Smad1在C57BL/6小鼠形覺剝奪性近視中的作用機制

崔　倩，楊　先，車成業(yè)，劉桂波，王　青

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·實驗論著·

Smad1在C57BL/6小鼠形覺剝奪性近視中的作用機制

崔倩，楊先，車成業(yè)，劉桂波，王青

Study of Smad1 in C57BL/6 mice with form-deprived myopia

Qian Cui, Xian Yang, Cheng-Ye Che, Gui-Bo Liu, Qing Wang

Foundation item:the National Natural Science Foundation of China(No.81300790)

Department of Ophthalmology,the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China

Correspondence to:Xian Yang. Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, Shandong Province, China. yangxian_zhao@126.com

Received：2016-01-11Accepted：2016-03-16

Abstract

?AIM: To explore the mechanism of Smad1 during form-deprivation myopia development in C57BL/6 mice model.

?METHODS: Sixty 3-week-old C57BL/6 mice were randomly divided into experimental groups and normal groups (NC) which totally include four groups: form-deprived 3wk group (FDM3W,n=20), form-deprived 4wk group (FDM4W,n=20), FDM3W normal control group (FDM3W-NC,n=10) and FDM4W normal control group (FDM4W-NC,n=10). Mice in experimental groups were treated with diffuser wearing on right eyes (MD-T), and their left eyes were naturally exposed as their self-control group (MD-C). The normal control groups were free of all the treatments, but the same measurements were performed at the same time-point. Refractive status was examined at 3 and 4wk after treatments in all mice. The histological analysis was applied to assess the changes of the sclera and the retina. The immunohistochemical staining and quantitative real-time PCR (QRT-PCR) were applied to investigate the expression of Smad1 protein and mRNA in retina.

?RESULTS: (1)There was no significant difference between right and left eyes in every group before experiment. The normal control eyes showed physiological farsighted development and the MD eyes demonstrated relatively myopization. After experiments, a significant myopia shift had been induced in MD-T compared with MD-C and NC(P<0.05). (2) Histopathologic examination showed posterior sclera and retina in MD-T were thinner than in MD-C and NC groups. Compared with MD-C and NC groups, the expression of Smad1 in retina in MD-T was significantly decreased(P<0.01).

?CONCLUSION:The expression of Smad1 in retina of form-deprived myopia was down-regulated, and Smad1 likely to be involved in the development of myopia through the transduction of retinal signal.

KEYWORDS:?Smad1; form-deprived myopia; refraction; retina; C57BL/6 mice

Citation:Cui Q, Yang X, Che CY,etal. Study of Smad1 in C57BL/6 mice with form-deprived myopia.GuojiYankeZazhi(IntEyeSci) 2016;16(4):617-621

摘要

關(guān)鍵詞：Smad1；形覺剝奪性近視；屈光度；視網(wǎng)膜；C57BL/6小鼠

引用：崔倩，楊先，車成業(yè)，等.Smad1在C57BL/6小鼠形覺剝奪性近視中的作用機制.國際眼科雜志2016;16(4):617-621

0引言

研究發(fā)現(xiàn)，近視是目前全球發(fā)生率最高的屈光不正[1]。已有大量研究確定高度近視患者并發(fā)青光眼、白內(nèi)障和視網(wǎng)膜脫離等疾病的危險性顯著增加，進而會導(dǎo)致不可逆性視力損失甚至致盲，但其發(fā)病機制目前尚不明確。目前近視發(fā)生機制研究中公認的兩種學(xué)說“鞏膜主動重塑機制”學(xué)說[2]和“局部視網(wǎng)膜調(diào)控機制”學(xué)說[3]均認為近視眼的形成是受局部視網(wǎng)膜信息調(diào)控引起鞏膜細胞外基質(zhì)主動重塑的結(jié)果。但視網(wǎng)膜與鞏膜之間具體的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路仍需進一步探索。McBrien[4]研究已證實BMP/TGF-β信號通路通過調(diào)控鞏膜重塑過程參與了近視的發(fā)生發(fā)展過程。

