微生物酶催化的不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)合成(S)-(+)-4-苯基-2-丁醇

楊　敏, 李　珂, 周曉建, 崔寶東, 陳永正

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義　563000)

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微生物酶催化的不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)合成(S)-(+)-4-苯基-2-丁醇

楊敏, 李珂, 周曉建, 崔寶東, 陳永正*

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，貴州 遵義563000)

摘要：以LB培養(yǎng)基培養(yǎng)Pseudomonas monteilii TA-5，將其整細(xì)胞作為生物催化劑(Cat)，催化4-苯基-2-丁酮(1)的不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)，對(duì)映選擇性地合成了(S)-(+)-4-苯基-2-丁醇。在最佳反應(yīng)條件[1 10 mmol·L(-1)， c(Cat) 30 g cdw·L(-1)， 10%丙三醇，pH 8.0， 300 r·min(-1)，于30 ℃反應(yīng)24 h]下，轉(zhuǎn)化率82%， ee值91%。

關(guān)鍵詞：生物催化； LB培養(yǎng)基； Pseudomonas monteilii TA-5； 不對(duì)稱(chēng)還原； (S)-(+)-4-苯基-2-丁醇； 合成

手性二級(jí)醇是許多藥物的重要中間體和合成模塊，其中(S)-(+)-4-苯基-2-丁醇(2)為抗高血壓藥拉貝洛爾、丁苯碘銨，解痙鎮(zhèn)癇劑依美溴銨的重要關(guān)鍵中間體(Chart 1)[1]。因此，研究該類(lèi)化合物的不對(duì)稱(chēng)合成方法極為重要。目前，手性2的合成大多采用金屬-手性配體催化酮的不對(duì)稱(chēng)還原[2-7]或者烯醇的異構(gòu)化和不對(duì)稱(chēng)轉(zhuǎn)移氫化串聯(lián)反應(yīng)[8]等方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。近年來(lái)，科研工作者發(fā)現(xiàn)利用生物催化劑進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)還原的方法也可實(shí)現(xiàn)[9-14]。生物催化的不對(duì)稱(chēng)氧化還原反應(yīng)合成手性藥物中間體的方法越來(lái)越引起相關(guān)科研人員的關(guān)注[15-18]。

本課題組研究[19]發(fā)現(xiàn)，PseudomonasmonteiliiTA-5在M9培養(yǎng)基中以甲苯為誘導(dǎo)碳源進(jìn)行菌株培養(yǎng)，可實(shí)現(xiàn)4-苯基-2-丁酮(1)芐位亞甲基的不對(duì)稱(chēng)羥基化反應(yīng)，獲得(R)-3-羥基-4-苯基-2-丁酮，對(duì)映選擇性達(dá)99%，且未檢測(cè)到羰基還原產(chǎn)物2的產(chǎn)生。本文以LB培養(yǎng)基培養(yǎng)PseudomonasmonteiliiTA-5，將其整細(xì)胞作為生物催化劑(Cat)，催化1的不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)，對(duì)映選擇性地合成了2(Scheme 1),其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和13C NMR確證。并對(duì)催化反應(yīng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。

Scheme 1

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Agilent 400 MHz型核磁共振儀；SHIMADZU LC-20A型正相高效液相色譜儀[色譜柱：CHIRALCEL OD-H(4.6 mmΦ×250 mm, 5 μm)；流動(dòng)相:95%正己烷/5%異丙醇；流速:0.5 mL·min-1；分析時(shí)間:35 min；檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm, tR=22.2 min, tS=33.6 min]； BHC-1300ⅡA/B3型生物潔凈安全柜；FE20型pH酸度計(jì)；Multiskan Spectrun型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀。

PseudomonasmonteiliiTA-5，自制；氯化鈉(99.5%)，氯化銨(99.5%)，磷酸二氫鉀(99%)和十二水磷酸氫二鈉(99%)，百靈威科技公司；酵母浸粉，蛋白胨，瓊脂，OXOID；其余所用試劑均為分析純。

1.2合成

(1) 細(xì)胞培養(yǎng)

稱(chēng)取胰蛋白胨10.0 g，酵母浸粉5.0 g和氯化鈉10.0 g，用適量重蒸水溶解，混勻，定容至1 000 mL，并調(diào)至pH 7.0。取10 mL分裝于20 mL螺口瓶中；另取50 mL分裝于250 mL錐形瓶中，于121 ℃滅菌30 min得LB培養(yǎng)基，備用。

