HPLC測(cè)定連梔礬溶液中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量

袁學(xué)剛，王戰(zhàn)國(guó)，胡慧玲，楊向東，鄒亮，余騰江，4，劉巧

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HPLC測(cè)定連梔礬溶液中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量

袁學(xué)剛1，王戰(zhàn)國(guó)2，胡慧玲3，楊向東1，鄒亮2，余騰江1，4，劉巧3

[摘要]目的：建立快速測(cè)定連梔礬溶液中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和鹽酸小檗堿含量的HPLC方法。方法：色譜柱為ChromstarTM C(18)色譜柱(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-含0.1 ％三乙胺和0.1 ％甲酸的水溶液（30:70，V/ V）；檢測(cè)波長(zhǎng)345 nm，柱溫30 ℃，流速0.8 mL．min(-1)。進(jìn)樣量20 μL。結(jié)果：連梔礬溶液樣品中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和鹽酸小檗堿在12 min 內(nèi)達(dá)到分離，峰形尖銳對(duì)稱。鹽酸小檗堿在 2.82～44.91 μg．mL(-1)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為97.95％。七批次連梔礬溶液中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和鹽酸小檗堿含量以鹽酸小檗堿計(jì)，分別為0.126 ± 0.019，0.167 ± 0.029，0.140 ± 0.018和0.618 ± 0.079 mg．mL(-1)。結(jié)論：建立的HPLC方法高效、準(zhǔn)確，經(jīng)濟(jì)，精密度好，靈敏度高，可用于連梔礬溶液中表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和鹽酸小檗堿的同時(shí)快速測(cè)定分析。

[關(guān)鍵詞]高效液相色譜；連梔礬溶液；表小檗堿；黃連堿；巴馬??；鹽酸小檗堿

[作者單位]1.成都肛腸?？漆t(yī)院，四川 成都 610037；2.成都大學(xué)醫(yī)學(xué)院（護(hù)理學(xué)院），四川 成都 610106；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137；4.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)院，四川 瀘州 646000

“連梔礬溶液”出自我國(guó)著名中醫(yī)肛腸病學(xué)專家黃濟(jì)川先生的臨床效驗(yàn)方，為成都肛腸?？漆t(yī)院的醫(yī)院效驗(yàn)制劑（川藥制字Z 20080191）。制劑由黃連、梔子、白礬等藥組成，經(jīng)古法工藝制備而成，常用于慢性潰瘍性直腸炎[1-4]、肛漏[5]、肛門墜脹[6-7]、肛周膿腫[8-10]和肛門尖銳濕疣[11]等肛腸科疾病的臨床治療和預(yù)防，且療效顯著。鑒于該醫(yī)院制劑的現(xiàn)有質(zhì)量控制方法僅僅采用薄層色譜法開(kāi)展黃連藥材的定性控制，迫切需要開(kāi)展定量質(zhì)量控制分析研究，以保障醫(yī)院制劑的質(zhì)量。本文采用高效液相色譜法（HPLC）進(jìn)行制劑中的鹽酸小檗堿及相關(guān)成分的含量測(cè)定方法研究，研究結(jié)果可為連梔礬溶液質(zhì)量控制提供參考。

1　儀器與試藥

Agilent 1100 高效液相色譜儀（HPLC），包括4元泵系統(tǒng)、全自動(dòng)脫氣單元、VWD 檢測(cè)器單元和Agilent 1100 色譜工作站等（Agilent Techologies，USA）；SB-300 DTY型數(shù)控超聲儀（寧波新芝生物科技有限公司）；WSD-II型超純水系統(tǒng)（成都威思達(dá)智能科技有限公司）。

鹽酸小檗堿（98.14％，NO.0713-9906），購(gòu)自中國(guó)藥品食品檢定研究院；乙腈、甲酸為色譜純，其余試劑均為分析純。7批次連梔礬溶液（批號(hào)為：20120201，20121001，20121101，20130201，20131001，20131101，20131201）由成都肛腸?？漆t(yī)院提供。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱，ChromstarTMC18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（每1000mL含1mL三乙胺，1mL甲酸）為30:70（V/V）；檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm；流速：0.8 mL．min-1，柱溫：30℃。

