B7-H1在卵巢癌組織中表達(dá)的臨床意義

徐　梅　張　夢(mèng)　劉　洋　張　蓓　尹鳳玲　劉　霞　卓世超

221009 江蘇省徐州市中心醫(yī)院

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B7-H1在卵巢癌組織中表達(dá)的臨床意義

徐梅張夢(mèng)劉洋張蓓尹鳳玲劉霞卓世超

221009 江蘇省徐州市中心醫(yī)院

【摘要】目的探討B(tài)7-H1在卵巢癌組織中表達(dá)的臨床意義。方法將收治的112例上皮性卵巢癌及10例良性卵巢囊腫的組織蠟塊制作成組織芯片，免疫組化檢測(cè)芯片協(xié)同刺激分子B7-H1的表達(dá)情況，χ2檢驗(yàn)B7-H1表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)及多因素 COX回歸。結(jié)果B7-H1在良性卵巢囊腫中均為低表達(dá)，在卵巢癌組織中高表達(dá)率為55.4%(62/112)；其表達(dá)水平與患者年齡、組織類型、細(xì)胞分化、腫瘤大小及是否合并CA125升高無(wú)關(guān)(P>0.05)，而與患者FIGO分期及是否轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)；B7-H1高表達(dá)組與低表達(dá)組患者無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)和總生存期(overall survival，OS)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為24.9和17.51，P值均<0.001)。COX回歸分析表明，B7-H1表達(dá)水平和FIGO分期是影響患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。結(jié)論卵巢癌組織中B7-H1的表達(dá)水平與預(yù)后差和生存期短相關(guān)，可為卵巢癌的免疫靶向治療提供思路。

【關(guān)鍵詞】卵巢癌；協(xié)同刺激分子；B7-H1

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:380～383)

隨著腫瘤免疫學(xué)及現(xiàn)代生物科技的發(fā)展，腫瘤免疫治療已經(jīng)取得突破性的進(jìn)展。B7家族是T細(xì)胞活化的重要協(xié)同刺激分子，B7-H1也稱PD-L1(programmed death-1-ligand 1)，是該家族的第三個(gè)成員，該分子在誘導(dǎo)腫瘤特異性T細(xì)胞凋亡和腫瘤免疫逃逸過(guò)程中具有重要作用[1]。而B7-H1在卵巢癌中的作用目前研究尚少，值得探討。我們收集與卵巢癌相關(guān)的臨床資料，擬合多因素COX模型分析B7-H1分子表達(dá)對(duì)卵巢癌患者復(fù)發(fā)或死亡風(fēng)險(xiǎn)的影響，從而探討B(tài)7-H1在卵巢癌組織中表達(dá)的臨床意義，為卵巢癌的免疫靶向治療提供思路。

1材料與方法

1.1試劑

B7-H1鼠抗人多抗克隆抗體，USCNLIFE，USA，鼠/兔通用型二抗，購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司。

1.2病例資料

112例石蠟包埋組織標(biāo)本取自2005年2月至2009年12月間在我院住院手術(shù)治療的卵巢癌患者。年齡21～78歲，平均(55.1±12.5)歲；其中漿液性囊腺癌93例、粘液性囊腺癌12例、子宮內(nèi)膜樣腺癌3例、透明細(xì)胞癌4例；腫瘤大小1～4 000 cm3，平均(171.9±423.2)cm3；FIGO分期Ⅰ期26例、Ⅱ期7例、Ⅲ期72例、Ⅳ期7例；細(xì)胞分化Ⅰ級(jí)9例、Ⅱ級(jí)20例、Ⅲ級(jí)78例、交界性腫瘤5例；腫瘤位于雙側(cè)者65例，右側(cè)24例、左側(cè)23例；82例患者血CA125水平升高；腫瘤轉(zhuǎn)移85例。所有患者術(shù)前未接受化療或放療。手術(shù)標(biāo)本取材時(shí)，癌組織均取自腫瘤原發(fā)灶。另取同期10例因良性卵巢囊腫手術(shù)切除的標(biāo)本做正常對(duì)照。

