茶樹CsANS基因及其啟動子的克隆與生物信息學(xué)分析

金琦芳，陳志丹，孫威江1,*，林馥茗，薛志慧，黃艷，唐秀華

1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建 泉州 362400；3.閩臺特色作物病蟲害生態(tài)防控協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350002

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茶樹CsANS基因及其啟動子的克隆與生物信息學(xué)分析

金琦芳1,3，陳志丹2,3，孫威江1,2,3*，林馥茗2,3，薛志慧2,3，黃艷2,3，唐秀華1,3

1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)安溪茶學(xué)院，福建 泉州 362400；3.閩臺特色作物病蟲害生態(tài)防控協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 福州 350002

摘要：采用RACE技術(shù)，獲得茶樹武夷奇種C18葉片花青素合成途徑中的花青素合成酶（ANS）基因的cDNA全長序列。采用染色體步移技術(shù)獲得該基因的啟動子序列。采用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測該基因在不同遮光處理下的表達動態(tài)。結(jié)果表明，CsANS全長cDNA為1 000 bp，其中ORF（Open Reading Frame）為957 bp，編碼320個氨基酸，含有DIOX-N和20G-Fell-Oxy保守功能結(jié)構(gòu)域；分離得到CsANS基因上游調(diào)控序列1 010 bp，其含啟動子核心元件TATA-box及ACE、GT1-motif、Sp1（光響應(yīng)元件）、circadian（生物鐘相關(guān)元件）等與花青素合成途徑相關(guān)的重要順式作用元件。熒光定量PCR分析表明，該基因在全光照處理（CK）時表達量較高，75%遮光時表達量較低。說明該基因的表達受光照強弱的控制。

關(guān)鍵詞：茶樹；CsANS基因；啟動子；生物信息學(xué)分析

茶樹武夷奇種C18，無性系。灌木型，中葉類，中生種。是福建省武夷山市茶葉研究所從武夷群體種中選育的優(yōu)良品系。芽葉紫紅色，茸毛較密，節(jié)稍長。且芽葉生育力強，發(fā)芽較密，持嫩性較強，是一種稀有的特色茶樹資源。武夷奇種C18芽葉呈現(xiàn)紅紫色，花青素含量較高[1-2]。研究表明，花青素是茶樹葉片呈現(xiàn)“紅紫色”的主要原因[3]。植物花青素的生物合成途徑已有較為深入的研究，其中花青素合成酶（Anthocyanin synthase，ANS）是將無色花青素經(jīng)氧化脫水形成紅紫色花青素的關(guān)鍵酶[1]。

環(huán)境信號激活花青素合成途徑中相關(guān)基因的表達[4]。在花青素合成的前期，光能調(diào)控相關(guān)基因的表達，弱光可以抑制或下調(diào)基因的表達，從而減少花青素的合成；而強光可以誘導(dǎo)花青素合成相關(guān)基因的表達，使花青素的含量增加[5]。光信號調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子與啟動子結(jié)合的強弱，并影響結(jié)構(gòu)基因的表達，其表達量也會隨之發(fā)生相應(yīng)的變化[1]。

目前在茶樹上，ANS基因的啟動子還未克隆。本研究根據(jù)已有的茶樹ANS基因的EST（Expressed sequence tags）序列，采用同源克隆和Genome Walking方法，克隆了紫葉茶樹的ANS基因及分離5′調(diào)控序列，再利用生物信息學(xué)法，預(yù)測了啟動子的順式作用元件，采用熒光定量PCR技術(shù)，分析ANS在不同光照條件下的表達模式，有助于揭示ANS在紫色茶樹葉片對環(huán)境信號響應(yīng)過程中的作用，解析光強對武夷奇種C18 ANS基因的調(diào)控機理，為紫芽茶樹特異種質(zhì)的創(chuàng)制和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

1.1.1 植物材料

試驗材料為武夷奇種C18，由福建省武夷山市茶葉研究所資源圃提供。選取武夷奇種C18的成熟葉片，迅速用液氮處理，置－80℃冰箱保存,用于基因組DNA的提取，克隆CsANS啟動子序列。

1.1.2 遮光處理

試驗在福建省武夷山市茶葉研究所資源圃中完成。2015年4月中旬，挑選生長發(fā)育良好、整齊一致、樹形基本相似的植株27株，分為3組（每9株為1組，每重復(fù)3株），掛牌標(biāo)記，并對其進行同一高度的修剪。待茶樹芽頭萌動之時，開始遮光處理。設(shè)2個處理：分別用75%和60%的黑色遮蔭網(wǎng)遮光，以全光照處理為對照。經(jīng)過15 d的遮光處理，取經(jīng)遮光處理和全光照處理（CK）的武夷奇種C18葉片（第一葉位），經(jīng)錫箔紙分裝于－80℃保存，用于熒光定量PCR檢測。

