磷脂酶D高產(chǎn)菌株的原生質(zhì)體紫外誘變選育

楊蘭蘭，張小里，封娟娟，朱南南，趙彬俠

(西北大學(xué)化工學(xué)院，陜西西安710069)

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磷脂酶D高產(chǎn)菌株的原生質(zhì)體紫外誘變選育

楊蘭蘭，張小里，封娟娟，朱南南，趙彬俠

(西北大學(xué)化工學(xué)院，陜西西安710069)

摘要：為了獲得磷脂酶D高產(chǎn)菌株，由鏈霉菌野生菌株LD0501出發(fā)研究原生質(zhì)體的制備和再生條件，建立原生質(zhì)體紫外誘變篩選方案。采用酶解法制備原生質(zhì)體，用紫外線對(duì)原生質(zhì)體誘變，TLC檢測(cè)突變株產(chǎn)磷脂酶D活力。原生質(zhì)體的適宜條件：種子培養(yǎng)基中甘氨酸質(zhì)量濃度5 g/L，菌齡72 h，用3 mg/mL的溶菌酶在30 ℃下酶解75 min。通過(guò)原生質(zhì)體誘變篩選，得到1株高產(chǎn)菌株，磷脂酶D水解活力達(dá)4.29 U/mL，提高幅度為180.4%。該方法有效改善了鏈霉菌野生菌株原生質(zhì)體的制備效果，紫外誘變篩選顯著提高了磷脂酶D的活力，高產(chǎn)突變株具有較好的穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：磷脂酶D；原生質(zhì)體；紫外誘變；篩選

磷脂酶D(phospholipase D，PLD)普遍存在于生物界中，是重要的細(xì)胞磷脂代謝酶，通過(guò)磷酸二酯鍵，催化水解卵磷脂(PC)產(chǎn)生磷脂酸(PA)和游離膽堿。PLD亦能在醇類物質(zhì)存在下催化磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)制備(合成)磷脂或稀有磷脂[1-2]。磷脂在食品工業(yè)中起到乳化、濕潤(rùn)和分散作用，在醫(yī)藥中是抗腫瘤藥物制劑的重要輔料。鏈霉菌屬微生物是常用磷脂酶D的生產(chǎn)菌株，但野生菌株酶活較低(<1.5 U/mL)，因此，通過(guò)篩選及改良獲得高產(chǎn)菌株是提高磷脂酶D活力的重要途徑。

目前，國(guó)外利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)PLD的研究報(bào)道較多，研究者通過(guò)野生菌株篩選、基因重組等方法篩選高產(chǎn)菌株，已經(jīng)取得了一定的效果[3]。與之相比，國(guó)內(nèi)研究磷脂酶D菌株選育的報(bào)道較少，文獻(xiàn)報(bào)道的磷脂酶D高產(chǎn)菌株酶活為3～3.5 U/mL[4]。筆者所在團(tuán)隊(duì)前期采用誘變劑處理孢子來(lái)選育磷脂酶D高產(chǎn)菌株，取得了一定效果[5]，但變異株穩(wěn)定性較差，酶活力亦有待進(jìn)一步提高。由于去除細(xì)胞壁的原生質(zhì)體對(duì)誘變劑更加敏感，較易發(fā)生突變，目前利用原生質(zhì)體誘變技術(shù)選育竹紅菌甲素[6]、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和檸檬酸[7]等高產(chǎn)菌株已有不少成功報(bào)道，但還沒(méi)有通過(guò)原生質(zhì)體誘變選育PLD優(yōu)良菌株的報(bào)道。本文中，筆者研究產(chǎn)磷脂酶D鏈霉菌株的原生質(zhì)體制備和再生，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行紫外誘變，改良菌株的產(chǎn)酶能力，以期篩選得到磷脂酶D的高產(chǎn)菌株，從而為磷脂酶D的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1出發(fā)菌株

磷脂酶 D 產(chǎn)生菌Streptomycessp. LD0501，保藏于筆者所在實(shí)驗(yàn)室。

1.2培養(yǎng)基、溶液和試劑

PDA培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基配制參照文獻(xiàn)[5]；微量元素溶液、TES緩沖液、P溶液、再生培養(yǎng)基配制參照文獻(xiàn)[8]。溶菌酶，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3原生質(zhì)體的制備與再生

1.3.1單孢子懸浮液的制備

從斜面刮取成熟的孢子到9 mL 無(wú)菌生理鹽水的試管中，用玻璃珠將其打碎，三層濾紙過(guò)濾，無(wú)菌生理鹽水調(diào)整孢子密度106～107個(gè)/mL。