所有患者均同時(shí)滿足下列條件：術(shù)后生存期≥3個(gè)月，死亡原因是卵巢癌而非其他疾病。通過(guò)查閱住院病例、電話或登門隨訪等方式對(duì)所有患者追蹤隨訪至2014年12月。

1.3免疫組織化學(xué)染色

由上海芯超公司將采集的所有蠟塊制作成組織芯片，然后進(jìn)行Elivision TM 免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片經(jīng)脫蠟和水化后，將切片浸在檸檬酸鹽緩沖液中水浴加熱至100 ℃，持續(xù)30 min，進(jìn)行抗原修復(fù)。然后將切片冷卻浸在3%H2O2中30 min。然后用PBS浸洗3次。再加一抗B7-H1鼠抗人多抗克隆抗體，1∶400稀釋，4 ℃過(guò)夜，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。將切片在PBS中浸洗3次，然后加二抗，室溫放置30 min，用PBS洗去二抗，經(jīng)DAB顯色，蘇木精復(fù)染，0.1%鹽酸酒精分化。切片經(jīng)梯度酒精脫水干燥后用中性樹脂封片。

1.4免疫組化結(jié)果判讀

應(yīng)用Immunohistochemical Scores(IHS)法對(duì)免疫組織化學(xué)染色切片進(jìn)行評(píng)估。在200倍高倍鏡下，隨機(jī)選擇5個(gè)腫瘤區(qū)域，計(jì)數(shù)胞質(zhì)/胞膜內(nèi)有陽(yáng)性染色的腫瘤細(xì)胞個(gè)數(shù)，根據(jù)其所占比例計(jì)分。無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞占1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為分，81%～100%為4分；同時(shí)評(píng)估陽(yáng)性細(xì)胞染色的強(qiáng)弱：陰性計(jì)0分，弱陽(yáng)性計(jì)1分，中度陽(yáng)性計(jì)2分，強(qiáng)陽(yáng)性計(jì)3分。兩項(xiàng)得分的乘積即為該例病變的免疫組化評(píng)分：0為-，1～4分為+，5～8分為++，9～12分為+++。評(píng)分<4分為低表達(dá)，≥4分為高表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，B7-H1高表達(dá)組及低表達(dá)組間比較采用χ2檢驗(yàn)，生存分析采用Log-rank時(shí)序檢驗(yàn)及Kaplan-Meier生存曲線法，對(duì)B7-H1表達(dá)、細(xì)胞分化程度、轉(zhuǎn)移與否及FIGO分期及年齡多因素分析采用COX模型分析。

2結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果:B7-H1分子在10例正常卵巢囊腫中均呈低表達(dá)，在112例卵巢癌組織中高表達(dá)率為55.4%(62/112)。 且表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)中，呈棕黃色至棕褐色顆粒或團(tuán)塊。

B7-H1表達(dá)與患者年齡、組織學(xué)類型、組織分化程度、FIGO臨床分期、腫瘤大小、CA125水平及轉(zhuǎn)移與否的關(guān)系見表1。

表1　卵巢癌組織中B7-H1表達(dá)與其臨床病理參數(shù)的關(guān)系/例

Kaplan-Meier 法檢測(cè)B7-H1表達(dá)水平不同患者的PFS及OS曲線見圖1和圖2?；颊逷FS的計(jì)算起點(diǎn)為手術(shù)當(dāng)日，終點(diǎn)為患者確診為腫瘤復(fù)發(fā)或病情惡化時(shí)。OS的計(jì)算起點(diǎn)為手術(shù)當(dāng)日，終點(diǎn)為患者死亡日期或截止日期。隨訪截止日期為2014年12月31日。112例卵巢癌患者隨訪5年中，B7-H1低表達(dá)者復(fù)發(fā)率為46.0%(23/50)、死亡率為34.0%(17/50)；而高表達(dá)者復(fù)發(fā)率為82.3%(51/62)、死亡率為66.1%(41/62)；B7-H1高表達(dá)組與低表達(dá)組患者PFS[(1059.1±151.8)天 vs(2358.8±180.2)天]和OS[(1675.8±169.2)天vs(2654.1±149.4)天]比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為24.9和17.51，P值均<0.001)。

