附子生物堿脫毒前后對(duì)小菜蛾室內(nèi)毒力活性比較研究

白雪　康曉慧　楊隨莊等

摘 要 通過對(duì)附子生物堿進(jìn)行脫毒處理，將雙酯型附子生物堿水解為單酯型附子生物堿，分別測定了脫毒前后附子生物堿對(duì)小菜蛾的室內(nèi)毒力活性，包括拒食活性、胃毒活性和生長抑制活性.拒食活性中，非選擇性拒食率脫毒前后的毒力回歸曲線分別為y=-3.312+2.014X， y=-1.666+1.716X，AFC50分別為0.651和0.971 g/L.選擇性拒食率的毒力回歸曲線分別為y=-0.859+1.141X，y=-1.718+1.431X，AFC50為0.753和1.201 g/L.胃毒活性中，死亡率的毒力回歸曲線分別為y=-1.296+1.838X， y=-1.386+1.379X， LC50分別為0.705和1005 g/L.生長抑制活性中，生長抑制率的毒力回歸曲線分別為y=-1.283+1.73X， y=-1.24+1.316X， AGC50分別為0.742和0.942 g/L.分析以上三種活性可知，脫毒前附子生物堿對(duì)小菜蛾的殺蟲活性主要體現(xiàn)在拒食活性上，其次為生長抑制活性和胃毒活性；脫毒后殺蟲活性有所降低，但未全部喪失，尤其在拒食活性上表現(xiàn)明顯.

關(guān)鍵詞 附子生物堿；小菜蛾；毒力回歸曲線

中圖分類號(hào) S435.654文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 10002537（2016）02002906

Comparative Study on the Toxicity Activity to Plutella Xylostella by

Aconite Alkaloids Both before and after Detoxification in Laboratory

BAI Xue1， KANG Xiaohui1*， YANG Suizhuang1， YUAN Xiaohong1， ZHOU Qiang2

（1.College of Life Science and Engineering， Southwest University of Science and Technology， Mianyang 621010， China；

2.Agricultural Service Center of Yongming Town， Mianyang 621038， China）

Abstract Based on the detoxification treatment， making the double ester type of aconite alkaloids hydrolyzed single ester type， we have determined the antifeedant activity， stomach toxicity and growth inhibitory activity by the aconite alkaloids before and after partial detoxification. For the antifeedant activity， the regression curve of the non selective antifeedant rate before and after detoxification is y=-3.312+2.014X， y=-1.666+1.716X， with AFC50 equal to 0.651 and 0.971 g/L， respectively. The regression curve of the selective antifeedant rate is y=-0.859+1.141X， y=-1.718+1.431X， with AFC50 0.753 and 1.201 g/L， respectively. For the gastric toxicity， the regression curve of mortality is y=-1.296+1.838X， y=-1.386+1.379X， with LC50 as 0.705 and 1.005 g/L， respectively. For the growth inhibition activity， the growth inhibition rate of the regression curve is y=-1.283+1.73X， y=-1.24+1.316X， with AGC50 to be 0.742 and 0942 g/L， respectively. It can be seen from above results about the three kinds of activity that aconite alkaloids has a strong insecticidal effect before detoxification， which is mainly reflected by the antifeedant inhibition followed by the gastric toxicity. The activity is markedly reduced after detoxification， though not all of it is completely diminished， especially for the antifeedant activity.

Key words aconite alkaloids； Plutella xylostella； toxicity regression curve

附子為毛茛科植物烏頭（Aconitum carmichaeli Debx.），其活性成分含生物堿，具有很強(qiáng)的藥理作用.很多學(xué)者對(duì)附子進(jìn)行了研究，大多集中在對(duì)附子生物堿的提取及其成分分析上，而對(duì)其應(yīng)用價(jià)值鮮見研究.劉倩等[1]采用單因素實(shí)驗(yàn)篩選出了最佳的TLC條件，完善了附子生物堿的TLC檢查方法；楊潔紅等[2]將附子生物堿同甘草的活性物質(zhì)結(jié)合，對(duì)兩者結(jié)合所產(chǎn)生的抗炎作用機(jī)制進(jìn)行了探討；陳平等[3]采用液相色譜質(zhì)譜的方法對(duì)附子生物堿的煎煮減毒機(jī)理進(jìn)行了研究；楊昌林等[4]利用蒸制和烘制兩種方法對(duì)附子生物堿的成分含量進(jìn)行了系統(tǒng)研究.

