冷卻豬肉陰性樣品中氣單胞菌概率分布的影響與優(yōu)選

董慶利，宋筱瑜，丁　甜，劉　箐

(1. 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093； 2. 國家食品安全風(fēng)險評估中心，北京100021；

3. 浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058)

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冷卻豬肉陰性樣品中氣單胞菌概率分布的影響與優(yōu)選

董慶利1，宋筱瑜2，丁甜3，劉箐1

(1. 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海200093； 2. 國家食品安全風(fēng)險評估中心，北京100021；

3. 浙江大學(xué) 生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州310058)

摘要：探討不同陰性樣品中致病菌污染水平對定量風(fēng)險評估結(jié)果的影響。以冷卻豬肉中氣單胞菌定量暴露評估為例，設(shè)定陰性樣品中致病菌為零值和最大值(檢測限)2種極端場景，由此預(yù)測冷卻豬肉中因氣單胞菌導(dǎo)致食物中毒的概率分別為33.6%和69.3%，顯著高于根據(jù)Jarvis經(jīng)典公式模擬陰性樣品的結(jié)果(22.1%，P<0.01)。同時，應(yīng)用赤池信息量準(zhǔn)則(AIC)、貝葉斯信息準(zhǔn)則(BIC)和卡方檢驗(X2)等評價參數(shù)，對陰性樣品污染水平的不同連續(xù)型概率分布進行了比較，表明上述兩種極端場景下應(yīng)用指數(shù)分布最優(yōu)，AIC分別為-41.24和-135.62，低于邏輯、正態(tài)、三角、均勻分布等結(jié)果，但與離散型概率分布預(yù)測食物中毒概率的差異不顯著。建議今后的微生物定量風(fēng)險評估研究中，必須考慮陰性樣品中致病菌的存在，并應(yīng)選擇合適的概率分布用以描述陰性樣品中致病菌的污染水平。

關(guān)鍵詞：陰性樣品；氣單胞菌；概率分布；風(fēng)險評估

微生物定量風(fēng)險評估(quantitative m￣i￣c￣r￣o￣b￣i￣o￣l￣o￣g￣i￣c￣a￣l risk assessment,QMRA)可用于評估特定致病菌對人群健康(發(fā)病率或爆發(fā)率)的定量影響[1]。QMRA包括4個步驟：危害識別、危害特征描述、暴露評估和風(fēng)險特征描述。其中，暴露評估是微生物定量風(fēng)險評估的研究核心。在已完成的定量暴露評估研究中，冷卻豬肉中的氣單胞菌[2]、即食涼拌菜中的單增李斯特菌[3]和蒸煮米飯中的蠟樣芽胞桿菌[4]等樣品，受檢測方法所限，初始污染水平高于檢測限的樣品認(rèn)定為陽性樣品，如冷卻豬肉中氣單胞菌為0.78 lg(CFU/g)；相應(yīng)地，低于此檢測限的認(rèn)定為陰性樣品。為使QMRA研究中的致病菌初始污染水平更能接近實際，研究中常假定陰性樣品的污染水平分布以Jarvis的經(jīng)典公式推測，并用反向偏斜累積均勻分布(Uniform)描述陰性樣品中的致病菌濃度[2-4]。但這種方法和致病菌的實際分布有較大差距，如冷卻豬肉中氣單胞菌的陰性結(jié)果得到最小值、平均值和最大值分別為-5.22、-2.22和0.78 lg(CFU/g)[2]，意為低于檢測限的陰性樣品中致病菌實際數(shù)量出現(xiàn)概率一致，這與一般微生物在食品中隨機分布的常識不符，因此得到的暴露評估結(jié)果可靠性有待商榷。

提高QMRA評估結(jié)果可靠性的最根本方法之一是提高微生物檢測方法的精度，由此得到致病菌的真實分布，作為評估的輸入值，得到風(fēng)險評估結(jié)果為風(fēng)險管理和交流提供理論基礎(chǔ)[5]。另外，在現(xiàn)有研究水平上，不同陰性樣品分布的假設(shè)，必定對QMRA的結(jié)果產(chǎn)生較大影響，量化這種影響有待于明確。

