GFP生色團(tuán)衍生物的合成及其熒光性能

葉劍衡， 王　超， 底　霄， 孫　健， 唐　卓

(1.中國科學(xué)院 成都生物研究所 天然藥物室，四川 成都　610041； 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京　100049)

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GFP生色團(tuán)衍生物的合成及其熒光性能

葉劍衡1,2， 王超1*， 底霄1， 孫健1， 唐卓1*

(1.中國科學(xué)院 成都生物研究所 天然藥物室，四川 成都610041； 2. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京100049)

摘要：以N-甲基乙酰胺或N-甲基苯甲酰胺為起始原料，與氯乙酰氯經(jīng)?；磻?yīng)后,與疊氮鈉經(jīng)取代反應(yīng)制得二酰亞胺(2)； 2在三苯基膦的催化下發(fā)生分子內(nèi)氮雜Witting反應(yīng)制得關(guān)鍵中間體——咪唑啉酮(3)； 3與芳醛在堿性條件下經(jīng)縮合反應(yīng)合成了8個新型的GFP生色團(tuán)衍生物(5a～5h)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和(13)C NMR表征。對5a～5h的激發(fā)波長和發(fā)射波長進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，與對羥基苯咪唑啉酮(p-HOBDI)相比，大部分化合物的發(fā)射波長發(fā)生了比較顯著的紅移，其中2-羥基-5-硝基苯咪唑啉酮的發(fā)射波長達(dá)614 nm。

關(guān)鍵詞：GFP； 咪唑啉酮； 芳香醛； 合成； 光學(xué)性質(zhì)

1962年,下村修等人在一種名為Aequorea Victoria的水母中發(fā)現(xiàn)綠色的熒光蛋白，簡稱GFP(Chart 1)[1]。GFP在藍(lán)光的激發(fā)下會發(fā)出非常強(qiáng)的綠色熒光，其熒光性質(zhì)引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注和研究[2-5]。GFP由238個氨基酸組成，其生色基團(tuán)是在蛋白質(zhì)鏈折疊時，經(jīng)過分子內(nèi)脫水環(huán)化，并在氧氣的存在下發(fā)生氧化脫氫得到的對羥基苯咪唑啉酮(p-HOBDI[6]， Chart 1)。

Chart 1

Scheme 1

然而，通過化學(xué)方法合成所得的生色團(tuán)p-HOBDI，在溶液中幾乎沒有熒光[7]。這可能是由于p-HOBDI分子內(nèi)的雙鍵的扭轉(zhuǎn)運(yùn)動，導(dǎo)致其激發(fā)態(tài)電子通過無熒光形式躍遷返回基態(tài)[8-12]。2011年，Jaffrey小組[13]將GFP骨架的熒光小分子與某一段特定序列的RNA結(jié)合形成適配體(限制了分子內(nèi)雙鍵的轉(zhuǎn)動)，經(jīng)光照可以發(fā)出綠色的熒光，這對特異性標(biāo)記RNA序列或者是編碼有熒光的RNA序列提供了參考，具有突破性的意義。然而，目前大多數(shù)以p-HOBDI為基礎(chǔ)的熒光分子，熒光發(fā)射波長為395～500 nm，波長較短。隨著熒光技術(shù)的不斷進(jìn)步、細(xì)胞成像技術(shù)和活體熒光成像診斷技術(shù)的不斷成熟，對滲透能力強(qiáng)的長波長的熒光分子，特別是能發(fā)紅光或近紅外熒光的熒光分子的需求日益增加。因此我們希望通過改變分子結(jié)構(gòu)，提高p-HOBDI分子內(nèi)雙鍵的轉(zhuǎn)動能壘，讓激發(fā)態(tài)電子盡量以發(fā)射熒光方式回到基態(tài)。

為此，本文擬以p-HOBDI結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，設(shè)計合成發(fā)光能力更強(qiáng)，且熒光波長更長的熒光分子，并將其用于RNA的標(biāo)記。以氮甲基乙酰胺(1a)或氮甲基苯甲酰胺(1e)為原料，首先與氯乙酰氯發(fā)生?；磻?yīng)，然后用疊氮鈉對產(chǎn)物上的氯原子進(jìn)行取代制得二酰亞胺(2a, 2e)； 2在三苯基膦的作用下發(fā)生分子內(nèi)關(guān)環(huán)制得關(guān)鍵中間體——咪唑啉酮(3a, 3e)[6]； 3與芳香醛(4a～4e, 4g～4h)經(jīng)縮合反應(yīng)合成了8個新型的p-HOBDI衍生物(5a～5h, Scheme 1),其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和13C NMR表征。并對5的熒光性質(zhì)進(jìn)行了初步考察。

1實驗部分

1.1儀器與試劑

Bruker 400 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Thermo Scientific Varioskan Flash型光譜掃描多功能讀數(shù)儀。