小菜蛾是十字花科蔬菜主要害蟲之一，因其易產(chǎn)生抗藥性及耐藥性，成為了目前許多學(xué)者研究熱點(diǎn)之一.羅雁婕等[5]對(duì)云南省及國內(nèi)外小菜蛾抗藥性的研究概況進(jìn)行了系統(tǒng)分析；邢靜等[6]采用葉片藥膜法，探討了亞致死濃度氯蟲苯甲酰胺對(duì)小菜蛾解毒酶活性和藥劑敏感的影響；程英等[7]選取貴陽、安順及遵義作為試驗(yàn)點(diǎn)，就小菜蛾田間種群對(duì)殺蟲劑的抗藥性進(jìn)行了監(jiān)測；劉玉娣等[8]測定了不同蟲齡小菜蛾過氧化氫酶、過氧化物酶與耐藥性之間的關(guān)系.此外，很多學(xué)者還將研究重點(diǎn)放在了防治措施上面.李振宇等[9]對(duì)比了不同性誘劑誘芯對(duì)小菜蛾的引誘效果；孔國順等[10]選取了8種生物農(nóng)藥對(duì)小菜蛾進(jìn)行了藥效實(shí)驗(yàn)，在實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上篩選出了較為有效的生物農(nóng)藥；魯喜榮等[11]選取了克蛾寶、銳農(nóng)丹等6種乳油制劑對(duì)小菜蛾進(jìn)行田間防控，對(duì)每種農(nóng)藥的藥效作用進(jìn)行了分析；陸信任等[12]研究了15%的茚蟲威乳油對(duì)小菜蛾的防治效果.

本文選擇小菜蛾作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用附子生物堿作為防治藥劑，其主要成分為烏頭類生物堿，結(jié)構(gòu)可分為單酯型和雙酯型[13]，由于雙酯型生物堿毒性較大，在實(shí)際應(yīng)用中受到了很多限制，基于此，本文將雙酯型生物堿轉(zhuǎn)變?yōu)閱熙バ蜕飰A，比較了脫毒前后附子生物堿對(duì)小菜蛾室內(nèi)毒力活性的變化，并對(duì)其作用機(jī)理進(jìn)行了初步分析，這對(duì)附子生物堿的實(shí)際應(yīng)用具有一定的推廣價(jià)值，并且能為植物源農(nóng)藥的開發(fā)提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

供試蟲源源于四川省綿陽市三臺(tái)縣永明鎮(zhèn)油菜示范基地，于西南科技大學(xué)東七實(shí)驗(yàn)樓進(jìn)行飼養(yǎng).飼養(yǎng)條件為室溫25 ℃，相對(duì)濕度70%，L/D=14/10，幼蟲飼養(yǎng)油菜幼苗，成蟲飼養(yǎng)20%的蜂蜜水，實(shí)驗(yàn)期間選取2～3齡期健康幼蟲進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.2 附子生物堿的制備

附子于2014年8月采于四川省綿陽市江油縣，自然晾干后用粉碎機(jī)粉碎為干粉，用95%乙醇提取8 h，用旋蒸儀蒸發(fā)至膏狀，放入深色廣口瓶中置于4 ℃下保存?zhèn)溆?將供試提取物用蒸餾水加熱溶解，分為0.1，0.3，0.5，0.8，1.0 g/L 5個(gè)梯度濃度.

1.3 附子生物堿的脫毒

將提取物加入到1，4二氧六環(huán)和水的混合液（體積比9∶1）中，在95 ℃下利用水浴加熱回流約10 h，即可將雙酯型生物堿轉(zhuǎn)化為單酯型.

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 附子生物堿脫毒前后對(duì)小菜蛾幼蟲的拒食活性 參照Ismail等[14]的方法，，將潔凈的甘藍(lán)葉制成2×3 cm2大小，分別于配好的藥液中浸置10 s，通風(fēng)處自然陰干，用蒸餾水作對(duì)照.將晾干的葉片放入直徑70 cm 的培養(yǎng)皿，接入大小一致的3齡幼蟲，每個(gè)處理3組重復(fù)，每組重復(fù)10 頭試蟲，轉(zhuǎn)入恒溫培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為（25±1）℃，相對(duì)濕度60%～70%，光暗周期比L/D=16/8. 24 h后用坐標(biāo)紙測量其取食面積，計(jì)算出拒食率.計(jì)算公式如下：

選擇性拒食率（%）=（對(duì)照組取食量-處理組取食量）/（對(duì)照組取食量+處理組取食量）×100，

非選擇性拒食率（%）=（對(duì)照取食量-處理取食量）/對(duì)照取食量×100.

1.4.2 附子生物堿脫毒前后對(duì)小菜蛾幼蟲的胃毒活性 參照1.4.1的方法在培養(yǎng)皿中接入事先饑餓了2 h的生長一致的2齡幼蟲，每天更新葉片，記錄死亡蟲數(shù)，24 h記錄一次，連續(xù)記錄7天.計(jì)算其死亡率：死亡率（%）=死亡蟲數(shù)/總頭數(shù)×100.