本研究中，筆者以冷卻豬肉中氣單胞菌定量評估為例[2]，首先分析不同陰性樣品污染水平的假設(shè)(包括為零值和檢測限值2種極端場景)對定量暴露評估結(jié)果的影響，特別是導(dǎo)致不同的食物中毒概率比較；分析不同陰性樣品污染水平應(yīng)用不同連續(xù)型概率分布(貝塔、指數(shù)、伽馬、邏輯和正態(tài)等)的差異，并通過不同評價參數(shù)比較確定最優(yōu)分布，進而比較離散型和連續(xù)型概率分布對致病菌最終污染水平的差異，由此為今后微生物風(fēng)險評估研究考慮陰性樣品的定量影響提供理論參考。

1數(shù)據(jù)來源與分析方法

1.1數(shù)據(jù)來源

本研究引用氣單胞菌的相關(guān)數(shù)據(jù)來源于文獻[2]中的定量暴露評估，為某市2009—2010 年以隨機抽樣的方式從超市中采集冷卻豬肉共計100份樣品，按國標(biāo)法進行檢測后的結(jié)果，近似認(rèn)為是冷卻豬肉中氣單胞菌的初始污染量。

1.2場景設(shè)定及概率分布模擬

設(shè)定以下5種場景，分別描述如下。

場景1(S1)：冷卻豬肉中陰性樣品(Ln)的氣單胞菌以Jarvis公式分布，即符合累計概率分布Cumulative (-5.22,0.78,{-5.22,-2.22,0.78},{0.01,0.50,0.99})，陽性樣品(Lp)分布代表的污染率(Pp)同文獻[2]，冷卻豬肉的初始污染水平仍按綜合陽性和陰性樣品的離散概率分布Discrete (Lp:Ln,Pp:(1-Pp))設(shè)定。

場景2(S2)：冷卻豬肉中全部陰性樣品的氣單胞菌設(shè)定為0，初始污染不分陽性和陰性，按離散概率分布Discrete (0,4,{0,0.78,1.00,1.33,1.60,1.85,2.33,2.41,2.48,2.59,2.71,3.26,3.36},{0.86,0.01,0.02,0.01,0.01,0.01,0.02,0.01,0.01,0.01,0.01,0.01,0.01})設(shè)定。此場景假設(shè)低于檢測限的陰性樣品中實際沒有致病菌的極端情況。

場景3(S3)：冷卻豬肉中全部陰性樣品的氣單胞菌污染水平設(shè)定為0.78 lg(CFU/g)，即最大值或檢測限值，初始污染不分陽性和陰性，按離散概率分布Discrete (0,4,{0.78,1.00,1.33,1.60,1.85,2.33,2.41,2.48,2.59,2.71,3.26,3.36},{0.87,0.02,0.01,0.01,0.01,0.02,0.01,0.01,0.01,0.01,0.01,0.01})設(shè)定。此場景假設(shè)低于檢測限的陰性樣品中實際全部在檢測限值的極端情況。

場景4(S4)：對S2按常見的連續(xù)型概率分布函數(shù)分別擬合，如表1所示。

場景5(S5)：對S3按常見的連續(xù)型概率分布函數(shù)分別擬合，如表1所示。

進而采用蒙特卡羅(Monte Carlo)模擬方法，運用@RISK 6.0風(fēng)險評估軟件(美國Palisade公司)對上述不同場景的設(shè)定參數(shù)進行模擬分析，迭代10 000次后比較不同氣單胞菌最終污染水平對應(yīng)的累積概率。以氣單胞菌5 lg(CFU/g)為導(dǎo)致食物中毒的風(fēng)險閾值[2]，計算S1、S2和S3場景對應(yīng)的超過風(fēng)險閾值的概率。

表1　常用連續(xù)概率分布函數(shù)表達式

1.3概率分布的評價參數(shù)

應(yīng)用@RISK軟件中RiskFit 函數(shù)對S4和S5場景按常見概率分布分別擬合，選擇3個評價參數(shù)如下[5-6]：

赤池信息量準(zhǔn)則AIC=2k1-2lnL

(1)

貝葉斯信息準(zhǔn)則BIC=k2lnn-2lnL

(2)

式中：L是似然函數(shù)，k1和k2分別是擬合的估計參數(shù)數(shù)量，n是樣本數(shù)。

(3)

式中：k為將x軸分成數(shù)據(jù)段的個數(shù)，Ni為第i個數(shù)據(jù)段中觀測的樣本數(shù)，Ei為第i個數(shù)據(jù)段中期望的樣本數(shù)。