作為BMP/TGF-β信號通路中主要的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子[5]，Smads轉(zhuǎn)錄因子在BMP/TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用，其中Smadl已被確定為BMP-2的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。本實驗通過建立C57BL/6小鼠形覺剝奪性近視(form deprivation myopia，F(xiàn)DM)模型，觀察屈光度及眼球后壁形態(tài)學(xué)改變以及Smad1在視網(wǎng)膜中的表達變化，分析Smad1與屈光度及視網(wǎng)膜變化之間的聯(lián)系，探討Smad1在近視眼中的作用機制，以期通過此次探索能夠為近視發(fā)病機制的研究提供更多的實驗基礎(chǔ)和依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物近交系SPF級健康雄性C57BL/6小鼠60只，21日齡，體質(zhì)量13.6±0.8g，動物購自常州卡文斯實驗動物有限公司。0.5%復(fù)方托吡卡胺滴眼液散瞳后裂隙燈下檢查所有小鼠眼部情況，排除標(biāo)準(zhǔn)包括：(1)角膜混濁、晶狀體混濁及眼部感染的小鼠；(2)小瞳孔、小角膜、眼部畸形的小鼠；(3)雙眼屈光參差>10D，或1眼有明顯遠視或近視。實驗動物飼養(yǎng)室溫控制在20℃～25℃，通風(fēng)良好，室內(nèi)自然光照，12h/12h光照/黑暗環(huán)境每日交替，小鼠自由進水、攝食。動物的飼養(yǎng)及處理經(jīng)青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會審批通過。

1.1.2主要試劑與儀器帶狀光檢影驗光儀(蘇州六六視覺科技股份有限公司)、Olympus光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)、Smad1兔多克隆抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)、PCR引物(大連寶生物工程有限公司)、Ver.3.0型RNA PCR試劑盒(大連寶生物試劑公司)、SYBR(日本TaKaRa公司)、實時熒光定量PCR儀(德國Eppendorf公司)、SP試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1實驗小鼠分組將60只3周齡健康C57BL/6小鼠隨機編號1～28，剪耳標(biāo)記，利用隨機數(shù)字表法將其分成4組，分別為：(1) 形覺剝奪遮蓋3wk組(20只)，記為FDM 3W；(2) 形覺剝奪遮蓋4wk組(20只)，記為FDM 4W；(3)形覺剝奪3wk正常對照組(10只)，記為FDM 3W-NC；(4)形覺剝奪4wk對照組(10只)，記為FDM 4W-NC。對照組周齡均與實驗組相匹配。其中實驗組右眼為實驗眼(MD-T)，左眼為自身對照眼(MD-C)，正常對照組雙眼不予任何處理。每3～4只小鼠飼養(yǎng)在一個標(biāo)準(zhǔn)鼠籠內(nèi)。

1.2.2形覺剝奪性近視小鼠模型的建立將半透明試管制成等大、直徑約為8mm、周邊邊緣約為1mm的半透明眼罩進行形覺剝奪。經(jīng)5%枸櫞酸芬太尼注射液麻醉后，使用4-0縫線將眼罩縫合于小鼠右眼眼周。眼罩邊緣距離眼瞼的距離足夠長，以免影響其功能。手工用塑料片制成的項圈(外直徑為36mm，內(nèi)直徑為10mm)裝在頸部周圍，以防小鼠將眼罩抓脫。每天早、中、晚三次檢查小鼠眼部情況，查看有無異常分泌物及感染、眼罩有無脫落，以保證小鼠實驗眼一直處于形覺剝奪狀態(tài)。必要時給予妥布霉素滴眼液預(yù)防感染。誘導(dǎo)3、4wk(即出生后6、7wk)后，檢測實驗動物的屈光度，并取視網(wǎng)膜組織進行檢測。

1.2.3眼屈光度的測量小鼠的屈光度檢查采用傳統(tǒng)的帶狀光視網(wǎng)膜檢影法。由同一位經(jīng)驗豐富的驗光師在未知小鼠分組的情況下對其進行檢查。測量前小鼠雙眼予以0.5%復(fù)方托吡卡胺滴眼液點眼，每5min 1次，連續(xù)3次，使瞳孔充分散大，直徑>1.5mm，驗光時不進行麻醉。暗室條件下，實驗者抓握小鼠使其暴露被檢眼，驗光師取50cm工作距離，以0.50D間隔手持驗光鏡片分別在水平及垂直子午線上檢影，散光以半量等效球鏡計算。測量3次，以D為單位，記錄每只小鼠各眼的屈光度平均值。