1.1.3 試劑

FH Plant DNA Kit(北京德曼特爾生物科技有限公司)；Primer Star(TaKaRa公司)；AgaroSe Gel DNA Extraction Kit(TaKaRa公司)；SMARTer RACE 5′/3′Kit(TaKaRa公司)；染色體步移試劑盒(TaKaRa公司)；pEASY-Blunt Zero Cloning Kit(福州都拜特生物技術(shù)有限公司)；引物合成及樣品測序由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 茶樹葉片總RNA及基因組DNA的提取本試驗參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取茶樹總RNA；采用FH Plant DNA Kit(北京德曼特爾生物科技有限公司)試劑盒提取紫葉茶樹基因組DNA。

1.2.2 茶樹CsANS 5′RACE、3′RACE及全長ORF的PCR擴增

cDNA第一鏈的合成按RevertAidTMFirst-Strand cDNA Synthesis Ki試劑盒說明書進行。根據(jù)已報道的擬南芥、葡萄、茶樹等ANS基因序列，用DNAMAN設(shè)計同源克隆引物。上游引物：5′-CAACAATGATGACTACAGTGGCTG-3′，下游引物：5′-GCGCCTTTAGAGCCAAGTTCTTG-3′。PCR擴增體系：12.5 μL Ex-Taq mix，2 μL cDNA模板，0.5 μL ANS-R，0.5 μL ANS-F，補ddH2O 至25 μL體系。94℃預(yù)變性4 min，94℃變性40 s，56℃退火30 s，72℃延伸3 min，35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min進行PCR擴增。在其ORF兩端設(shè)計特異引物qANS-R：5′-ATGGCTCTCTGTACATATGCATGTC-3′；qANS-F：5′-TTATACAATTGTTACACCCCCGGTC-3′擴增全長序列。

1.2.3 CsANS基因啟動子的克隆

根據(jù)TaKaRa Genome Walking Kit引物設(shè)計原則，在已知的茶樹ANS基因（GenBank收錄號為AY830416.1）的已知序列區(qū)（最好不少于500 bp）分別設(shè)計3條反向且退火溫度較高的特異性引物SP1、SP2和SP3，再與試劑盒中提供的4種經(jīng)過獨特設(shè)計的退火溫度較低的兼并引物AP1、AP2、AP3和AP4進行熱不對稱PCR反應(yīng)[6]，經(jīng)過3次巢式PCR反應(yīng)獲得已知序列的側(cè)翼序列。用于擴增ANS基因啟動子序列的特異性引物情況詳見表1。以提取的武夷奇種C18茶樹葉片DNA為模板，按照TaKaRa Genome Walking Kit說明和林玉玲等[7]的方法進行ANS基因啟動子的克隆。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的條帶克隆至pMD18-T載體，37℃連接過夜后進行轉(zhuǎn)化測序（鉑尚生物技術(shù)有限公司）。

表1　茶樹ANS基因啟動子克隆引物列表Table 1 Primer sequences of the promoter isolation of ANS genes in Camellia sinensis

1.2.4 熒光定量PCR表達分析

分別提取遮光75%、60%和全光照處理（CK）的武夷奇種C18第一葉位總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋10倍作模板。以18 S-rRNA基因為內(nèi)參（18 SⅠ：5′-CCTGAGAAACGGCTACCACA-3′，18 SⅡ：5′-CACCAGACTTGCCCTCCA-3′）。運用DNAMAN軟件，按照熒光定量PCR引物設(shè)計原則，設(shè)計熒光定量PCR引物（ANS-R：5′-GTTGCTGTAATAGGCGATGGTG-3′，ANS-F：5′-CCTGTTGGACTGTAATCTGCTAAG-3′）。參照SYBR Prime ScriptTMRT-PCR Kit （TaKaRa）說明書，進行熒光定量PCR擴增體系：cDNA模板1 μL，2×SYBR Premix Ex-TaqTM5 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各0.2 μL，用RNase-free H2O補足至10 μL。95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃復(fù)性34 s，共40個循環(huán)。每份樣品設(shè)3次重復(fù)。

試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用Microsoft Excel 2007軟件，采用2-ΔΔCt法計算其相對表達量[8]；應(yīng)用SPSS軟件對結(jié)果進行差異顯著性分析。應(yīng)用Microsoft Excel 2007軟件作柱狀圖。