2結(jié)果與討論

2.1不同場景的陰性樣品污染水平的概率模擬

對設(shè)定的3種場景S1、S2和S3分別通過@RISK軟件模擬分析，求得最終的氣單胞菌菌數(shù)的累積概率分布，結(jié)果如圖1所示。由計算得知，S1、S2和S3場景下超過5 lg(CFU/g)的概率分別為22.1%、33.6%和69.3%，三者之間差異顯著(P<0.01)。圖1表明設(shè)定的陰性樣品中氣單胞菌值越高，越接近檢測限(如S3將所有陰性樣品設(shè)定為0.78 lg(CFU/g))，估計的超過風(fēng)險閾值的概率越高，導(dǎo)致食物中毒的可能性越高，這與預(yù)想一致。

圖1　　　陰性樣品污染水平對氣單胞菌定量　　　暴露評估的影響Fig.1　　　Effects of pathogen distribution in negative sample　　　on the quantitative exposure assessment of　　　Aeromonas spp.

2.2不同陰性樣品概率分布的評價比較

對設(shè)定的2種場景S4和S5按照常見的連續(xù)型概率分布函數(shù)分別擬合，并通過計算AIC、BIC和X2等參數(shù)進行評價，結(jié)果如表2 所示。其中Beta、Gamma和Pert分布無法收斂，未列在表2中。

從表2可知：對同一場景，AIC和BIC的結(jié)果非常相近，兩者的理論基礎(chǔ)均依賴于貝葉斯分析，是從貝葉斯先驗概率的不同假設(shè)得出的2種不同形式，如式(1)和(2)所示。AIC和BIC都屬于“信息標(biāo)準(zhǔn)”檢驗，專門設(shè)計用于模型選擇。AIC和BIC實際值并非代表特定擬合的絕對優(yōu)度，所以只有比較才有意義[7]。而X2檢驗在評價方面應(yīng)用廣泛，但較依賴于選擇數(shù)據(jù)段數(shù)目和位置，應(yīng)用@RISK軟件基于等概率數(shù)據(jù)段，即對表1中的連續(xù)型概率分布擬合時嘗試使每個數(shù)據(jù)段包含相等的概率量，由此獲得較高的評價依據(jù)。

表2　不同陰性樣品連續(xù)概率分布的評價(S4和S5)

表2結(jié)果表明：通過X2檢驗的值差別不大，以均勻分布(Uniform)為最優(yōu)。但根據(jù)經(jīng)驗可知，微生物在食品中的污染水平符合均勻分布的可能性較小，不予考慮。而AIC和BIC優(yōu)選的陰性樣品概率分布都為指數(shù)分布(Expon)，對應(yīng)的S4和S5場景的氣單胞菌概率密度圖分別如圖2和圖3所示，其中擬合求出的指數(shù)分布中衰減參數(shù)(β)分別為0.29和0.18，根據(jù)定義[8]，S4和S5場景的氣單胞菌菌數(shù)的期望值E[Nt]分別為1/0.29和1/0.18，即3.45 lg(CFU/g)和5.56 lg(CFU/g)。

圖2　　　應(yīng)用Expon函數(shù)擬合S4場景的氣單胞菌概率密度Fig.2　　　Aeromonas spp.probability density of Scenario 4　　　fitted by Exponential function

假設(shè)S4和S5選擇指數(shù)分布(Expon)作為氣單胞菌的初始污染水平，與上述的S2和S3類似，通過軟件模擬分析，求得最終的氣單胞菌菌數(shù)超過5 lg(CFU/g)的概率分別為32.4%和59.0%，這分別與S2和S3的結(jié)果(33.6%和69.3%)差異不顯著(P>0.05)，但與S1的結(jié)果(22.1%)差異顯著(P<0.01)。由此可知，致病菌初始污染水平的概率分布選擇離散型(S2和S3)或者連續(xù)型(S4和S5)，不是影響定量暴露評估結(jié)果的顯著因素。

另外，通過安德森-達林(A-D)檢驗按照表1列出的概率分布，對S4和S5進行評價，結(jié)果都分別為正態(tài)分布(Normal)最優(yōu)；通過K-S檢驗為邏輯分布(Logistic)最優(yōu)(數(shù)據(jù)未列出)。A-D檢驗和 K-S檢驗最初都是為擬合驗證而開發(fā)的檢驗，有觀點認(rèn)為適合于數(shù)據(jù)點較多的情況，不可直接作為確定替代分布的工具[9]。因此優(yōu)選概率分布的標(biāo)準(zhǔn)仍以AIC和BIC為準(zhǔn)。