將PseudomonasmonteiliiTA-5接種于20 mL螺口瓶的LB培養(yǎng)基中，標(biāo)記為一級(jí)培養(yǎng)，在 30 ℃， 300 r·min-1條件下于搖床中培養(yǎng)7 h。取種子菌液2 mL于250 mL錐形瓶的LB培養(yǎng)基中，標(biāo)記為二級(jí)培養(yǎng)，在30 ℃， 300 r·min-1條件下于搖床中培養(yǎng)17 h。將菌液取出并快速分裝于已冰浴好的50 mL離心管中，用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)量各管菌液的OD值。利用冷凍離心機(jī)(8 000 r·min-1，于4 ℃離心5 min)離心后倒掉上層液體。根據(jù)OD值與細(xì)胞濃度關(guān)系計(jì)算出應(yīng)加入適量的Na2HPO4-KH2PO4緩沖溶液，振搖使細(xì)胞與緩沖溶液混合均勻，制得c(Cat) 30 g cdw·L-1細(xì)胞溶液。

(2) 2的合成

配制反應(yīng)液5 mL[c(Cat) 30 g cdw·L-14.5 mL， 10 mmol·L-11 7.62 μL， 丙三醇492.38 μL]，調(diào)至pH 7， 300 r·min-1，于30 ℃反應(yīng)24 h[HPLC監(jiān)測(cè)(在EP管內(nèi)加入反應(yīng)液850 μL，用乙酸乙酯850 μL萃取，漩渦振蕩器振搖，使其充分混合。在10 000 r·min-1， 5 min， 4 ℃條件下離心。取上清液600 μL加入裝有適量無(wú)水硫酸鈉的EP管中，振搖，干燥。取上清液400 μL到HPLC樣品瓶中，并加入400 μL含有2 mmol·L-1苯甲醇內(nèi)標(biāo)的乙酸乙酯溶液。根據(jù)內(nèi)標(biāo)物、底物和產(chǎn)物的峰面積，用內(nèi)標(biāo)法得到相應(yīng)底物濃度、產(chǎn)物濃度，計(jì)算轉(zhuǎn)化率、產(chǎn)率及ee值)]。合并50瓶反應(yīng)液，用乙酸乙酯(3×200 mL)萃取，合并有機(jī)相，用無(wú)水Na2SO4干燥，減壓旋蒸后經(jīng)柱層析[洗脫劑：V(乙酸乙酯) ∶V(石油醚)=1 ∶20]純化得無(wú)色油狀液體2 223.5 mg，轉(zhuǎn)化率82%，ee值91%；1H NMRδ： 7.35(d,J=8.0 Hz, 3H), 7.29～7.23(m, 2H), 4.56(d,J=6.4 Hz, 3H), 3.82～3.86(m, 1H), 2.67～2.78(m, 2H), 2.01(s, 1H), 1.75～1.83(m, 2H);13C NMRδ： 142.1, 128.5, 125.9, 67.5, 40.9, 32.2, 23.6；其絕對(duì)構(gòu)型用標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)手性液相色譜對(duì)照鑒定(圖1)。

2結(jié)果與討論

2.1反應(yīng)條件優(yōu)化

為了探索最佳反應(yīng)條件，考察了反應(yīng)時(shí)間、細(xì)胞濃度、底物濃度、pH和輔助溶劑對(duì)1的不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)的影響。

Time/min

(1) 反應(yīng)時(shí)間

反應(yīng)液5 mL,c(Cat) 50 g cdw·L-1，其余反應(yīng)條件同1.2(2)，考察反應(yīng)時(shí)間對(duì)不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

Time/h

由圖2可見(jiàn)，其反應(yīng)時(shí)間達(dá)6 h時(shí)轉(zhuǎn)化率的曲線已基本平穩(wěn)，即在反應(yīng)6 h后底物已基本不再轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物；而反應(yīng)時(shí)間從40 min至24 h時(shí)，其產(chǎn)物對(duì)映選擇性變化不大，ee值均為91%～92%。由于在實(shí)際反應(yīng)過(guò)程中生物催化劑的不穩(wěn)定性，6 h反應(yīng)結(jié)果的重現(xiàn)性較差，而24 h反應(yīng)結(jié)果重現(xiàn)性較好。因此，最佳反應(yīng)時(shí)間確定為24 h。

(2)c(Cat)

1 5 mmol·L-1，反應(yīng)時(shí)間24 h,其余反應(yīng)條件同2.1(1)，考察c(Cat)對(duì)不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，c(Cat)對(duì)產(chǎn)物對(duì)映選擇性的影響不明顯；當(dāng)c(Cat)為30 g cdw·L-1時(shí)，轉(zhuǎn)化效果較好(轉(zhuǎn)化率52%，ee值90%)。因此最佳c(Cat)為30 g cdw·L-1。