1.2.5 生物信息學(xué)分析

CsANS序列通過在線NCBI的Blast功能進行氨基酸序列同源性比較；通過Protparam軟件對基因的分子量、等電點進行預(yù)測，初步分析目的基因的功能；通過TMHMM和TMPred軟件進行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)的預(yù)測；SignalP 4.1進行信號肽預(yù)測；在線SOPMA預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。ProtComp Version 9.0進行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

啟動子序列通過在線Plant CAR[9]及Place軟件[10]預(yù)測其順式作用元件的種類、分布情況和生物學(xué)功能[11]。通過在線軟件BDGP[12]預(yù)測轉(zhuǎn)錄起始位點及可能的核心啟動子區(qū)域。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹CsANS基因cDNA全長克隆

2.1.1 茶樹CsANS基因PCR結(jié)果分析

經(jīng)PCR擴增回收測序及使用DNAman軟件拼接獲得CsANS基因全長序列1 000 bp （GenBank收錄號為KT215319）。（圖1）該序列包含1個完整的閱讀框（15～977 bp），編碼320個氨基酸，該基因含有起始密碼子ATG、終止密碼子TAA，并含有保守功能結(jié)構(gòu)域DIOX-N、20G-Fell-Oxy，屬于DIOX-N 和20G-Fell-Oxy超級家族（圖2）。

圖1　茶樹CsANS基因的全長cDNAFig.1 The full length cDNA of CsANS from Camellia sinensis

2.1.2 茶樹CsANS基因的進化分析

將武夷奇種C18茶樹ANS基因的氨基酸序列與已知的茶樹、高叢越橘（Vaccinium corymbosum）、和甘薯（Ipomoea batatas）等11種植物ANS基因的氨基酸序列進行同源進化樹分析（圖3）。發(fā)現(xiàn)所克隆的ANS蛋白與同屬茶樹ANS蛋白（登錄號：AY830416.1）的一致性高達100%。與其他物種比較，發(fā)現(xiàn)茶樹ANS蛋白在親緣關(guān)系上與高叢越橘最近，同源性為78%。

圖3　ANS相關(guān)基因的同源進化樹Fig.3 Homologous phylogenetic tree of ANS gene related genes

2.1.3 CsANS基因氨基酸生物信息學(xué)分析

通過ProtParam軟件對CsANS氨基酸進行基本信息分析可知，CsANS基因編碼320個氨基酸；相對分子量36 113.6 kD；理論等電點pI為6.23；負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）為46個，正電荷殘基（Arg+Lys）為43個；不穩(wěn)定指數(shù)為41.05，屬于不穩(wěn)定蛋白；脂溶系數(shù)為：88.97，平均疏水性（GRAVY）為－0.397；分子式：C1626H2576N432O472S12，總原子數(shù)為5 118，氨基酸組成中谷氨酸含量最高，占總氨基酸的10.3%；其次為甘氨酸，占6.9%，其他氨基酸占82.8%。

利用在線軟件TMHMM Server v.2.0工具預(yù)測CsANS蛋白的跨膜螺旋區(qū)，如圖4顯示，該蛋白不是膜蛋白，無跨膜螺旋區(qū)。使用TMpred預(yù)測也顯示蛋白都分布在膜外，無跨膜蛋白。通過在線軟件COILS對CsANS氨基酸預(yù)測，在CsANS蛋白的25個氨基酸左右預(yù)測到強超螺旋信號。經(jīng)過SignalP-4.1預(yù)測信號肽顯示，CsANS編碼的氨基酸不含信號肽，不是分泌蛋白。對氨基酸的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示CsANS編碼的氨基酸中α螺旋結(jié)構(gòu)較多，有125個占所有氨基酸的39.06%，其次為無規(guī)則卷曲占31.87%，延伸鏈占17.81%，β折疊所占比例最低為11.25%。通過ProtComp Version 9.0軟件進行亞細(xì)胞定位預(yù)測，其亞細(xì)胞定位在細(xì)胞質(zhì)。

2.2 CsANS基因啟動子克隆

2.2.1 CsANS基因啟動子擴增結(jié)果

以武夷奇種C18的DNA為模板，經(jīng)3輪巢式PCR反應(yīng)后，擴增到1條大于1 000 bp的目的片段（圖5）。將該片段進行克隆、測序，結(jié)果顯示，獲得的片段實際長度為1 236 bp。序列經(jīng)過分析整理后，以ATG為起始位點，得到茶樹CsANS上游長度為1 010 bp的DNA序列。