COX回歸多因素分析結(jié)果： B7-H1表達(dá)情況(B=0.98，RR=2.66，P=0.002)和FIGO分期(B=0.78，RR=2.17，P=0.03)是影響患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。

圖1　B7-H1不同表達(dá)水平患者的PFS曲線圖

圖2　B7-H1不同表達(dá)水平患者的OS曲線圖

3討論

B7-H1也稱pD-L1(programmed death ligand-1)，是1999年發(fā)現(xiàn)的B7家族成員，B7-H1基因定位于人9p24.2[2]，編碼產(chǎn)物為一個(gè)含290個(gè)氨基酸的I型跨膜糖蛋白，B7-H1的受體為PD-1(CD279)，PD-1最初是通過(guò)削減雜交技術(shù)，從小鼠凋亡期的雜交瘤及造血祖細(xì)胞系克隆得到的。由于其和細(xì)胞凋亡相關(guān)故被命名為程序性死亡-1(programmed death-1,PD-1)。人類PD-1基因編碼含288個(gè)氨基酸的I型跨膜糖蛋白，其細(xì)胞外區(qū)為免疫球蛋白樣IgV區(qū)，細(xì)胞質(zhì)區(qū)含有2個(gè)酪氨酸基序，N端有1個(gè)免疫受體酪氨酸依賴抑制基序(immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif，ITIM)，C端有1個(gè)免疫受體酪氨酸轉(zhuǎn)換基序(immunoreceptor tyrosine switch motif，ITSM)，這兩個(gè)酪氨酸殘基磷酸化后可分別與酪氨酸磷酸酶 SHP-1 和 SHP-2結(jié)合，下調(diào) TCR 和 BCR 下游激活信號(hào)的磷酸化，轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制性信號(hào)，發(fā)揮抑制免疫應(yīng)答的作用[2-4]。這種表達(dá)特點(diǎn)可能與保護(hù)組織免受不必要的炎性反應(yīng)或免疫反應(yīng)有關(guān)。近些年的研究發(fā)現(xiàn)，在許多人類腫瘤組織(如胃癌[5-6]、食管癌[7]、胰腺癌[8]、肺癌[9]、卵巢癌[10]、膀胱癌[11]、腎細(xì)胞癌[12]、淋巴瘤[13]、乳腺癌[14]和白血病[15]等)中均可檢測(cè)到 B7-H1 蛋白的異常表達(dá)。

B7-H1在腫瘤組織中的表達(dá)水平和患者的臨床病理因素及預(yù)后存在顯著相關(guān)性。Ohigashi等[7]對(duì)食管癌患者腫瘤細(xì)胞B7-H1的表達(dá)水平與愈后相關(guān)性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)術(shù)前癌細(xì)胞B7-H1陽(yáng)性患者明顯比B7-H1陰性患者愈后差，1年生存率明顯降低，且癌細(xì)胞的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移發(fā)生率高。Wu等[5]對(duì)102例胃癌組織中B7-H1的表達(dá)情況和臨床病理學(xué)及預(yù)后相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，B7-H1在正常胃組織中沒(méi)有表達(dá)，在胃腺瘤中微弱表達(dá)，但在42.2%胃癌組織中強(qiáng)表達(dá)。而且，其表達(dá)程度和腫瘤大小、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的生存期相關(guān)。多因素分析顯示，B7-H1表達(dá)情況是評(píng)價(jià)胃癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。本研究檢測(cè)B7-H1在112例卵巢癌組織中的表達(dá)情況，并對(duì)患者進(jìn)行5到10年的隨訪，結(jié)果顯示B7-H1陽(yáng)性染色定位于腫瘤細(xì)胞的胞漿或(和)胞膜，在10例良性卵巢囊腫中B7-H1均為低表達(dá)，在卵巢癌中的B7-H1高表達(dá)率為55.4%，略高于于曉偉等[16]的研究結(jié)果。同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)，B7-H1的表達(dá)水平和細(xì)胞分化、腫瘤大小、是否合并CA125升高及患者年齡無(wú)明顯相關(guān)性，而和患者FIGO分期及是否轉(zhuǎn)移密切相關(guān)?；颊吲R床分期越晚或是并發(fā)轉(zhuǎn)移者，其B7-H1表達(dá)水平越高。這和Wang等[11]采用mate分析研究B7-H1在膀胱癌中表達(dá)水平得出的結(jié)論類似。Hamanishi等[10]發(fā)現(xiàn)在卵巢癌組織中B7-H1的表達(dá)水平和腫瘤組織中CD8+T的數(shù)量負(fù)相關(guān)，且多因素分析顯示，它們是患者的獨(dú)立預(yù)后因素。我們的研究顯示，B7-H1低表達(dá)者比高表達(dá)者有更長(zhǎng)的PFS和OS，高表達(dá)相對(duì)低表達(dá)有更高的復(fù)發(fā)率(82% vs 46%)和死亡率(66.1% vs 34%)。說(shuō)明卵巢癌細(xì)胞表達(dá)B7-H1與預(yù)后差和生存短有關(guān)。而COX回歸分析亦顯示，B7-H1表達(dá)水平和FIGO分期是EOC患者的獨(dú)立預(yù)后因素。

