環(huán)境因子對玫煙色棒束孢IF—1106菌株孢子萌發(fā)的影響

田晶　李雅　刁紅亮　馬瑞燕

摘 要：為了了解環(huán)境因子對玫煙色棒束孢分生孢子萌發(fā)的影響，采用凹玻片懸滴等方法研究了溫度、濕度、光周期、初始pH值、紫外照射、高溫脅迫及吐溫-80濃度對玫煙色棒束孢IF-1106菌株孢子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明：玫煙色棒束孢孢子萌發(fā)的最適溫度為26 ℃左右，適溫為23～32 ℃，玫煙色棒束孢分生孢子萌發(fā)對濕度的要求較高，低于85%分生孢子不萌發(fā)。黑暗促進(jìn)孢子萌發(fā)，光照抑制孢子萌發(fā)，但光暗交替時，隨著光照時間的延長，孢子萌發(fā)率升高。孢子萌發(fā)最適pH值為5～7，用0.05%～1%的吐溫-80配制孢子懸浮液。經(jīng)過48 ℃高溫和紫外線照射處理后，玫煙色棒束孢孢子的萌發(fā)都受到很大程度的抑制。因此玫煙色棒束孢IF-1106菌株分生孢子萌發(fā)最適條件為溫度26 ℃，相對濕度95%以上，初始pH值為6，全黑暗培養(yǎng)。

關(guān)鍵詞：玫煙色棒束孢；環(huán)境因子；萌發(fā)率

中圖分類號：Q935 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.04.002

Abstract： In order to understand the effects of environmental factors on conidia germination of Isaria fumosorosea1， concave glass hanging drop and other method were used to study the effects of temperature， humidity， photoperiod， initial pH value， short-time ultraviolet radiation， heat stress and the concentration of Tween-80 on the conidia germination of Isaria fumosorosea1 IF-1106. The results showed that the optimum temperature for conidial germination was 26 ℃， the range of suitable temperature was 23～32 ℃， and the conidia germinated at a high relative humidity， when RH lowers than 85%，the conidia were ungerminative. The conidia germination rate was high under the dark， and the conidia germination rate was low under the light. Under the condition of alternating light and dark， the rate has a trend of growing with the longer light time. And the optimal pH was 5～7， 0.05%～1% Tween-80 was used to prepare the suspension. With the treatment of heat stress and short-time ultraviolet radiation， the strong inhibition in conidia germination of Isaria fumosorosea1 was exhibited. So the best condition for conidia germination was 26 ℃，RH higher than 95%， pH6 and dark.

Key words： Isaria fumosorosea1； environmental factors； conidia germination rates

玫煙色棒束孢（Isaria fumosorosea）舊稱玫煙色擬青霉（Paecilomyces fumosoroseus），是一類重要的昆蟲病原真菌。該菌地理分布廣泛，因此寄主多樣，尤其對蚜蟲、粉虱等刺吸式口器害蟲有很強(qiáng)的致病力[1-2]。

筆者在田間分離到1株玫煙色棒束孢，命名為IF-1106菌株，該菌株可以侵染煙粉虱所有蟲態(tài)，其中對煙粉虱2齡若蟲的致病力最高，因此可以做為防治煙粉虱的高效菌株[3-4]。分生孢子是病原真菌侵染寄主的基本單位，其感染寄主的關(guān)鍵是分生孢子能否成功附著在寄主表面并萌發(fā)[5]。昆蟲病原真菌在其應(yīng)用中會受到一定的環(huán)境條件如溫度、濕度的影響[6]，因此，掌握影響該玫煙色棒束孢菌株孢子萌發(fā)的環(huán)境因子，是進(jìn)一步利用該菌防治害蟲的基礎(chǔ)。為了解該菌株的分生孢子萌發(fā)特性，對該菌株在不同溫度、濕度、光周期、初始pH值、紫外線照射時間、高溫脅迫時間及吐溫-80濃度條件下菌株孢子萌發(fā)情況進(jìn)行了研究，旨在明確玫煙色棒束孢的大田應(yīng)用前景。