2.3離散分布與連續(xù)分布的選擇

離散分布和連續(xù)分布是概率統(tǒng)計常用的兩類變量分析。簡單地說，符合離散分布的變量可以一一列舉，而符合連續(xù)分布的不能一一列舉，但變量充滿某一空間。從已有的QMRA研究來看，大多數(shù)設(shè)定致病菌符合離散分布，比如世界衛(wèi)生組織(WHO)、聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO)完成的不同食品中沙門菌、單增李斯特菌、阪崎腸桿菌、弧菌、病毒等的定量風(fēng)險評估研究[10]，主要依據(jù)是對致病菌污染水平采用定量檢測方法，如CFU/mL或CFU/g，并假設(shè)檢測結(jié)果是獨立和離散的，采用離散分布更能代表實際污染情況。但當(dāng)前有些致病菌的檢測方法采用最大可能數(shù)(MPN/g或MPN/mL)，本身即為概率方法，基于這類方法開展QMRA分析需特別謹(jǐn)慎[11]，推薦選用連續(xù)分布。

另外，CFU和MPN是并非可以互相換算的微生物計數(shù)方法，有專門研究二者之間的統(tǒng)計關(guān)系[12]，但并非通用于所有的病源性微生物；同時，與CFU方法原理不同，MPN方法不存在陰性樣品的問題，其原理可參考Cochan的經(jīng)典論述[13]。本研究的數(shù)據(jù)基于CFU的菌落計數(shù)方法，故選用離散分布對陰性樣品中致病菌的數(shù)量進行描述(S1、S2和S3)，同時還利用連續(xù)分布對致病菌的數(shù)量進行描述(S4、S5)，并探討了設(shè)定不同分布的結(jié)果差異，結(jié)果表明離散分布和連續(xù)分布計算得到的食物中毒發(fā)病率差異不顯著(S2和S4之間、S3和S5之間)?？赡茉蚴菢颖緮?shù)較大(文獻[2]中的100個)，但是如果樣本數(shù)過小，比如低于30個，仍建議選用離散分布，更符合實際檢測結(jié)果。

2.4評價概率分布的參數(shù)選擇

不同連續(xù)概率分布表達式代表的意義差別較大(表1)，如何選擇適合QMRA研究的概率分布對結(jié)果影響較大。優(yōu)選可通過專家意見(Expert opinion)、歷史經(jīng)驗(Previous experience)或統(tǒng)計分析(Statistical analysis)而實現(xiàn)[14]，本研究主要基于統(tǒng)計分析的幾種評價參數(shù)(AIC、BIC和X2而選定指數(shù)分布(Expon)模擬致病菌的初始污染水平(圖2和圖3)。

對概率分布的優(yōu)選，常用的評價方法包括赤池信息量準(zhǔn)則(AIC)、貝葉斯信息準(zhǔn)則(BIC)、卡方檢驗(X2)、安德森-達林檢驗(A-D)、科爾莫戈羅夫-斯米爾諾夫檢驗(K-S)和均方根誤差檢驗(RMSE)等[15]。其中AIC和BIC統(tǒng)計量是利用簡單表達式，使用對數(shù)似然函數(shù)計算得出的，一般認(rèn)為AIC假設(shè)“真”模型不在候選集中，應(yīng)用均方誤差最小原則，漸進于最優(yōu)模型，這種假設(shè)更符合實際情況[16]，因此首選AIC作為判斷依據(jù)。另外，卡方檢驗也可用于連續(xù)型或離散型樣本數(shù)據(jù)的擬合優(yōu)度檢驗，一般通過任意選擇數(shù)據(jù)段進行觀測值和期望值的比較，可通過等概率數(shù)據(jù)段的方式來消除數(shù)據(jù)段選擇的任意性(如@RISK軟件)。作為類似的模型“信息標(biāo)準(zhǔn)”檢驗參數(shù)，AIC和BIC結(jié)果類似，AIC基于漸進最優(yōu)的假設(shè)，而BIC不是，按照Yang[16]的分析，AIC趨向于對強度弱于BIC的參數(shù)數(shù)量進行懲罰，AIC更易于使概率分布獲得收斂。而其他幾種檢驗參數(shù)(X2、A-D和K-S)都為常用評價方法，各有優(yōu)缺點，可作為評價概率分布參數(shù)選擇的輔助參考。

同時，專家意見和歷史經(jīng)驗在選擇概率分布也是非常重要的參考依據(jù)，比如QMRA研究中常涉及的冰箱溫度、貯藏時間等，多為符合正態(tài)分布(Normal)，這些參數(shù)可以直接選用合適的概率分布來描述。