1.3.2原生質(zhì)體的制備

用移液管移取 0.5 mL 的孢子懸浮液接種到含有一定量甘氨酸的20 mL菌絲體培養(yǎng)液體中，28 ℃、200 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h，4 000 r/min離心10 min，收集菌絲體，超聲30 min，菌絲體振蕩打碎，使其便于溶解。然后再用0.3 mol/L 的蔗糖溶液洗1次,P 溶液復(fù)洗2次。加入適量的溶菌酶，放入 30 ℃的水浴鍋中，每隔 7～8 min拿出來(lái)輕輕搖晃一下，60 min后，3 500 r/min離心10 min去除上層清液，最后500 r/min離心5 min保留上層清液，即得到原生質(zhì)體懸浮液。用 P 緩沖液調(diào)整原生質(zhì)體懸浮液到合適的濃度，接種到再生培養(yǎng)基；用無(wú)菌蒸餾水調(diào)整原生質(zhì)體懸浮液到合適濃度，接種到 PDA 培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)7 d，計(jì)數(shù)菌落。

1.4原生質(zhì)體的計(jì)數(shù)方法

原生質(zhì)體的計(jì)數(shù)按上述方法進(jìn)行，再按式(1)～(2)計(jì)算原生質(zhì)體的形成率與再生率。

(1)

(2)

式中：A為原生質(zhì)用 P 溶液稀釋后涂布于再生平板上存活的菌落數(shù)；B為原生質(zhì)體用無(wú)菌水稀釋后涂布于 PDA 平板上存活的菌落數(shù)；C為酶解前菌絲體涂布于PDA上長(zhǎng)出的菌落數(shù)。

1.5單孢子及原生質(zhì)體紫外誘變選育

將制備好的單孢子和原生質(zhì)體懸浮液各用無(wú)菌移液管吸約4 mL，分別滴到含有大頭針、直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中，置于15 W紫外燈下距離30 cm處均勻照射一定時(shí)間(0、15、30、45、60、90、120和150 s)，然后把照射過(guò)的菌懸液稀釋于無(wú)菌生理鹽水中，取合適濃度的0.1 mL 單孢子和原生質(zhì)體誘變菌分別滴到PDA培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基上并涂勻，每個(gè)濃度涂3套平板。將平板用黑塑料袋包嚴(yán)置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，然后再正常培養(yǎng) 3～7 d后計(jì)菌落數(shù)，統(tǒng)計(jì)其致死率。

1.6搖瓶初篩

挑選再生平板上生長(zhǎng)飽滿且水解圈較大的誘變菌落60株，每個(gè)菌落接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，28 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵7 d，離心收集發(fā)酵液，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行酶活力測(cè)定，每樣做3個(gè)平行，取均值。

1.7分析方法

磷脂酶D水解活力測(cè)定采用TLC方法，參照文獻(xiàn)[5]， 菌絲干質(zhì)量是用10 mL 發(fā)酵液，離心收集沉淀，110 ℃烘至恒質(zhì)量，稱量計(jì)算，每樣做3個(gè)平行，取均值。

2結(jié)果與討論

2.1原生質(zhì)體的制備與再生

2.1.1甘氨酸濃度對(duì)原生質(zhì)體形成量的影響

甘氨酸分子結(jié)構(gòu)與D-丙氨酸的結(jié)構(gòu)相似，因此在菌絲體培養(yǎng)液中加入甘氨酸可代替D-丙氨酸摻入到細(xì)胞壁，干擾細(xì)胞壁肽聚糖之間的交聯(lián)，引起新合成的細(xì)胞壁的不完整，有利于提高溶菌酶對(duì)鏈霉菌菌絲體細(xì)胞壁的敏感度。然而，甘氨酸濃度過(guò)高不僅會(huì)影響溶解菌絲體所需的數(shù)量，還會(huì)影響細(xì)胞壁的形成，使得原生質(zhì)體的再生細(xì)胞壁的條件受到一定程度的阻礙。為此，筆者在菌絲體培養(yǎng)基中分別加入不同質(zhì)量濃度的甘氨酸，測(cè)定原生質(zhì)體的密度和菌絲體生長(zhǎng)情況，結(jié)果如表1所示。

表1　甘氨酸添加量對(duì)原生質(zhì)體形成的影響

注：菌絲體的濕質(zhì)量以20 mL發(fā)酵液中的菌體質(zhì)量計(jì)。

圖1　　　菌齡、溶菌酶濃度、酶解時(shí)間、酶解溫度對(duì)原生質(zhì)體形成率和再生率的影響Fig.1　　　Effects of mycelium age,lysozyme concentration,enzymolysis time,enzymolysis temperature　　　on protoplast formation and regeneration