2.2對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備

取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱定（5.72mg），置于50 mL棕色量瓶中，加入甲醇約45 mL，超聲處理 15 min（100 Hz），室溫放置10 min后用甲醇定容至刻度，得鹽酸小檗堿對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（112.272 μg．mL-1）。

2.3供試品溶液的制備

將7批不同批號(hào)（YP1-YP7）的連梔礬溶液（n=3），分別精密量取連梔礬溶液0.5 mL，置入25mL棕色量瓶中，加入甲醇定容至25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理15 min（100 Hz），放置冷卻后，用甲醇補(bǔ)足重量，分別用1mL樣品溶液過(guò)0.45μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.4線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液4 mL，置 10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇約 4 mL，超聲處理 5 min，混勻，冷卻后，用甲醇定容至刻度，得1號(hào)對(duì)照品溶液（S1）；采用倍數(shù)稀釋法，精密量取S1對(duì)照品溶液5 mL，置 10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇約 4 mL，超聲處理 5 min，混勻，冷卻后，用甲醇定容至刻度，得2號(hào)對(duì)照品溶液（S2）；精密量取S2對(duì)照品溶液5 mL，置 10 mL 棕色量瓶中，加入甲醇約4 mL，超聲處理 5 min，混勻，冷卻后，用甲醇定容至刻度，得3號(hào)對(duì)照品溶液（S3）；按上法，依次獲得S4～S5。S1-S5對(duì)照品溶液分別過(guò) 0.2 μm 微孔濾膜后，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜峰。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y＝88.243 X＋43.48，r＝0.9999；鹽酸小檗堿在 2.82～44.91 μg．mL-1濃度范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.5系統(tǒng)適應(yīng)性考察

選擇3號(hào)對(duì)照品溶液（S3），連梔礬溶液供試品溶液（樣品4，生產(chǎn)批號(hào)：20130201），按上述色譜條件進(jìn)樣分析，記錄其色譜圖（圖1）。鹽酸小檗堿峰形尖銳對(duì)稱，保留時(shí)間約為9.5 min，與其他色譜峰的分離度大于1.5，理論塔板數(shù)大于5000，拖尾因子符合分析要求，供試品溶液中其它物質(zhì)不干擾鹽酸小檗堿的測(cè)定。同時(shí)表小檗堿、黃連堿和巴馬汀與鹽酸小檗堿的相對(duì)色譜峰位置如圖1所示，分別由峰2，3和4表示。

圖1　供試品溶液（YP4-1）和對(duì)照品溶液(S3)的HPLC色譜圖

2.6精密度試驗(yàn)

選擇對(duì)照品溶液（S3），按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，分別連續(xù)進(jìn)樣 5 次，記錄色譜圖，記錄鹽酸小檗堿峰面積數(shù)據(jù)，其峰面積的RSD為3.23％，表明精密度良好。

2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品1溶液，在室溫（21 ℃）條件下分別于0，4，8，16，24 h 按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄鹽酸小檗堿峰面積數(shù)據(jù)，其峰面積的RSD為3.76 ％，表明供試品溶液在24 h內(nèi)的穩(wěn)定性較好。

2.8重現(xiàn)性試驗(yàn)

取樣品1，按供試品溶液制備方法，平行制備供試品溶液5份，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，記錄鹽酸小檗堿的峰面積，計(jì)算得鹽酸小檗堿的含量為0.735 ± 0.033 mg．mL-1，鹽酸小檗堿含量的RSD為4.48 ％，表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.9加樣回收率試驗(yàn)

取重現(xiàn)性用試驗(yàn)樣品1共5份，每份精密吸取0.25 mL，分別精密加入S1號(hào)鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液溶液4mL (179.63 μg)，按照“2.3 供試品溶液的制備”項(xiàng)下制備樣品，按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算鹽酸小檗堿含量。加樣回收率按如下公式計(jì)算，即（測(cè)得含量-已知樣品中的含量）/加入對(duì)照品量×100％，結(jié)果顯示，鹽酸小檗堿的平均回收率為 99.49 ％，RSD為2.33 ％，表明方法加樣回收率符合要求。

2.10樣品含量測(cè)定

采用所建立的HPLC方法分別測(cè)定7批連梔礬溶液中鹽酸小檗堿的含量及表小檗堿、黃連堿和巴馬汀的相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　連梔礬溶液中的表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量測(cè)定結(jié)果(n＝3)