1.2.4標(biāo)本處理測量屈光度后，頸椎脫臼法處死全部小鼠。在顯微鏡下，迅速取出整個眼球，用眼科鑷和眼科剪剝離眼球周圍筋膜，沿角膜緣將眼球剪開，去除眼球內(nèi)的玻璃體，分離鞏膜留取視網(wǎng)膜。各組隨機取5只小鼠眼球置于4%甲醛固定48h后行石蠟包埋，備用于常規(guī)HE染色及免疫組化染色；各組其它小鼠視網(wǎng)膜置于Trizol液中，并立即震蕩充分裂解后，保存于-80℃，備用于實時熒光定量PCR反應(yīng)。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色法檢測Smad1蛋白的表達在各組中隨機取5只小鼠眼球，予以常規(guī)石蠟包埋，所有組織塊于后極部以3μm的厚度連續(xù)切片4張，一張用于蘇木素-伊紅(HE)染色，1張用做陰性對照，2張用于免疫組化染色。按照SP試劑盒內(nèi)說明書進行免疫組化染色，一抗工作濃度為1∶100，以PBS液代替一抗作陰性對照。顯微鏡下觀察各組標(biāo)本中Smad1的顯色程度、分布范圍及密度，以細胞核或細胞漿染成藍色為陽性標(biāo)準(zhǔn)。對HE染色及免疫組織化學(xué)染色結(jié)果行描述性分析。

1.2.6實時熒光定量PCR檢測Smad1 mRNA從-80℃冰箱內(nèi)取出凍存的小鼠視網(wǎng)膜組織，用Trizol法提取總RNA。目的基因應(yīng)用primer design基因分析軟件設(shè)計引物，并由TaKaRa生物公司合成。Smad1上下游引物分別為：5’-GGAATGCTGTGAGTTCCCATTTG-3’、5’-TGCTGAGGATTGTACTCGCTGTG-3’，產(chǎn)物片段長為23bp；內(nèi)參β-actin上、下游引物分別為：5’-GATTACTGCTCTGGCTCCTAGC-3’，5’-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC-3’，產(chǎn)物長度301bp。常規(guī)提取總RNA，采用紫外分光光度計分別測定光密度OD260與OD280，OD260與OD280比值在1.8～2.0之間，表明提取的RNA蛋白污染少，純度較好。逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA為模板擴增Smad1目的基因，Syber Green熒光定量PCR檢測：PCR熱循環(huán)參數(shù)為95℃ 30s，95℃ 5s，然后第二步反應(yīng)60℃ 30s，95℃ 15s，進行40個循環(huán)，于每個循環(huán)的第二步(95℃ 15s)收集熒光信號。擴增結(jié)束后，進入分析結(jié)果界面，以β-actin作為內(nèi)參照基因，與對照組相比較，得到Smad1相對定量值(RQ值)。

統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗組內(nèi)形覺剝奪眼(MD-T)與對側(cè)眼(MD-C)的比較采用配對樣本t檢驗；不同組間的兩兩比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義；以P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠實驗前后屈光度比較各組小鼠實驗前后實驗眼、自身對照眼及正常對照眼屈光度的比較見表1。圖1形覺剝奪不同時間眼球后壁的改變(HE，×200 )A：形覺剝奪3wk；B：形覺剝奪4wk組；①：自身對照眼；②：實驗眼；③：正常對照眼；黑色箭頭所指為鞏膜，紅色箭頭所指為內(nèi)核層，白色箭頭所指為內(nèi)從狀層。

表1各組小鼠實驗前后實驗眼、自身對照眼及正常對照眼屈光度的比較

±s，D)

實驗前，正常對照組小鼠左右眼屈光度在統(tǒng)計學(xué)上無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，由于是隨機分組，根據(jù)正常對照組小樣本推斷所有實驗動物在實驗前的屈光度無統(tǒng)計學(xué)意義。FDM 3W組、FDM 4W組中，自身對照眼和正常對照組均呈生理性遠視化發(fā)展。實驗眼均呈相對近視化發(fā)展，F(xiàn)DM 3W組屈光度分別與自身對照眼、正常對照眼相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-40.52，P<0.01；t=-20.49，P=0.032)；FDM 4W組屈光度分別與自身對照眼、正常對照眼相比，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(t=-49.356，P<0.01；t=-48.992，P<0.01)。FDM 3W組中實驗眼與FDM 4W組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-5.968，P=0.006)，這表明隨著形覺剝奪時間的延長，實驗眼向近視方向漂移程度越高。在不同時間自身對照眼和正常對照眼屈光度在統(tǒng)計學(xué)上均無明顯差異。