表1　c(Cat)對(duì)不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)的影響*

*1 5 mmol·L-1，反應(yīng)時(shí)間24 h,其余反應(yīng)條件同2.1(1)。

(3)c(1)

反應(yīng)時(shí)間為24 h,其余反應(yīng)條件同2.1(1)，考察c(1)對(duì)不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，隨著c(1)增大，轉(zhuǎn)化率增加，可能是因?yàn)閏(1)在一定范圍內(nèi)的增加導(dǎo)致反應(yīng)中酶與底物接觸的幾率有所增大，從而使反應(yīng)速率提高而得到較高的轉(zhuǎn)化率。因此，最佳的c(1)為10 mmol·L-1。

表2　c(1)對(duì)不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)的影響*

*反應(yīng)時(shí)間24 h,其余反應(yīng)條件同表1。

(4) pH

反應(yīng)時(shí)間為24 h,其余反應(yīng)條件同2.1(1)，考察反應(yīng)體系pH對(duì)不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可見(jiàn)，當(dāng)pH逐漸升高時(shí)，ee值變化不大(90%～92%)；但轉(zhuǎn)化率隨著pH的增高而逐漸增加，且pH 8.0時(shí)，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值(69%)。

表3　pH值對(duì)不對(duì)稱(chēng)羥基化反應(yīng)的影響*

*反應(yīng)時(shí)間24 h,其余反應(yīng)條件同表1。

(5) 輔助溶劑

當(dāng)加入少量的有機(jī)溶劑時(shí)，可以提高底物在水中的濃度，增加底物與酶反應(yīng)的接觸面，提升反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率[20]。反應(yīng)時(shí)間24 h,其余反應(yīng)條件同2.1(1)，考察輔助溶劑對(duì)不對(duì)稱(chēng)還原反應(yīng)的影響，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可見(jiàn)，采用親水性較強(qiáng)的有機(jī)溶劑丙三醇為輔助溶劑時(shí)，ee值提高至93%，而轉(zhuǎn)化率也有了較大的提升。因此，輔助溶劑確定為丙三醇。

表4　輔溶劑對(duì)不對(duì)稱(chēng)羥基化反應(yīng)的影響

*反應(yīng)時(shí)間24 h,其余反應(yīng)條件同表1。

綜上所述，最佳還原反應(yīng)條件為：反應(yīng)液5 mL,細(xì)胞濃度為30 g cdw·L-1，底物濃度10 mmol·L-1， 10%(體積百分?jǐn)?shù))丙三醇為輔溶劑，pH 8.0， 300 r·min-1，于30 ℃反應(yīng)24 h，轉(zhuǎn)化率82%，ee值91%。

以LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的PseudomonasmonteiliiTA-5催化還原4-苯基-2-丁酮，合成了(S)-(+)-4-苯基-2-丁醇。該方法具有高效，高選擇性，專(zhuān)一性強(qiáng)，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好等特點(diǎn)，為手性二級(jí)醇的合成提供了一個(gè)新的思路。

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Asymmetric Synthesis of (S)-(+)-4-phenyl-2-butanol by Carbonyl Reduction with Microbial Enzymes

YANG Min,LI Ke,ZHOU Xiao-jian,CUI Bao-dong,CHEN Yong-zheng*

(School of Pharmarcy, Zunyi Medical University, Zunyi 563000, China)

Abstract：Pseudomonas monteilii TA-5 cultivated with LB medium was employed as the biocatalysts(Cat) for the synthesis of (S)-(+)-4-phenyl-2-butanol with high enantioselectivity by asymmetric reduction. In this paper, the optimal reaction conditions for bioreduction of 4-phenyl-2-butanone(1) were optimized. Under the optimized reaction conditions[1 10 mmol·L(-1), c(Cat) 30 g·cdw·L(-1), 10% glycerol as the cosolvent, pH 8.0, 300 r·min(-1), at 30 ℃ for 4 h], the conversion was 82% and ee was 91%.

Keywords：biocatalysis; LB medium; Pseudomonas monteilii TA-5; asymmetric reduction; (S)-(+)-4-phenyl-2-butanol; synthesis

中圖分類(lèi)號(hào)：O623．42； O621．3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.15952/j.cnki.cjsc.1005-1511.2016.03.16009

作者簡(jiǎn)介：楊敏(1991-)，女，苗族，貴州臺(tái)江人，碩士研究生，主要從事生物催化的研究。通信聯(lián)系人： 陳永正，教授， Tel. 0851-28642336， E-mail： yzchen@zmc.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21262051)； 貴州省教育廳自然科學(xué)項(xiàng)目(黔教科2011-046號(hào))

收稿日期：2015-12-29