1.4.3 附子生物堿脫毒前后對(duì)小菜蛾幼蟲的生長抑制活性 參照1.4.1的方法將2齡幼蟲接入培養(yǎng)皿前，對(duì)每頭幼蟲稱取體質(zhì)量.每天稱一次，并更換新處理葉片，堅(jiān)持記錄7 d.死蟲不稱體質(zhì)量.計(jì)算生長發(fā)育抑制率.

體質(zhì)量增長率（%）=（處理后體質(zhì)量-處理前體質(zhì)量）/處理前體質(zhì)量×100，

生長發(fā)育抑制率（%）=（對(duì)照體質(zhì)量增長率-處理體質(zhì)量增長率）/對(duì)照體質(zhì)量增長率×100.

1.5 數(shù)據(jù)處理

用EXCLE 2015對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)處理，SPSS 21.0進(jìn)行顯著性分析和回歸分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 附子生物堿脫毒前后對(duì)小菜蛾幼蟲的拒食活性

從非選擇拒食率可知，脫毒前各濃度間拒食率均呈顯著性差異，處理濃度加大，拒食率明顯升高，最高達(dá)到76%，這表明高濃度下附子生物堿對(duì)小菜蛾具有較強(qiáng)的非選擇性拒食活性；脫毒后，當(dāng)濃度加大到0.5 g/L時(shí)，各濃度開始出現(xiàn)顯著性差異，拒食率雖然較脫毒前有所降低，但最高達(dá)到53%.對(duì)于選擇性拒食率，脫毒前后各濃度間差異不如非選擇性拒食率明顯，選擇性拒食率在未脫毒前最高為59%，相比非選擇性拒食率有所降低.這表明附子生物堿對(duì)小菜蛾的拒食活性無論是在脫毒前還是脫毒后，非選擇性拒食活性都高于選擇性拒食活性.結(jié)合兩者的毒力回歸曲線分析，脫毒前的拒食中濃度都低于脫毒后的拒食中濃度，非選擇性拒食中濃度低于選擇性拒食中濃度.非選擇性拒食率脫毒前后的回歸曲線分別為y=-3.312+2014X， y=-1.666+1.716X，非選擇拒食中濃度分別為0.651和0.971 g/L.選擇性拒食率回歸曲線分別為y=-0.859+1.141X， y=-1.718+1.431X，選擇性拒食中濃度為0.753和1.201 g/L.具體見表1和表2.

2.2 附子生物堿脫毒前后分別對(duì)小菜蛾的胃毒作用

對(duì)7天內(nèi)小菜蛾的死亡率進(jìn)行分析，死亡率最高為63%，整體死亡率偏低，表明附子生物堿對(duì)小菜蛾的胃毒作用不明顯.單獨(dú)分析脫毒前，處理前期，各濃度間的死亡率顯著性差異不明顯，第五天開始，濃度達(dá)到0.8 g/L的幼蟲死亡率超過了50%，并且與其他濃度間呈現(xiàn)顯著性差異.脫毒后，附子生物堿對(duì)小菜蛾的胃毒活性明顯降低，低濃度下小菜蛾從第五天開始才出現(xiàn)少量死亡，并且死亡率普遍未超過50%.對(duì)第七天小菜蛾的死亡情況進(jìn)行回歸分析，其毒力回歸曲線分別為y=-1.296+1.838X， y=-1.386+1.379X， 脫毒后小菜蛾的死亡率相比脫毒前變化趨勢緩慢.半致死濃度分別為0.705和1005 g/L.脫毒后的LC50超過了1 g/L，表明脫毒后的附子生物堿對(duì)小菜蛾的胃毒作用明顯減弱，見表3～表5.

2.3 附子生物堿脫毒前后分別對(duì)小菜蛾的生長抑制作用

結(jié)合表6和表7分析，附子生物堿對(duì)小菜蛾體質(zhì)量增長有一定的抑制作用.脫毒前，前兩天各濃度之間的抑制率不顯著.從第四天起，高濃度與低濃度開始呈現(xiàn)出顯著性差異，拒食率也逐漸增大.第七天，當(dāng)濃度為0.8和1.0 g/L時(shí)，生長抑制率分別達(dá)到54.7%和67.6%.脫毒后，小菜蛾幼蟲的生長抑制率有所降低，各濃度下的生長抑制率顯著性不如脫毒前明顯，在第六天和第七天時(shí)，高濃度（大于0.5 g/L）與低濃度呈現(xiàn)出了一定差異性，生長抑制率最高為52.22%，脫毒前附子生物堿對(duì)小菜蛾幼蟲生長抑制中濃度為0.742 g/L，明顯低于脫毒后的0.942 g/L.毒力回歸曲線分別為y=-1.283+1.73X， y=-1.24+1.316X.

