor antagonists protect against ventricular fibrillation：in vivo and in vitro evidence for enhanced sensitivity to beta2-adrenergic stimulation in animals susceptible to sudden death[J].Circulation，1997，96(6)，1914-1922.

[3]HOULE M S，ALTSCHULD R A，BILLMAN G E.Enhanced in vivo and in vitro contractile responses to beta(2)-adrenergic receptor stimulation in dogs susceptible to lethal arrhythmias[J].J Appl Physiol，2001，91(4)：1627-1637.

[4]BILLMAN G E，KUKIELKA M，KELLEY R，et al.Endurance exercise training attenuates cardiac beta2-adrenoceptor responsiveness and prevents ventricular fibrillation in animals susceptible to sudden death[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2006，290(6)：H2590-2599.

[5]DI LISA F，KALUDERCIC N，PAOLOCCI N.Beta(2)-Adrenoceptors，NADPH oxidase，ROS and p38 MAPK：another ‘radical’ road to heart failure?[J].Br J Pharmacol，2011，162(5)：1009-1011.

[6]BHUSHAN S，KONDO K，PREDMORE B L，et al.Selective beta2-adrenoreceptor stimulation attenuates myocardial cell death and preserves cardiac function after ischemia-reperfusion injury[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2012，32(8)：1865-1874.

[7]LIGGETT S B，TEPE N M，LORENZ J N，et al.Early and delayed consequences of beta(2)-adrenergic receptor overexpression in mouse hearts: critical role for expression level[J].Circulation，2000，101(14)：1707-1714.

[8]XU Q，DALIC A，F(xiàn)ANG L，et al.Myocardial oxidative stress contributes to transgenic beta(2)-adrenoceptor activation-induced cardiomyopathy and heart failure[J].Br J Pharmacol，2011，162(5)：1012-1028.

[9]BARBOSA V A，LUCIANO T F，VITTO M F，et al.Exercise training plays cardioprotection through the oxidative stress reduction in obese rats submitted to myocardial infarction[J].Int J Cardiol，2012，157(3)：422-424.

[10]BITO V，DE WAARD M C，BIESMANS L，et al.Early exercise training after myocardial infarction prevents contractile but not electrical remodelling or hypertrophy[J].Cardiovasc Res，2010，86(1)：72-81.

[11]DE WAARD M C，VAN DER VELDEN J，BITO V，et al.Early exercise training normalizes myofilament function and attenuates left ventricular pump dysfunction in mice with a large myocardial infarction[J].Circ Res，2007，100(7)：1079-1088.

[12]GIALLAURIA F，ACAMPA W，RICCI F，et al.Exercise training early after acute myocardial infarction reduces stress-induced hypoperfusion and improves left ventricular function[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging，2013，40(3)：315-324.

[13]MANN N，ROSENZWEIG A.Can exercise teach us how to treat heart disease?[J].Circulation，2012，126(22)：2625-2635.

[14]HOLYCROSS B J，KUKIELKA M.Exercise training normalizes beta-adrenoceptor expression in dogs susceptible to ventricular fibrillation[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293(5)：H2702-2709.

[15]CHEN T，CAI M X，LI Y Y，et al.Aerobic exercise inhibits sympathetic nerve sprouting and restores beta-adrenergic receptor balance in rats with myocardial infarction[J].PLoS One，2014，9(5)：e97810.

[16]ZHENG H，SHARMA N M，LIU X，et al.Exercise training normalizes enhanced sympathetic activation from the paraventricular nucleus in chronic heart failure：role of angiotensin II[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2012，303(4)：R387-394.

[17]ZHENG H，LI Y F，ZUCKER I H，et al.Exercise training improves renal excretory responses to acute volume expansion in rats with heart failure[J].Am J Physiol Renal Physiol 2006，291(6)：F1148-1156.

[18]LOHSE M J，ENGELHARDT S，ESCHENHAGEN T.What is the role of beta-adrenergic signaling in heart failure?[J].Circ Res，2003，93(10)：896-906.

[19]WRIGHT P T，NIKOLAEV V O，O'HARA T，et al.Caveolin-3 regulates compartmentation of cardiomyocyte beta2-adrenergic receptor-mediated cAMP signaling[J].J Mol Cell Cardiol，2014，67：38-48.

[20]BARTELS L A，CLIFTON G D，SZABO T S.Influence of myocardial ischemia and reperfusion on beta-adrenoceptor subtype expression[J].J Cardiovasc Pharmacol，1998，31(4)：484-487.

[21]RIBEIRO F，ALVES A J，TEIXEIRA M，et al.Exercise training enhances autonomic function after acute myocardial infarction: a randomized controlled study[J].Rev Port Cardiol，2012，31(2)：135-141.

[22]LOOI Y H，GRIEVE D J，SIVA A，et al.Involvement of Nox2 NADPH oxidase in adverse cardiac remodeling after myocardial infarction[J].Hypertension，2008，51(2)：319-325.

[23]TAKIMOTO E，KASS D A.Role of oxidative stress in cardiac hypertrophy and remodeling[J].Hypertension，2007，49(2)：241-248.