由表1可知：在甘氨酸質(zhì)量濃度低于5 g/L時(shí)，原生質(zhì)體的形成量隨著甘氨酸質(zhì)量濃度的增加不斷增加，但高于5 g/L時(shí)，原生質(zhì)體的形成量開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。甘氨酸濃度的持續(xù)增加，表現(xiàn)出對(duì)菌絲體生長(zhǎng)情況的抑制程度不斷加強(qiáng)。甘氨酸質(zhì)量濃度在5 g/L時(shí)，原生質(zhì)體的形成最佳。

2.1.2菌齡、溶菌酶解濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間原生質(zhì)體形成率和再生率的影響

鏈霉菌原生質(zhì)體是通過(guò)溶菌酶水解菌絲體細(xì)胞壁形成的，不同的鏈霉菌種屬性也不盡相同，還有溶菌酶自身的性質(zhì)也有差異，所以合適的菌齡和溶菌酶濃度對(duì)原生質(zhì)體的形成有至關(guān)重要的作用。不同種齡的菌絲生理活性不同，對(duì)溶菌酶的敏感度也有差異，一般處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌體利于原生質(zhì)體的制備和再生。研究了菌齡、溶菌酶濃度、酶解溫度、酶解時(shí)間原生質(zhì)體形成率和再生率的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1(a)可以看出：菌齡為72 h時(shí)，原生質(zhì)體的形成率和再生率達(dá)到最高。溶菌酶濃度太低，水解緩慢，會(huì)影響原生質(zhì)體的形成和再生，但溶菌酶濃度過(guò)高，酶解時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，就會(huì)導(dǎo)致脫壁現(xiàn)象太徹底，破壞了原生質(zhì)體再細(xì)胞壁所需的引物，雖然原生質(zhì)體的形成率會(huì)不斷增加，但嚴(yán)重影響了原生質(zhì)體的再生率。由圖1(b)和圖1(c)可以看出：溶菌酶濃度越大，酶解時(shí)間越長(zhǎng)，原生質(zhì)體形成率越大。兼顧原生質(zhì)體形成率和再生率，溶菌酶最佳質(zhì)量濃度為3 mg/mL，最適酶解時(shí)間為75 min。溫度對(duì)酶的活性有很大影響，在一定范圍內(nèi)，溫度升高，溶菌酶活性越好，原生質(zhì)體形成量也會(huì)增加，但溫度達(dá)到一定程度，會(huì)使溶菌酶的活性鈍化，原生質(zhì)體的形成量也會(huì)減少。由圖1(d)可以看出酶解溫度為30 ℃時(shí)，原生質(zhì)體的形成率和再生率效果最好，即30 ℃為最佳酶解溫度。

2.2單孢子和原生質(zhì)體的紫外劑量的確定

原生質(zhì)體沒(méi)有細(xì)胞壁的保護(hù)，應(yīng)該能更敏感接受紫外線的照射，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，同一紫外誘變下，原生質(zhì)體較單孢子有更強(qiáng)的紫外線耐受能力。 可能是由于原生質(zhì)體懸于含有黏性很大的P緩沖液中，原生質(zhì)體聚集成團(tuán)，所以致死需要更長(zhǎng)的誘變時(shí)間。研究了單孢子和原生質(zhì)體的紫外劑量，結(jié)果如圖2所示。

圖2　　　紫外線處理的誘變致死率Fig.2　　　Death rate of UV mutation

由圖2可知：?jiǎn)捂咦討乙汉驮|(zhì)體經(jīng)紫外照射后，隨照射時(shí)間的增加，致死率上升;0～30 s范圍內(nèi)，曲線急劇上升，致死率變化顯著，30 s以后，曲線上升趨于平緩。但原生質(zhì)體較單孢子紫外線耐受能力更強(qiáng)，單孢子隨誘變劑量的增加，致死率上升更迅速，單孢子在90 s時(shí)，致死率為100%，而原生質(zhì)體在120 s為100%。大量實(shí)驗(yàn)研究表明[9-10]，致死率為80%左右的正突變率相對(duì)較高，因此，采用45 s為最合適的誘變劑量。

2.3初篩和搖瓶復(fù)篩

經(jīng)過(guò)初篩得到6株高產(chǎn)突變株，接種于發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，設(shè)置3個(gè)搖瓶平行實(shí)驗(yàn)，在28 ℃、200 r/min條件下發(fā)酵7 d，測(cè)定其產(chǎn)酶能力，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3　　　突變株紫外誘變結(jié)果Fig.3　　　Enzyme activity of mutant strains　　　during fermentation