2.2.2 茶樹CsANS啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點的預(yù)測

經(jīng)過啟動子轉(zhuǎn)錄起始位點在線預(yù)測，茶樹CsANS基因1 010 bp的5′端調(diào)控序列可能存在3處核心啟動子區(qū)域，位于35～85、316～366、480～530 bp，分值分別為0.96、1和0.88，可能的轉(zhuǎn)錄起始位點分別為G、C和T。此結(jié)果可推測位于316～366 bp的序列很可能就是該基因真正的核心啟動子區(qū)域，轉(zhuǎn)錄起始位點為位于第357 bp的C（圖6）。

2.2.3 茶樹CsANS基因啟動子順式元件分析

啟動子生物學(xué)功能的在線預(yù)測結(jié)果表明，CsANS基因啟動子區(qū)域中，除了含有大量的核心啟動子元件如CAAT-box和TATA-box之外，還存在多種順式元件，如脫落酸相關(guān)元件ABRE，厭氧誘導(dǎo)相關(guān)的元件ARE，熱應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)元件HSE，晝夜控制調(diào)節(jié)元件circadian，低溫應(yīng)答元件LTR，光響應(yīng)相關(guān)元件Sp1、ACE、I-box及MYB結(jié)合位點等（表2）。

圖2　ANS序列的超家族信息Fig.2 The super family information of the ANS sequence

圖4　CsANS跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Posterior probability for CsANS

圖5　茶樹CsANS啟動子的PCR擴增Fig.5 PCR production of CsANS promoter from Camellia sinensis

2.3 相對熒光定量PCR表達分析

以18 S-rRNA為內(nèi)參，采用實時熒光定量PCR對不同遮光處理及未處理的武夷奇種C18葉片CsANS基因表達進行了分析，結(jié)果（圖7）表明，其表達量在全光照處理（CK）時較高，75%遮光時較低。隨著遮光度增加，呈現(xiàn)下調(diào)趨勢。說明茶樹葉片在光照強時花青素合成酶（ANS）表達量高，光照弱時表達量低。

圖6　CsANS基因啟動子分析Fig.6 CsANS gene’s promoter analysis

3 討論

CsANS是紫葉茶樹花青素合成的最后一個酶，也是將無色花青素經(jīng)氧化脫水形成紅紫色花青素的最關(guān)鍵酶，此中間產(chǎn)物進一步與3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（3GT）偶聯(lián)并且被傳送到液泡中，形成顯色的3-O-糖苷化花青苷[13]，在植物色澤形成中具有重要作用[14]。ANS基因最初是利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)從玉米的A2突變體中鑒定和克隆得到[15]，近年來在茶樹（AY830416.1）、擬南芥（AT4G2288）、小麥（T.aestivum，AB247921）[16-17]等多種植物中也已經(jīng)得到其克隆。本研究從武夷奇種C18中克隆得到了CsANS的cDNA全長序列，該基因編碼的蛋白具有典型 ANS蛋白的保守結(jié)構(gòu)域：DIOX-N、20G-Fell-Oxy。DIOX-N（嗎啡合成非血紅素加氧酶的N-末端）是蛋白質(zhì)與2-酮戊二酸/鐵（Ⅱ）依賴性雙加氧酶活性的高度保守的N-末端區(qū)域。2OG-FeⅡ_Oxy氧化酶結(jié)構(gòu)域由2-酮戊二酸和Fe(Ⅱ)-依賴的氧化酶超家族組成，該家族包括脯氨酰4-羥化酶α亞基的C末端。全酶由一個α2β2復(fù)合物組成，α亞基是其主要的活性位點。能夠催化反應(yīng)：前膠原L-脯氨酸+2-酮戊二酸+O2=前膠原反式-4-羥基-L-脯氨酸+琥珀酸+CO2[14]。與其他已知的ANS蛋白相比，CsANS編碼的氨基酸具有較高的同源性，它與高叢越橘（JN654701.1）的同源性較高，一致性為78%。所以推斷CsANS與高叢越橘中典型的花青苷元合成酶基因的生物學(xué)功能類似。

表2　CsANS基因部分啟動子元件Table 2 Partial element of CsANS promoter

圖7　紫葉茶樹在不同遮光處理下CsANS基因表達分析Fig.7 Purple leaf tea plant CsANS gene expression analysis under different shading treatment