1材料和方法

1.1 供試菌株

供試菌株為玫煙色棒束孢（Isaria fumosorosea）IF-1106菌株，保存于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 玫煙色棒束孢菌株分生孢子懸浮液的制備

將玫煙色棒束孢IF-1106菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，在25 ℃條件下培養(yǎng)10 d，用滅菌過的蓋玻片刮取孢子，加入適量的無菌水，用磁力攪拌器攪拌30 min，用四層紗布過濾掉菌絲。顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)，將孢子懸浮液濃度控制在顯微鏡（10×40）下每個視野有50個孢子左右，以下試驗(yàn)均用此濃度的孢子懸浮液。

1.3 不同溫度下孢子萌發(fā)率測定

采用凹玻片懸滴法[6]，將孢子懸浮液加入到萌發(fā)液（2%葡萄糖，0.5%蛋白胨）中，將配好的孢子懸浮液分別置于10，15，20，23，26、29，32，35 ℃共8個溫度下培養(yǎng)24 h后鏡檢孢子萌發(fā)率，每個處理重復(fù)6次，以芽管長度超過孢子直徑一半作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.4 不同濕度下孢子萌發(fā)率測定

采用飽和鹽控制空氣相對濕度[7]，將配好的孢子懸浮液滴在滅菌的載玻片上，將載玻片置于直徑為9 cm的滅菌的玻璃培養(yǎng)皿中，并在培養(yǎng)皿中放入直徑5 cm的塑料培養(yǎng)皿，在小培養(yǎng)皿中分別加入葡萄糖、亞硝酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鉀的飽和鹽溶液控制濕度，使相對濕度分別為55%，65%，75%，85%，95%，每個處理重復(fù)6次，24 h鏡檢孢子萌發(fā)率。

1.5 不同光周期下孢子萌發(fā)率測定

采用凹玻片懸滴法，設(shè)24 L、16 L/8 D、14 L/10 D、12 L/12 D、10 L/14 D、8 L/16 D、24 D七個光周期25 ℃下培養(yǎng)24 h后檢測孢子萌發(fā)情況，以計算孢子萌發(fā)率及萌發(fā)速度，每個處理6次重復(fù)。

1.6 不同初始酸堿度對分生孢子萌發(fā)的影響

采用凹玻片懸滴法，用NaOH和乳酸調(diào)節(jié)孢子懸浮液pH值分別為3，4，5，6，7，8，9，10，然后25 ℃條件下培養(yǎng)24 h后檢查孢子萌發(fā)情況，每個處理6次重復(fù)。

1.7 紫外線照射對孢子萌發(fā)的影響

取5 mL分生孢子懸浮液，在無菌室內(nèi)功率為30 W紫外燈正下方50 cm處的磁力攪拌器上振蕩照射，每隔1 min用移液器抽取液體，設(shè)置照射時間1，2，3，4，5和6 min，共6個處理，另外設(shè)不照射為對照組。紫外照射處理后，按5%的比例接入到裝有10 mL萌發(fā)液的試管中，在溫度為25 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)，24 h后鏡檢萌發(fā)率。

1.8 高溫處理對孢子萌發(fā)的影響

參照孢子水浴脅迫法[6， 8]，移取0.1 mL孢子懸液于裝有1 mL孢子萌發(fā)液的10 mL試管中，振蕩混勻。然后將玻璃管放在48±0.5 ℃的水浴鍋中分別水浴加熱3，6，9，12，15，30 min后，在相對濕度100%、溫度25 ℃、150 r·min-1的條件下做萌發(fā)實(shí)驗(yàn)，每個處理重復(fù)6次，以未經(jīng)水浴加熱的孢子作為對照。24 h后鏡檢萌發(fā)率。

1.9 吐溫-80不同濃度對孢子萌發(fā)的影響

用含1%，0.5%，0.1%，0.05%，0.01%吐溫-80無菌水，將孢子洗下并配成孢子懸浮液，采用凹玻片懸滴法，在25 ℃條件下培養(yǎng)，24 h后鏡檢萌發(fā)率。