[24]KURODA J，AGO T，MATSUSHIMA S，et al.NADPH oxidase 4(Nox4)is a major source of oxidative stress in the failing heart[J].Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(35)：15565-15570.

[25]HEYMES C，BENDALL J K，RATAJCZAK P，et al.Increased myocardial NADPH oxidase activity in human heart failure[J].J Am Coll Cardiol，2003，41(12)：2164-2171.

[26]ZHAO M，F(xiàn)AJARDO G，URASHIMA T，et al.Cardiac pressure overload hypertrophy is differentially regulated by beta-adrenergic receptor subtypes[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2011，301(4)：H1461-1470.

[27]KRALJEVIC J，MARINOVIC J，PRAVDIC D，et al.Aerobic interval training attenuates remodelling and mitochondrial dysfunction in the post-infarction failing rat heart[J].Cardiovasc Res，2013，99(1)：55-64.

[28]CHESLEY A，LUNDBERG M S，ASAI T，et al.The beta(2)-adrenergic receptor delivers an antiapoptotic signal to cardiac myocytes through G(i)-dependent coupling to phosphatidylinositol 3’-kinase[J].Circ Res，2000，87(12)：1172-1179.

[29]STOCKIGT F，BRIXIUS K，LICKFETT L，et al.Total beta-adrenoceptor knockout slows conduction and reduces inducible arrhythmias in the mouse heart[J].PLoS One，2012，7(11)：e49203.

Effects of exercise down-regulating left ventricular β2-AR/β1-AR on protecting the hearts of MI rats

CHEN Ting1，2，TIAN Zhen-jun2
（1.School of Physical Education，Xizang Minzu University，Xianyang 712082，China；2.Exercise＆Cardiovascular Lab，Institute of Sports and Exercise Biology，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China)

Abstract:In order to probe into the roles of the changing of cardiac β2-AR/β1-AR in exercise alleviating myocardial fibrosis after myocardial infarction,the authors divided 36 male SD rats randomly into a sham surgery group(S),a myocardial infarction group(MI),and an aerobic exercise after myocardial infarction group(ME),each of which consisted of 12 rats,established a MI mode on the rats in group MI by means of ligation of the left anterior descending(LAD)coronary artery,stitched but not ligated the LAD of the rats in group S,let the rats in group ME exercise on a treadmill for 4 weeks,1 week after MI,according to the following plan: week 1: adaptive training(speed: 10m/min,gradient: 0%); week 2: speed: 15mmin,gradient: 3%; week 3: speed: 20m/min,gradient: 3%; week 4: speed: 25m/min,gradient: 5%; total exercise time: 60min,training: 5 days a week,4 weeks consecutively.After the training was finished,the authors opened thebook=119,ebook=124rats’ chest and took out their hearts,measured left ventricular β2-AR protein expression by means of immunohistochemistry,measured left ventricular Nox4 expression by means of fluorescent immunohistochemistry,measured β1-AR,β2-AR and Nox4 protein levels by means of Western Blot,measured myocardial superoxide anion level by means of DHE,measured myocardial collagen volume fraction(CVF)by means of Masson staining,and revealed the following findings: as compared with the rats in group S,the rats after MI could be seen having myocardial β2-AR and Nox4 positive staining,large areas of superoxide anion red fluorescence and blue myocardial collagen fibers; in LV after MI,the radio of β2-AR/β1-AR increased significantly(P<0.01),myocardial Nox4 protein expression,superoxide anion level and CVF value increased significantly(P<0.05,P<0.01,P<0.01); as compared with the rats in group MI,the rats in group ME could be seen having myocardial β2-AR and Nox4 positive staining,but significantly decreased superoxide anion red fluorescence and blue collagen fibers; in LV after exercise,the radio of β2-AR/β1-AR was down-regulated significantly(P<0.01),myocardial Nox4 protein expression,superoxide anion level and CVF value decreased significantly(P<0.05,P<0.05,P<0.01); and in LV,β2-AR/β1-AR was significantly positive correlative with myocardial CVF(r=0.419,P<0.05).The said findings indicate the followings: aerobic exercise can down-regulate the ratio of left ventricular β2-AR/β1-AR,restrain the pathway of Nox4-ROS,and alleviate the degree of myocardial fibrosis of rats with myocardial infarction; exercise is related to the restraint of myocardial fibrosis and the decrease of the ratio of β2-AR/β1-AR after myocardial infarction.

Key words:sports physiology；β2-AR/β1-AR；myocardial fibrosis；myocardial superoxide anion；aerobic exercise；myocardial infarction；rats

作者簡(jiǎn)介：陳婷(1984-)，女，講師，博士研究生，研究方向：運(yùn)動(dòng)生理學(xué)。E-mail：ctgw84@163.com 通訊作者：田振軍教授。

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81360297，31371199， 31171141); 陜西師范大學(xué)“211工程”運(yùn)動(dòng)生物學(xué)重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科項(xiàng)目(2012-11)。

收稿日期：2015-05-20

中圖分類號(hào)：G804.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1006-7116(2016)02-0118-08