2.2光鏡下眼球后壁的改變眼球后壁石蠟切片行HE染色，光鏡下觀察可見小鼠鞏膜由多層纖維結(jié)締組織構(gòu)成(圖1)。與自身對照眼和正常對照眼相比，F(xiàn)DM 3W時實驗眼鞏膜變薄，成纖維細胞排列紊亂；FDM 4W時鞏膜明顯變薄，膠原纖維紊亂、粗細不均。實驗組視網(wǎng)膜厚度變薄，尤其是內(nèi)核層和內(nèi)叢狀層。而自身對照眼及正常對照眼鞏膜厚度無明顯差異。各圖中眼球后壁分層均清晰可見，從上至下分別為：鞏膜-脈絡(luò)膜-視網(wǎng)膜色素上皮層-外節(jié)-內(nèi)節(jié)-外核層-外叢狀層-內(nèi)核層-內(nèi)叢狀層-神經(jīng)節(jié)細胞層-神經(jīng)纖維層。

2.3各組小鼠眼球后壁Smad1蛋白的表達各組小鼠實驗眼及對照眼Smad1蛋白的表達變化見圖2。圖中可見對照組中Smad1陽性蛋白表達于視網(wǎng)膜，呈棕黃色顆粒狀，染色明顯。而在FDM 3W及FDM 4W后，Smad1表達逐漸下調(diào)，胞漿著色明顯降低。

2.4各組小鼠視網(wǎng)膜Smad1 mRNA的表達根據(jù)實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，各組視網(wǎng)膜均有Smad1 mRNA的表達。單因素方差分析結(jié)果顯示，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(F=31.65，P<0.01)。與正常對照組及自身對照組比較，F(xiàn)DM 3W組實驗眼Smad1 mRNA表達呈下調(diào)趨勢(t=7.263，P<0.01；t=-9.487，P<0.05)，F(xiàn)DM 4W組實驗眼Smad1 mRNA表達顯著減少(t=12.778，P<0.01；t=-15.573，P<0.01)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。FDM 3W組中實驗眼與FDM 4W組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在不同時間自身對照眼和正常對照眼Smad1的表達在統(tǒng)計學(xué)上均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。各實驗組視網(wǎng)膜Smad1mRNA表達量比較分別見表2、圖3。

3討論

近視是一類受遺傳、環(huán)境等多因素共同作用的復(fù)雜性疾病[6-7]，有關(guān)其發(fā)病機制的研究也眾說紛紜。Smad1是BMP/TGF-β信號通路中BMP-2下游的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子[8-9]，在近視形成過程中發(fā)揮著不可或缺的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。Guo等[10]研究發(fā)現(xiàn)近視誘導(dǎo)過程中BMP/TGF-β信號通路的下游轉(zhuǎn)錄因子Smad1表達出現(xiàn)下調(diào)趨勢。此外Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白phospho-Smad 1的表達在刺激BMP-2之后明顯升高。這些研究均充分暗示出Smad1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了鞏膜重塑過程。之前有關(guān)此方面的研究基本是體外細胞培養(yǎng)進行[12-13]，本實驗的創(chuàng)新之處在于采用C57BL/6小鼠不同時間段的形覺剝奪性近視模型觀察Smad1的動態(tài)表達變化，探究其與屈光度、眼球后壁形態(tài)之間的關(guān)聯(lián)以及其在近視中的作用機制。

圖2各組小鼠Smad1蛋白的表達情況(SP，×400)

A：FDM 3W自身對照眼；B：FDM 3W實驗眼：C：FDM 4W自身對照眼；D：FDM 4W實驗眼；E：以PBS液代替一抗作陰性對照。

圖3各組FDM 3W、FDM 4W小鼠實驗組視網(wǎng)膜Smad1 mRNA的表達

bP<0.01vs正常對照組、自身對照組；aP>0.05vs自身對照組。

表2各組小鼠實驗后實驗眼、自身對照眼及正常對照眼Smad1 mRNA相對表達量比較

±s

本實驗中屈光度結(jié)果顯示實驗眼與自身對照眼及正常對照組相比明顯向近視方向漂移，這一趨勢與之前的相關(guān)研究結(jié)果相一致[14]。在本實驗中，我們還觀察到Smad1表達于視網(wǎng)膜各層，而且隨著剝奪時間的延長、向近視方向漂移程度的加深，實驗組視網(wǎng)膜中Smad1的表達量明顯呈漸進性減少，鞏膜及視網(wǎng)膜(特別是內(nèi)核層和內(nèi)叢狀層)也隨之逐漸變薄。Ehrlich等[15]曾報道在雞形覺剝奪性近視眼中視網(wǎng)膜較對照組明顯變薄，尤其是外核層、內(nèi)核層以及內(nèi)叢狀層。Fujikado等[16]曾推斷視網(wǎng)膜內(nèi)層區(qū)參與了形覺剝奪性近視形成過程。