環(huán)境信號激活花青素苷合成途徑，并促使茶樹葉片開始積累花青素[18-20]。不同的外界環(huán)境因子下，葉色會隨之改變。光照是影響花青素苷合成最重要的環(huán)境因子之一。Hong等[21]對茶樹進行暗光處理后發(fā)現(xiàn)ANS基因表達水平下降。Rosati等[17]從連翹中克隆得到ANS基因，并證明在Forsythin的花瓣中由于缺少ANS基因，所以形成無花色素苷。結(jié)合實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)可以看出：不同遮光處理及全光照處理的武夷奇種C18葉片中CsANS基因均有表達；全光照處理下，ANS基因表達量較高，75%遮光時較低，且遮光度增加，ANS基因表達量減少。這表明光照強時ANS基因表達量較高，光照弱時ANS基因表達量較低；CsANS基因?qū)τ谖湟钠娣NC18葉片色澤形成過程可能起主要作用，推斷與其基因的催化功能吻合。

近年來ANS啟動子在洋蔥（Allium cepa L.）、三色堇（Viola×wittrockiana Gams.）、紫心甘薯[Ipomoea batatas(L.)Lam.]中已經(jīng)得到克隆[22-24]。洋蔥、紫心甘薯和三色堇的ANS啟動子除含有多個CAAT-box、TATA-box等基本啟動子元件外，還含有與MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的元件，以及參與光響應(yīng)、逆境、激素應(yīng)答的順式作用元件。這與本研究中武夷奇種C18的ANS啟動子發(fā)現(xiàn)的順式作用元件相符，說明不同植物間ANS基因功能類似。武夷奇種C18的ANS啟動子中發(fā)現(xiàn)了6種與光反應(yīng)調(diào)控有關(guān)的順式作用元件，結(jié)合CsANS基因在不同光強下表達量的變化，可以推測ANS是個受光照調(diào)控的基因。ANS基因在其他物種中參與光反應(yīng)的研究已有報道[25-26]，而從啟動子角度來研究這類基因功能還鮮有報道，本實驗下一步可以構(gòu)建ANS基因的啟動子缺失載體，轉(zhuǎn)化到植株中，通過光照處理研究該啟動子是否為光誘導(dǎo)型啟動子，確定啟動子核心啟動區(qū)，對光照調(diào)控ANS基因的原理加以闡釋。

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Cloning and Bioinformatical Analysis of Anthocyanin Synthase Gene and Its Promoter in Camellia sinensis

JIN Qifang1,3,CHEN Zhidan2,3,SUN Weijiang1,2,3*,LIN Fuming2,3,XUE Zhihui2,3,HUANG Yan2,3,TANG Xiuhua1,3

1.College of Horticulture,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China; 2.College of Tea,Fujian Agriculture and Forestry University,Quanzhou 362400,China; 3.Fujian-Taiwan Joint Centre for Ecological Control of Crop Pests,Fuzhou 350002,China

Abstract:The full length cDNA sequence of anthocyanin synthase gene（CsANS）was cloned from‘Wuyi qizhong C18’(Camellia sinensis)using rapid amplification of cDNA ends（RACE）technology.The promoter of CsANS was isolated using Genome Walking technology.The gene expression of ANS under different shading treatments was analyzed by the real-time PCR.The results showed that the full length cDNA of CsANS was 1 000 bp,and it contained a 957 bp open reading frame(ORF),which encoding a protein of 320 amino acid,including two conservative functional domains,DIOX-N and 20G-Fell-Oxy.A sequence containing 1 010 bp was isolated and found to be the promoter of CsANS,which contained many cis-acting elements related to anthocyanin biosynthetic pathway,such as the core promoter element TATA-box and light responsive element(including ACE,GT1-motif and Sp1),circadian(cis-acting regulatory element involved in circadian control).The real-time PCR analysis revealed that the gene was highly expressed under the sunshine(CK),while lowly expressed under the 75% shading.This study reveals that the expression of CsANS was regulated by light intensity.

Keywords:Camellia sinensis,CsANS gene,promoter,bioinformatics analysis

作者簡介：金琦芳，女，碩士研究生，主要從事茶樹分子生物學(xué)研究。*通訊作者：swj8103@126.com

基金項目：國家“863”計劃閩臺優(yōu)異茶樹種質(zhì)發(fā)掘創(chuàng)新與保護利用（2013AA10260605）、紫化芽葉茶樹種質(zhì)資源的挖掘保存與創(chuàng)新利用（2015N5008）。

收稿日期：2015-11-23

修訂日期：2015-12-16

中圖分類號：S571.1；Q52

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-369X（2016）02-219-10