Sun等[6]成功構(gòu)建兩種鼠抗人PD-L1單克隆抗體10E10 和2H11，它們可以抑制腫瘤相關(guān)PD-L1誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡，通過(guò)共刺激分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和免疫干預(yù)途徑進(jìn)行腫瘤免疫治療具有重要價(jià)值。DC表達(dá)B7-H1本身即可限制DC處于未成熟狀態(tài)，與腫瘤細(xì)胞免疫逃逸及腫瘤進(jìn)展相關(guān)[9]，通過(guò)沉默DC細(xì)胞B7-H1的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)體內(nèi)抗腫瘤免疫的實(shí)驗(yàn)研究也獲得了肯定的結(jié)果[17]，這充分說(shuō)明B7-H1可作為激活機(jī)體抗腫瘤免疫治療的很好靶點(diǎn)。目前，該療法已被應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌的臨床試驗(yàn)治療并取得一定的成效[18]。因此，通過(guò)分子生物學(xué)手段檢測(cè)和控制卵巢癌細(xì)胞表面B7-H1分子的表達(dá)，對(duì)于卵巢癌的治療和預(yù)防具有重要意義。

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(編輯：吳小紅)

Expression and Clinical Significance of B7-H1 in Ovarian Cancer

XUMei,ZHANGMeng,LIUYang,etal.

CentralHospitalofXuzhou,Xuzhou，221009

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of B7-H1 in ovarian cancer.Methods112 biopsies from patients with epithelial ovarian cancer(EOC) and 10 specimens from ovarian benign neoplasm were processed into tissue chips.The expression of B7-H1 were detected by immunohistochemical method and its relationship with patients' clinical parameter were tested by Pearson Chi-Square.Survival curves were constructed using the Kaplan-Meier method and the log-rank test.The independent prognostic factors were evaluated by using the Cox regression model.ResultsThe B7-H1 high expression rates were 0 in benign ovarian neoplasm tissues and 55.4%(62/112) in EOC tissues.The level of B7-H1 expression was positively correlated with clinical stage and distant metastases(P<0.05).No relationship was observed between the expression of B7-H1 and age,primary tumor size,primary tumor classification,histological grade and the level of blood CA125(P>0.05).The progression-free survival(PFS) and the overall survival(OS) were significantly lower in patients with B7-H1 high expression than in those with B7-H1 low expression.Multi-variable analysis revealed that the expression of B7-H1 and the clinical stage could be regarded as the independent factor in evaluating the prognosis of EOC patients.ConclusionThe level of B7-H1 expression in EOC tissues is significantly correlated with the poor prognosis and relapse rate.B7-H1 might be a beneficial target for immunotherapy in EOC patients.

【Key words】Ovarian neoplasrn;Co-stimulator;B7-H1

(收稿日期2015-04-30修回日期 2015-10-28)

中圖分類號(hào)：R737.31

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)03-0380-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.03.010

通訊作者：徐梅

基金項(xiàng)目：徐州市醫(yī)學(xué)科研資助項(xiàng)目(編號(hào)：XWJ2011038)，徐州市中心醫(yī)院博士創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)科研資助(編號(hào)：XZB201205)