含量測(cè)定結(jié)果表明，7批連梔礬溶液樣品中鹽酸小檗堿的表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和鹽酸小檗堿的含量未見(jiàn)明顯差異，表明7批次樣品的質(zhì)量差異不顯著。生產(chǎn)批次靠后的樣品7的主要成分含量比其他批次略微高些，但不具備統(tǒng)計(jì)學(xué)差異意義，初步表明樣品的制劑穩(wěn)定性較好。

3　討論

試驗(yàn)參照文獻(xiàn)方法[12～13]，以連梔礬溶液中君藥黃連的主要成分鹽酸小檗堿為方法學(xué)指標(biāo)，通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相組成與比例、檢測(cè)波長(zhǎng)、流速、柱溫等色譜條件，達(dá)到在較短的時(shí)間（12 min）內(nèi)快速分離并測(cè)定鹽酸鹽酸小檗堿及其相關(guān)成分包括表小檗堿、黃連堿、巴馬汀的含量。論文建立的HPLC方法快速、精密度高、重現(xiàn)性好，可用于醫(yī)院制劑連梔礬溶液的定量控制，為其臨床療效的發(fā)揮提供重要保障。試驗(yàn)中，通過(guò)建立的分析方法，對(duì)經(jīng)一代名醫(yī)黃濟(jì)川先生的制備方法和技術(shù)制備的近2年的“連梔礬溶液”進(jìn)行包含表小檗堿、黃連堿、巴馬汀和鹽酸鹽酸小檗堿等成分的分析研究，結(jié)果顯示出成分含量差異不顯著，這在一定程度上表明該醫(yī)院制劑制備工藝優(yōu)良且質(zhì)量較穩(wěn)定。

[參考文獻(xiàn)]

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（責(zé)任編輯：何瑤）

Quantitative analysis of epiberberine, coptisine, palmatine and berberine in Lianzhifan Solution by HPLC

YUAN Xuegang1, WANG Zhan-guo2, HU Hui-ling3, YANG Xiang-dong1, ZOU Liang2, YU Teng-jiang1, 4, LIU Qiao3
(1.Chengdu Anorectal Hospital, Chengdu 610037 Sichuan;2.School of Basic Medical Sciences ＆ Nursing, Chengdu University, Chengdu 610106 Sichuan;3.Pharmacy College of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611730 Sichuan; 4.Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000 Sichuan)

[Abstract]Objective: To establish a HPLC method for quantitative analysis of epiberberine, coptisine, palmatine and berberine in Lianzhifan solution.Method: HPLC separation was performed on a Chromstar TM C(18)column (4.6 mm × 250 mm，5 μm) with 0.8 mL．mL(-1)mobile phase, which consisted of acetonitrile-water (0.1％ triethylamine and 0.1％ formic acid, v/v= 30:70).And the detection was set at 345 nm.Result: Epiberberine, coptisine, palmatine and berberine in Lianzhifan solution were separated well in 12 min.The linearity range of berberine was 2.82～44.91 μg．mL(-1)with high linear regression constant.The average recovery was 97.95％.The contents of epiberberine, coptisine, palmatine and berberine of 7 batches Lianzhifan solution were 0.126 ± 0.019, 0.167 ± 0.029, 0.140 ± 0.018, 0.618 ± 0.079 mg．mL(-1).Conclusion: The established HPLC method was efficient, accurate, economical, good precision and high sensitivity.It can be used for rapid quantitative analysis of epiberberine, coptisine, palmatine and berberine in Lianzhifan solution.

[Key words]HPLC; Lianzhifan solution; epiberberine; coptisine; palmatine; berberine

[收稿日期]2015-11-11

[通訊作者]王戰(zhàn)國(guó)，博士，講師，從事中醫(yī)藥代謝組學(xué)研究Email:wangzhanguo@scu.edu.cn

[作者簡(jiǎn)介]袁學(xué)剛，碩士，副主任醫(yī)師，從事中醫(yī)肛腸病臨床研究 Tel:13880484566Email: 14472543@qq.com

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(81403178)；四川省科技廳項(xiàng)目(2015SZ0039、2015FZ0045、2013JY0194)；成都市衛(wèi)生局項(xiàng)目(20140301)

[中圖分類號(hào)]R 283.6

[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A

[文章編號(hào)]1674-926X(2016)01-010-03