1.10 數(shù)據(jù)處理

用SPSS17.0數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對分生孢子萌發(fā)的影響

由試驗(yàn)結(jié)果（圖1）可以看出，溫度對玫煙色棒束孢孢子萌發(fā)的影響顯著（F=636.51； df=7，40； P<0.001）。該菌株在26 ℃的溫度下孢子萌發(fā)率最高，為95.89%。高于或低于26 ℃，孢子萌發(fā)率都有所下降，在溫度為23 ℃和32 ℃時孢子萌發(fā)率都高于80%。表明該菌孢子萌發(fā)的最適溫度為26 ℃左右，在23～32 ℃的溫度范圍內(nèi)孢子都能較好的萌發(fā)。高溫和低溫都不利于該菌孢子的萌發(fā)。

2.2 濕度對分生孢子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌株分生孢子在空氣相對濕度低于85%時幾乎不萌發(fā)。當(dāng)空氣相對濕度在85%以上時，隨著空氣相對濕度的增加，分生孢子萌發(fā)率也不斷升高。在空氣相對濕度為85%時，孢子萌發(fā)率為83.94%。在空氣相對濕度95%時萌發(fā)率最佳，萌發(fā)率可達(dá)到93.19%。

2.3 光周期對分生孢子萌發(fā)的影響

菌株在不同光周期條件下，孢子有不同程度的萌發(fā)，差異顯著（F=175.33； df=6，35； P<0.001）。全黑暗條件下（24 D），分生孢子的萌發(fā)率最高，達(dá)到90.03%，而在全光照條件下（24 L），分生孢子的萌發(fā)率最低，為52.69%。在光暗交替的環(huán)境中，隨著光照時間的延長，孢子萌發(fā)率呈上升趨勢（圖2）。

2.4 初始pH值對分生孢子萌發(fā)的影響

初始pH值在4～10范圍內(nèi)，玫煙色棒束孢IF-1106菌株均能產(chǎn)孢（圖3），相互間差異顯著（F=387.22； df=6，30； P<0.001）。菌株pH值為6時萌發(fā)率最高，可達(dá)到90%以上；pH值為5和7時，孢子萌發(fā)率也能達(dá)到85%左右，并且兩者之間差異不顯著。在pH值為中性偏微酸性（pH值為5～7）的環(huán)境比偏酸性（pH值為4）或偏堿性（pH值為8～10）的環(huán)境更適于其萌發(fā)。在pH值為4，9和10時，萌發(fā)率均較低，低于50%。偏酸性或偏堿性條件均不適宜該菌株孢子的萌發(fā)，該菌株的最適pH值范圍為5～7。

2.5 紫外照射對分生孢子萌發(fā)的影響

本研究結(jié)果表明，紫外照射對玫煙色棒束孢IF-1106菌株分生孢子的萌發(fā)有很大的影響，且相互間差異顯著（F=577.31； df=6，35； P<0.001）。當(dāng)玫煙色棒束孢經(jīng)紫外線照射1 min，萌發(fā)率為75.59%，比對照下降7.99%。隨著照射時間的延長，孢子萌發(fā)率呈明顯的下降趨勢，當(dāng)紫外線照射時間延長至6 min時，孢子萌發(fā)率僅有10.94%，比對照下降72.64%（圖4）。

2.6 高溫脅迫對分生孢子萌發(fā)的影響

在高溫48 ℃處理3 min條件下，IF-1106菌株的孢子萌發(fā)率為42.18%，比對照下降47.54%。在高溫脅迫處理15 min后，孢子萌發(fā)率已低于10%；在高溫脅迫處理30 min后，孢子萌發(fā)率僅有4.16%（圖5）。隨著高溫脅迫處理時間的增加，菌株孢子萌發(fā)率呈下降趨勢。