目前兒童和青少年近視不僅發(fā)生率大幅度增高，逐漸向低齡化發(fā)展，且發(fā)生后呈進展趨勢。神經(jīng)、肌肉異常導(dǎo)致的上瞼下垂，或先天性屈光間質(zhì)混濁，都可以導(dǎo)致FDM的發(fā)生[17]。研究發(fā)現(xiàn)，長時間的光線照射和羥多巴胺等可以抑制FDM的形成，但其并不因割斷視神經(jīng)而被抑制，所以FDM的形成為局部視網(wǎng)膜變化的結(jié)果，所以在此實驗基礎(chǔ)上我們進一步推測在形覺剝奪性近視中視網(wǎng)膜接受信號釋放出的信號因子調(diào)控Smad1的表達下調(diào)，繼而引起視網(wǎng)膜細胞數(shù)目減少或發(fā)生形態(tài)學(xué)改變使視網(wǎng)膜厚度變薄，并且Smad1的表達減少導(dǎo)致BMP/TGF-β信號通路的信息傳導(dǎo)受阻，最終影響到BMP-2對鞏膜重塑的調(diào)控作用，形成近視。

綜上所述，在形覺剝奪性近視中Smad1的表達呈下調(diào)趨勢，且其表達量與屈光度、視網(wǎng)膜及鞏膜表現(xiàn)出相關(guān)性，因此我們推測隨著近視的加重，視網(wǎng)膜釋放出信號之后通過Smad1調(diào)控信號通路的傳導(dǎo)最終影響鞏膜的重塑過程，并借此參與近視的形成過程。雖然目前大量國內(nèi)外研究證實形覺剝奪性近視為鞏膜重塑的結(jié)果[18]，而且Scheaffel等[19]表明形覺剝奪性近視與局部視網(wǎng)膜的作用密切相關(guān)，但是其具體是如何通過局部視網(wǎng)膜信息調(diào)控的機制仍未有定論。有研究報道Smad1介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可以調(diào)控胚胎發(fā)育和細胞環(huán)境穩(wěn)態(tài)[20]，同時大量研究發(fā)現(xiàn),在小鼠及其它動物,幼年改變其視覺環(huán)境則容易誘導(dǎo)出近視，所以考慮到在實驗性近視研究中環(huán)境是一個很好的可控制因素，我們大膽猜測能否在幼年時期從基因水平或者細胞水平上調(diào)節(jié)Smad1的表達來達到近視的防治作用，在今后的研究工作中我們將做進一步的探索。

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DOI:10.3980/j.issn.1672-5123.2016.4.07

收稿日期：2016-01-11 修回日期： 2016-03-16

通訊作者：楊先，博士，教授，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師，研究方向：小兒斜視、弱視.yangxian_zhao@126.com

作者簡介：崔倩，碩士研究生，研究方向：小兒斜視、弱視。

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(No.81300790)
作者單位：(266003)中國山東省青島市，青島大學(xué)附屬醫(yī)院眼科

目的：通過建立C57BL/6小鼠形覺剝奪性近視模型，探究Smad1在近視形成中的作用機制。

方法：將60只3周齡C57BL/6小鼠隨機分為實驗組和正常對照組(NC)，包括形覺剝奪3wk組(FDM 3W，n=20)，形覺剝奪4wk組(FDM 4W，n=20)，F(xiàn)DM3W正常對照組(FDM 3W-NC，n=10)和FDM4W正常對照組(FDM 4W-NC，n=10)，實驗組右眼遮蓋，左眼自然暴露作為自身對照，正常對照組不予任何處理。在實驗3wk及4wk時檢測所有小鼠屈光狀態(tài)，HE染色觀察鞏膜及視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)變化，免疫組織化學(xué)方法及實時熒光定量PCR觀察Smad1在視網(wǎng)膜中的表達情況。

結(jié)果：(1)自身對照眼和正常對照組呈生理性遠視化發(fā)展，F(xiàn)DM3W、FDM4W實驗眼均呈相對近視化發(fā)展，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；(2)與自身對照組及正常對照組比較，F(xiàn)DM3W、FDM4W實驗眼鞏膜及視網(wǎng)膜明顯變?。粚嶒炑垡暰W(wǎng)膜中Smad1表達明顯下降，差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

結(jié)論：小鼠形覺剝奪性近視眼視網(wǎng)膜(尤其是內(nèi)核層及內(nèi)叢狀層)中Smad1的表達呈下調(diào)趨勢，Smad1極有可能通過轉(zhuǎn)導(dǎo)視網(wǎng)膜信號參與了近視發(fā)生發(fā)展過程。