所用試劑均為分析純。

1.2合成

(1) 2a的合成

在干燥的反應(yīng)瓶中加入1a 7.3 g(0.1 mol)，三乙胺15.2 mL和二氯甲烷100 mL，攪拌下緩慢滴加氯乙酰氯8.8 mL(0.11 mol)，滴畢，于室溫反應(yīng)2 h。依次用水(3×30 mL)洗滌，用飽和食鹽水(30 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥；減壓濃縮，剩余物用DMSO(100 mL)溶解，一次性加入疊氮鈉13 g(0.2 mol)，于室溫反應(yīng)12 h。傾入100 mL冰水中，用乙酸乙酯(3×50 mL)萃取，合并有機(jī)相，依次用水和飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥；減壓濃縮后經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑:A=V(石油醚) ∶V(乙酸乙酯)=4 ∶1]純化得黃色油狀液體2a，產(chǎn)率23%。

(2) 2e的合成

在干燥的反應(yīng)瓶中加入1e 2.15 g(15.9 mmol)和甲苯50 mL，攪拌使其溶解；緩慢滴加氯乙酰氯1.4 mL(17.5 mmol)，滴畢，回流反應(yīng)12 h。減壓濃縮，后處理同1.2(1)(洗脫劑：A=10 ∶1)得黃色油狀液體2b，產(chǎn)率70%。

(3) 3的合成(以3a為例)

在反應(yīng)瓶中加入2a 1.09 g(7 mmol)和甲苯35 mL，攪拌使其均勻；加入三苯基膦2.02 g(7.7 mmol)，于室溫反應(yīng)12 h。反應(yīng)液減壓濃縮后經(jīng)硅膠柱層析[洗脫劑:V(甲醇) ∶V(乙酸乙酯)=1 ∶19]純化得黃色油狀液體3a,產(chǎn)率87%。

用類似方法制得紅色固體3e,產(chǎn)率88%。

(4) 5a～5h的合成(以5a為例)

在反應(yīng)瓶中加入4-二乙基氨基水楊醛(4a) 193 mg(1 mmol), 3a 124 mg(1.1 mmol)和哌啶5 mL，攪拌下于室溫反應(yīng)12 h。用1 mol·L-1鹽酸調(diào)至pH 5, 析出固體；抽濾，濾餅依次用水、石油醚和少量乙酸乙酯洗滌,干燥得黃色固體5a。

用類似方法合成黃色固體5b～ 5h。

5a: 產(chǎn)率70%;1H NMRδ： 7.60(d,J=7.4 Hz, 1H), 7.05 (s, 1H), 6.26(dd,J=9.0 Hz, 2.5 Hz, 1H), 6.05(d,J=2.5 Hz, 1H), 3.35(q,J=7.0 Hz, 4H), 3.11(s, 3H), 2.33(s, 3H), 1.11(t,J=7.0 Hz, 6H)；13C NMRδ: 168.01, 160.60, 156.43, 152.43, 137.67, 129.36, 127.43, 109.32, 104.93, 98.55, 44.38, 26.77, 15.33, 13.11。

5b: 產(chǎn)率70%；1H NMRδ: 9.39(d,J=2.9 Hz, 1H), 8.14(dd,J=9.1 Hz, 2.9 Hz, 1H), 7.24(s, 1H), 7.08(d,J=9.1 Hz, 1H), 3.12(s, 3H), 2.41(s, 3H)；13C NMRδ: 169.47, 165.48, 163.52, 140.22, 138.83, 129.12, 127.52, 121.40, 118.15, 117.27, 26.88, 15.94。

5c: 產(chǎn)率75%；1H NMRδ: 10.13(s, 1H), 7.98(d,J=1.6 Hz, 1H), 7.54(dd,J=8.4 Hz, 1.6 Hz, 1H), 7.15(d,J=8.4 Hz, 1H), 7.15(d,J=8.4 Hz, 1H), 7.12(t,J=74.7 Hz, 1H), 6.87(s, 1H), 3.10(s, 1H), 2.36(s, 1H);13C NMRδ: 170.81, 163.30, 152.33(dd,J=241.5 Hz, 7.6 Hz), 138.71, 136.58(t,J=16.5 Hz), 132.19, 129.36, 129.19, 125.47, 125.16(t,J=9.2 Hz), 116.00(dd,J=15.6 Hz, 6.9 Hz), 115.96, 115.89, 29.19。

5d： 產(chǎn)率40%；1H NMRδ: 10.57(s, 2H), 8.12(dd,J=9.1 Hz, 1.9 Hz, 2H), 6.90(s, 1H), 3.10(s, 3H), 2.36(s, 3H)；13C NMRδ: 170.12, 164.66, 147.93, 143.79, 138.76, 137.93, 125.25, 123.72, 121.72, 119.81, 26.75, 15.90。

5e: 產(chǎn)率69%；1H NMRδ: 10.22(s, 1H), 8.18(d,J=8.7 Hz, 2H), 7.93(dd,J=8.0 Hz, 1.6 Hz, 2H), 7.68～7.46(m, 3H), 7.12(s, 1H), 6.87(d,J=8.8 Hz, 2H), 3.27(s, 3H)；13C NMRδ: 171.05, 161.48, 160.51, 136.72, 135.10, 131.79, 129.70, 129.27, 129.08, 128.26, 125.93, 116.39, 29.10。