由圖3可知，經(jīng)過(guò)初篩選出的6株高產(chǎn)菌株有較高的酶活，其中編號(hào)32號(hào)仍是酶活最高的突變菌株，酶活力為4.29 U/mL。

2.4突變株的遺傳穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果

將編號(hào)32突變株連續(xù)搖瓶傳代5代，每代培養(yǎng)時(shí)間為7 d,測(cè)定每代的發(fā)酵液，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，該菌株傳代5代后，其相對(duì)酶活力為原菌株的97.2%，說(shuō)明該菌株有穩(wěn)定的遺傳特征。

表2　編號(hào)32菌株的遺傳穩(wěn)定性

2.5鏈霉菌PLD0501形態(tài)學(xué)特征

觀察原生質(zhì)體誘變后再生平板上的成熟菌落，同時(shí)觀察搖瓶發(fā)酵對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)菌絲體的生長(zhǎng)狀況，如表3所示。

表3　出發(fā)菌株和高產(chǎn)菌株菌落的形態(tài)

2.6高產(chǎn)菌株磷脂酶D的發(fā)酵特性

突變菌株和出發(fā)菌株隨時(shí)間變化的發(fā)酵性能如圖4所示。由圖4可知：鏈霉菌在發(fā)酵的進(jìn)程中，基本在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期才開(kāi)始有磷脂酶D出現(xiàn)，在穩(wěn)定期(第6天)時(shí)，磷脂酶D的水解活力達(dá)到最高，突變菌株的磷脂酶D水解活力(4.29 U/mL)大約是出發(fā)菌株水解活力(1.53 U/mL)的3倍，除此之外，突變菌株磷脂酶D水解活力的增長(zhǎng)速率(0.086 U/(mL·h))(在對(duì)數(shù)期初期，第3天)是出發(fā)菌株的(0.035 U/(mL·h))2.5倍。但在穩(wěn)定期之后磷脂酶D水解活力有下降的趨勢(shì)，可能是由于發(fā)酵液的酸堿度對(duì)酶蛋白質(zhì)活性的影響。

圖4　　　突變菌株及出發(fā)菌株磷脂酶D水解活力、　　　干菌體質(zhì)量隨時(shí)間變化關(guān)系Fig.4　　　Time courses of enzyme activity of phospholipase D　　　and dry cell weight of mutant strain　　　and the initial strain

在磷脂酶D發(fā)酵過(guò)程中，突變菌株較出發(fā)菌株的代謝速度快，由圖4可知，在前2 天，突變菌株菌絲干質(zhì)量的增加比出發(fā)菌株稍快，但在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)初期(第3天)，突變菌株的菌絲干質(zhì)量的增加速率(0.018 g/h)是出發(fā)菌株0.008 g/h)2.25倍，3～6 d是鏈霉菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，鏈霉菌菌絲干質(zhì)量在前6 d迅速積累,達(dá)到最大，突變菌株(0.835 g)是出發(fā)菌株(0.574 g)的1.45倍。生長(zhǎng)至6 d以后是穩(wěn)定期和衰亡期，并且菌絲體生長(zhǎng)基本處于停滯狀態(tài)。

3結(jié)論

原生質(zhì)體的制備的影響因素很多，本文選取了鏈霉菌原生質(zhì)體的制備和再生過(guò)程中幾個(gè)主要的影響因素：甘氨酸濃度、菌齡、酶解溫度、酶解時(shí)間、溶菌酶濃度進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)甘氨酸濃度 5 g/L，菌齡為72 h，酶解溫度30 ℃，酶解75 min，溶菌酶質(zhì)量濃度3 mg/mL時(shí)，原生質(zhì)體的形成率和再生率都比較合適，因此，以此條件為基礎(chǔ)進(jìn)行后續(xù)原生質(zhì)體的紫外誘變。

原生質(zhì)體沒(méi)有細(xì)胞壁的保護(hù)較單孢子懸液，對(duì)紫外線更敏感，能較好的改變菌株的遺傳性能。本文中，筆者利用原生質(zhì)體紫外誘變選育技術(shù)，得到一株磷脂酶D的水解活力為4.29 U/mL高產(chǎn)菌株，(較出發(fā)菌株(1.53 U/mL)提高大約3倍)。