2.7 吐溫-80濃度對分生孢子萌發(fā)的影響

在不同濃度吐溫-80溶液條件下，IF-1106菌株分生孢子萌發(fā)率均在80%左右，相互間差異不顯著（F=0.23； df=5，30；P=0.947）。試驗(yàn)結(jié)果表明，吐溫-80濃度對分生孢子萌發(fā)基本無影響。

3 結(jié)論與討論

3.1 溫度的影響

據(jù)報道，玫煙色擬青霉菌絲生長適溫為8～32 ℃，最適溫度為25～28 ℃，高溫30～40 ℃比低溫6～11 ℃對生長的影響更大 [9-10]。張仙紅等[11]的研究表明玫煙色擬青霉分生孢子萌發(fā)的最適溫度為20～28 ℃。Lacey等[12]研究表明玫煙色棒束孢菌絲生長最適合溫度為24～28 ℃，本試驗(yàn)研究表明26 ℃條件下，玫煙色棒束孢IF-1106菌株的孢子萌發(fā)率達(dá)到最大值。26 ℃是玫煙色棒束孢IF-1106菌株孢子萌發(fā)的最適溫度。20 ℃以下或32 ℃以上，孢子萌發(fā)率顯著降低，可見低、高溫條件均不利于該菌株孢子萌發(fā)。

3.2 濕度的影響

有研究指出，在25 ℃溫度條件下，當(dāng)空氣相對濕度為100%時，孢子萌發(fā)率達(dá)到72.2%，當(dāng)空氣相對濕度為90%時，孢子萌發(fā)率下降到38.1%，當(dāng)空氣相對濕度低于85%時孢子幾乎不萌發(fā)[11]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，空氣相對濕度低于85%，孢子幾乎不萌發(fā)?？諝庀鄬穸?5%以上，隨著空氣相對濕度的增加，分生孢子萌發(fā)率不斷升高，在空氣相對濕度95%時，孢子萌發(fā)率最佳。這表明分生孢子萌發(fā)要求較高的濕度條件，濕度越高萌發(fā)率越高。因此，高濕是分生孢子萌發(fā)的必要條件。

3.3 光周期的影響

有研究表明在全光照24 L條件下，菌落生長最快且產(chǎn)孢量最大，隨光照時間的縮短菌落生長減慢且產(chǎn)孢量降低[13]。本研究結(jié)果表明：光暗交替比全光照24 L條件下孢子萌發(fā)率高，比全黑暗24 D條件下孢子萌發(fā)率低。與前人的研究結(jié)果不太一致，這可能是由于玫煙色棒束孢不同菌株之間對光照需求各異所產(chǎn)生的差異。

3.4 紫外照射的影響

隨著照射時間的延長，孢子萌發(fā)率呈明顯的下降趨勢。張曉敏等[14]針對紫外輻射對球孢白僵菌的影響，對光保護(hù)劑對孢子萌發(fā)的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，進(jìn)行紫外保護(hù)劑的添加能提高菌株抗紫外殺傷力的作用。本菌株在短時間的紫外照射條件下萌發(fā)率很低，由此表明紫外照射對IF-1106菌株孢子的殺傷力較強(qiáng)，本菌株不耐紫外照射。大田施用時，要盡量避免強(qiáng)紫外光線天氣或者添加紫外保護(hù)劑。

3.5 高溫脅迫的影響

隨著高溫脅迫處理時間的增加，菌株孢子萌發(fā)率不斷下降。該菌株對高溫的耐受力較弱，在田間應(yīng)用時要注意盡量避開高溫天氣，在溫度相對較低的情況下進(jìn)行，以免影響其施用防效。

綜上所述，玫煙色棒束孢IF-1106菌株培養(yǎng)最適溫度26 ℃，相對濕度95%以上，全黑暗24 D條件培養(yǎng)，初始pH值弱酸性（pH值為6）。紫外線照射和高溫脅迫對玫煙色棒束孢IF-1106菌株的影響較大，表明本菌株不耐紫外線照射，不耐高溫。

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