3 小結(jié)與討論

化學(xué)藥劑的無限制施用導(dǎo)致小菜蛾的抗藥性不斷多元化，而小菜蛾一旦對(duì)一種農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性以后，也會(huì)對(duì)其他未使用過的農(nóng)藥產(chǎn)生交互的抗性[15].本文選取的生物堿來源于附子，已有很多文獻(xiàn)報(bào)道過其具有拒食、觸殺、生長發(fā)育抑制、降低適應(yīng)能力、降低生殖力等多種生物活性，正是由于其多種特異活性從而使得害蟲很難產(chǎn)生抗藥性[16].同樣，附子生物堿結(jié)構(gòu)中的雙酯型生物堿也被一些文獻(xiàn)證明其具有一定毒性，可能會(huì)對(duì)人體造成影響.本文據(jù)此對(duì)供試藥劑進(jìn)行了脫毒處理，將雙酯型生物堿水解為單酯型生物堿，分別對(duì)照了附子生物堿脫毒前后對(duì)小菜蛾的拒食活性、胃毒活性及生長抑制活性.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3種活性中拒食活性最高，脫毒前非選擇性拒食率和選擇性拒食率最高分別達(dá)到76%和59%，而且在此過程中出現(xiàn)了幼蟲死亡現(xiàn)象，這可能是因?yàn)闊o法進(jìn)食而導(dǎo)致的.而在脫毒后，兩者拒食率有所降低，分別為53%和36%，這表明對(duì)附子生物堿進(jìn)行脫毒后，仍然對(duì)小菜蛾具有一定的拒食活性，并且其效果主要體現(xiàn)在非選擇性拒食率上.脫毒前后非選擇性拒食率的獨(dú)立回歸曲線分別為y=-3.312+2014X， y=-1.666+1.716X，AFC50分別為0.651和0.971 g/L.選擇性拒食率回歸曲線分別為y=-0.859+1.141X，y=-1.718+1.431X，AFC50分別為0.753和1.201 g/L.

對(duì)胃毒作用進(jìn)行分析，未脫毒時(shí)，小菜蛾幼蟲死亡率最高僅達(dá)到63%，并且是在最高濃度施用第7天時(shí)所呈現(xiàn)的效果，其他時(shí)間死亡率普遍偏低.而脫毒后死亡率大幅降低，基本未超過50%.這表明附子生物堿對(duì)小菜蛾的胃毒作用微效而且緩慢.脫毒前后的毒力回歸曲線分別為y=-1.296+1.838X， y=-1386+1.379X， 半致死濃度在脫毒前后普遍偏高，分別為0.705和1.005 g/L，這表明附子生物堿對(duì)小菜蛾的胃毒作用不太明顯.

對(duì)生長抑制作用進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)前期，各濃度生長抑制率間顯著性差異表現(xiàn)不明顯，生長抑制率普遍偏低，但從第四天開始，高濃度與低濃度間呈現(xiàn)出一定差異性，脫毒前生長抑制率最高為67.79%，脫毒后最高為52.22%，這表明附子生物堿對(duì)小菜蛾具有一定的生長抑制活性.脫毒前后死亡率的毒力回歸曲線分別為y=-1.283+1.73X， y=-1.24+1.316X， AGC50分別為0.742和0.942 g/L.

綜合以上分析結(jié)果，附子生物堿脫毒前對(duì)小菜蛾具有較強(qiáng)的殺蟲活性，且主要體現(xiàn)在拒食活性上，拒食活性中非選擇拒食活性高于選擇性拒食活性，其次為生長抑制活性，胃毒活性最弱.在拒食活性中，介于本文只測定了24 h的拒食面積，若測定48 h甚至72 h的拒食，其拒食效果還有待研究.而將雙酯型生物堿水解為單酯型生物堿后，殺蟲活性有所減弱，但從拒食活性和生長抑制活性中可知，脫毒后的拒食率和生長抑制率均超過了50%，這表明脫毒后的生物堿在一定濃度下可以進(jìn)一步利用.

從3種活性的實(shí)驗(yàn)效果可以看出，附子生物堿對(duì)小菜蛾的作用方式是間接性的，主要是通過幼蟲接觸藥劑后產(chǎn)生拒食反應(yīng)，減少取食甚至停止進(jìn)食，迫使其生長發(fā)育得到抑制，最后導(dǎo)致死亡.本研究由于條件限制，只在室內(nèi)進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，若要將附子生物堿真正推廣到實(shí)際應(yīng)用中，還需利用田間試驗(yàn)進(jìn)一步探究不同大田氣候環(huán)境下附子生物堿對(duì)小菜蛾的施用效果，在進(jìn)行大田實(shí)驗(yàn)時(shí)，可考慮將其與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)合或者交替施用，充分發(fā)揮兩者的優(yōu)勢作用，降低防治成本，延緩小菜蛾產(chǎn)生抗藥性.

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（編輯 WJ）