原生質(zhì)體誘變技術(shù)大大提升了磷脂酶D的水解活力，但誘變后菌株遺傳性狀的改變是隨機(jī)性的，同時(shí)液體發(fā)酵篩選高產(chǎn)菌工作量很大，周期很長(zhǎng)。為了進(jìn)一步提高該菌的生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益，今后的研究中可以通過(guò)基因重組改良菌株的代謝途徑，加快生長(zhǎng)速度，也可以構(gòu)建高通量篩選方法縮短優(yōu)良菌株產(chǎn)磷脂酶D的發(fā)酵周期。

參考文獻(xiàn)：

[1]LIU Y,ZHANG T,QIAO J,et al.High-yield phosphatidylserine production via yeast surface display of phospholipase D fromStreptomyceschromofuscusonPichiapastoris[J].J Agric Food Chem,2014,62(23):5354-5360.

[2]HATANAKA T,NEGISHI T,KUBOTA-AKIZAWA M,et al.Purification,characterization,cloning and sequencing of phospholipase D fromStreptomycesseptatusTH-2[J].Enzyme Microb Technol,2002,31(3):233-241.

[3]Simkhada J R,Cho S S,Lee H J,et al.Purification and biochemical properties of phospholipase d(PLD57)produced byStreptomycessp.CS-57[J].Arch Pharma Res,2007,30(10):1302-1308.

[4]梁麗敏,劉春鳳,杜陽(yáng)吉.產(chǎn)磷脂酶D鏈霉菌發(fā)酵條件優(yōu)化[J].糧食與油脂,2015,28(2):55-58.

[5]劉嬡媛,張小里,姚娜,等.磷脂酶D的紫外誘變選育及發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].化工進(jìn)展,2012,31(9):2036-2038.

[6]潘魏松，嵇源源，楊珠英，等.原生質(zhì)體紫外誘變選育竹紅菌甲素高產(chǎn)菌株[J].生物加工過(guò)程,2012,10(6):18-23.

[7]徐凱，張偉國(guó).原生質(zhì)體融合選育耐高溫檸檬酸生產(chǎn)菌[J].生物加工過(guò)程,2015，13(5):26-30.

[8]諸葛健,王正詳.工業(yè)微生物實(shí)驗(yàn)技術(shù)手冊(cè)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,1994:460.

[9]段向東,賈嘯靜,陳麗華,等.原生質(zhì)體紫外誘變選育達(dá)托霉素高產(chǎn)菌株[J].化學(xué)與生物工程,2014,31(5):51-62.

[10]胡艷麗,鐘添華,產(chǎn)竹華,等.原生質(zhì)體紫外誘變選育可利用廉價(jià)碳源的高產(chǎn)油新菌株[J].微生物學(xué)通報(bào),2014,41(5):881-890.

(責(zé)任編輯荀志金)

Breeding of high phospholipase D-producing strain through mutation ofprotoplasts induced by UV radiation

YANG Lanlan,ZHANG Xiaoli,FENG Juanjuan,ZHU Nannan,ZHAO Binxia

(School of Chemical Engineering,Northwest University,Xi′an 710069,China)

Abstract：In order to screen a high-yielding phospholipase D strain from Streptomyces sp. LD0501,we studied the conditions for its protoplasts′ preparation and regeneration, and mutagenized its protoplasts by UV radiation as well. The protoplasts were prepared by enzyme and mutagenized with UV irradiation. The mutation result was determined by TLC. The optimum conditions for the preparation of the protoplasts were as follows：the Streptomyces LD0501 was inoculated into mycelia medium with 0.5% glycine and cultured for 72 h.The mycelia were processed with 3 mg/mL lysozyme at 30 ℃ for 75 min. Protoplasts of Streptomyces sp. LD0501 were induced by UV radiation to obtain a high phospholipase D-producing strain,whose phospholipase D′s enzyme activity reached 4.29 U/mL, increased by 180.4% compared with the initial strain. The method improved the preparation effect of protoplasts from Streptomyces LD 0501 effectively and enhanced phospholipase D strain′s vitality greatly by UV irradiation of the protoplasts,the production of the high-yielding mutant strain was verified to be genetically stable.

Keywords：phospholipase D;protoplast;UV mutagenesis;screening

中圖分類號(hào)：Q93

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1672-3678(2016)02-0022-05

作者簡(jiǎn)介：楊蘭蘭(1990—)，女，陜西榆林人，研究方向：微生物發(fā)酵；張小里(聯(lián)系人)，教授，E-mail:xlzhang@nwu.edu.cn

基金項(xiàng)目：陜西省自然科學(xué)基礎(chǔ)研究計(jì)劃(2014JM2057)

收稿日期：2015-12-07

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2016.02.005