5f: 產(chǎn)率66%；1H NMRδ: 9.56(d,J=2.9 Hz, 1H), 8.14(dd,J=9.1 Hz, 2.9 Hz, 1H), 7.95(d,J=6.7 Hz, 2H), 7.72～7.61(m, 3H), 7.44(s, 1H), 7.04(d,J=9.1 Hz, 1H), 3.30(s, 3H)；13C NMRδ: 170.46, 164.16, 163.47, 140.04, 138.98, 132.50, 129.43, 129.34, 129.19, 129.00, 127.80, 121.56, 119.92, 117.34, 29.34。

5g: 產(chǎn)率71%；1H NMRδ: 8.06(d,J=9.1 Hz, 2H), 7.99～7.90(m, 2H), 7.71～7.54(m, 3H), 7.12(s, 1H), 3.27(s, 3H)；13C NMRδ: 170.81, 163.30, 152.33(dd,J=241.5 Hz, 7.6 Hz), 138.71, 136.58(t,J=16.5 Hz), 132.19, 129.36, 129.19, 125.47, 125.16(t,J=9.2 Hz), 116.00(dd,J=15.6 Hz, 6.9 Hz), 115.96, 115.89, 29.19。

5h: 產(chǎn)率68%；1H NMRδ: 9.27(s, 1H), 7.96(d,J=6.2 Hz, 2H), 7.76(s, 2H), 7.61(d,J=7.4 Hz, 3H), 7.12(s, 1H), 3.81(s, 6H), 3.29 (s, 3H)；13C NMRδ: 171.00, 161.24, 148.35, 139.59, 136.96, 131.83, 129.74, 129.34, 128.97, 128.70, 125.03, 110.90, 56.41, 29.22。

1.3熒光測定

將5配成40 mmol·L-1的二甲亞砜溶液，取5 μL溶于1 mL HEPES緩沖鹽溶液中(由于5f在緩沖液中的溶解度較低，需要補(bǔ)加10%DMSO溶液100 mL)，用酶標(biāo)儀測量其光學(xué)性質(zhì)。

2結(jié)果與討論

2.1熒光性質(zhì)

5的熒光性質(zhì)見表1。從表1可見，除5c和5e外，其余化合物的發(fā)射波長在500 nm以上。這可能是因為5中的Ar需要有明顯的強(qiáng)供電子基或強(qiáng)吸電子來提高分子內(nèi)雙鍵的轉(zhuǎn)動能壘，讓激發(fā)態(tài)電子盡量以發(fā)射熒光方式回到基態(tài)。通過對比5b和5c，可以發(fā)現(xiàn)芳環(huán)上有吸電子取代基時更利于發(fā)射光譜的紅移。從5b到5f的發(fā)射波長變化可以看出，增加分子的共軛體系,有利于發(fā)射波長的紅移。5b的Stock位移達(dá)到了180 nm?；谶@些熒光小分子的適配體篩選的相關(guān)工作正在進(jìn)行中。

從N-甲基取代的乙酰胺或苯甲酰胺出發(fā)，經(jīng)4步反應(yīng)順利合成了p-HOBDI衍生物5。在此基礎(chǔ)之上，對所合成化合物進(jìn)行了光學(xué)性質(zhì)研究，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)化合物在溶液中有較強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。與p-HOBDI相比，其發(fā)射波長發(fā)生了較顯著的紅移，這為此類化合物的進(jìn)一步應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

表1　5a～5h的熒光性質(zhì)

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Synthesis and Fluorescence Properties of the GFP Chromophores’ Derivatives

YE Jian-heng1,2,WANG Chao1*,DI Xiao1,SUN Jian1,TANG Zhuo1*

(1. Natural Products Research Center, Chengdu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences,Chengdu 610041, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

Abstract：Eight novel analogs(5a～5h) of fluorescent protein chromophore were designed and synthesized by condensation between aromatic aldehydes and imidazolinones, which were obtained by acetylation, substitution and Wittiong reaction, starting from N-methylacetamide or N-methylbenzamide. The structures were characterized by1H NMR and ( 13)C NMR. The optical study showed that the fluorescent emission wavelengths of most compounds were red-shifted compared with p-hydroxybenzylideneimidazolinone. The emission wavelength of (Z)-4-(2-hydroxy-5-nitrobenzylidene)-1-methyl-2-phenyl-1H-imidazol-5(4H)-one was 614 nm.

Keywords：GFP; imidazolinone; aromatic aldehyde; synthesis； optical property

中圖分類號：O625.15; O621.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.03.15135

作者簡介：葉劍衡(1989-)，男，漢族，四川雅安人，碩士研究生，主要從事有機(jī)小分子催化和熒光小分子研究。 E-mail: ye_jianheng@163.com通信聯(lián)系人： 王超，副研究員， E-mail： wangchao@cib.ac.cn； 唐卓，研究員， E-mail: tangzhuo@cib.ac.cn

基金項目：國家863項目子課題

收稿日期：2015-04-16;

修訂日期：2016-01-28