2.5陰性樣品的概率分布對風(fēng)險評估結(jié)果的影響

當(dāng)前食品風(fēng)險評估發(fā)展迅速，許多學(xué)者也質(zhì)疑此類研究數(shù)據(jù)缺乏和假設(shè)過多[17]。解決此類難題的方法有很多，如前述提高微生物檢測精度，如果能得出微生物的真實污染水平，對風(fēng)險評估模型的輸出值可靠性會大大提高。但是，風(fēng)險評估本身就是一個概率問題[5]，很難真正完全按照定值評價的模式來實現(xiàn)，而概率模式對食品安全控制和風(fēng)險管理更有實際意義(比如本文場景S1的最終污染水平導(dǎo)致食物中毒的概率為22.1%)，已證實比單純依靠點估計模式更優(yōu)[18]。需要注意的是，用概率方法進行風(fēng)險評估，為提高風(fēng)險特征描述的嚴(yán)謹(jǐn)性，模型本身的不確定性和變異性需要區(qū)別對待[19]。

本研究結(jié)果表明不同陰性樣品污染水平的假設(shè)對定量暴露評估結(jié)果的影響顯著，設(shè)定為零值的S2和設(shè)定為檢測限值的S3，預(yù)測得到的食物中毒概率分別為33.6%和69.3%，如果直接用來作為風(fēng)險管理和控制的理論參考，勢必嚴(yán)重失實并造成公眾恐慌。因此考慮陰性樣品(低于檢測限)的致病菌分布情況或者改進現(xiàn)在常用的Jarvis經(jīng)典公式[2-4]，提高風(fēng)險評估的科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性非常必要。

3結(jié)論

陰性樣品分布對微生物定量風(fēng)險評估結(jié)果影響顯著，以冷卻豬肉中氣單胞菌研究為例，設(shè)定陰性樣品全為零值或全為最高值(檢測限)，由此預(yù)測得到的食物中毒概率顯著高于常規(guī)的Jarvis公式方法。再以常用的連續(xù)型概率分布擬合上述2種極端的場景，通過AIC、BIC等評價參數(shù)進行比較，表明指數(shù)分布(Expon)作為氣單胞菌的初始污染水平最優(yōu)。今后微生物定量風(fēng)險評估研究不應(yīng)忽略陰性樣品分布的設(shè)定，以此提高風(fēng)險評估結(jié)果的可靠性。

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(責(zé)任編輯管珺)

Effect and optimization ofAeromonasspp.probability distribution in negative samples of chilled pork

DONG Qingli1,SONG Xiaoyu2,DING Tian3,LIU Qing1

(1.School of Medical Instrument and Food Engineering,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China;2.China National Center for Food Safety Risk Assessment,Beijing 100021,China;3.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China)

Abstract：This study was designed to verify the effects of pathogen in the negative samples on quantitative microbiological risk assessment (QMRA). Previous research on QMRA of Aeromonas spp. in chilled pork was taken as an example,and two scenarios of Aeromonas spp. in the negative samples,zero and maximum value (detection limit),respectively,were simulated in quantitative exposure assessment. The predictive food-poison probability of the two scenarios was 33.6% and 69.3%,respectively,and these values were higher than the previous results of 22.1% based on Jarvis function to estimate the possible pathogen distribution in negative samples significantly (P<0.01). Moreover,Akaike Information Criterion (AIC),Bayesian Information Criterion (BIC)， X2， and other parameters were applied for evaluating pathogen in negative sample with different continuous probability distributions. Exponential distribution proved to be better than Logistic,Normal,Triangle and Uniform with AIC values equaling to -41.24 and -135.62 under the two simulated scenarios,respectively,lower than the results of other distributions. In conclusion,pathogen distribution in negative sample should be noted and further optimized during QMRA in future.

Keywords：negative sample; Aeromonas spp.; probability distribution; risk assessment

中圖分類號：TS 201.3；TS 251.44

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1672-3678(2016)02-0064-06

作者簡介：董慶利(1979—)，男，山東臨沂人，博士，副教授，研究方向：畜產(chǎn)品質(zhì)量與安全控制，E-mail:dongqingli@126.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31271896、31371776)；上海市科委重點支撐項目(13430502400)；上海市科委長三角科技聯(lián)合攻關(guān)領(lǐng)域項目(15395810900)

收稿日期：2015-03-18

doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2016.02.012