CD-DST技術在結直腸癌術后輔助化療的個體化應用

郭惠玲，任圣男，金洪永，高素潔，房學東，陳學博*

(吉林大學中日聯誼醫(yī)院 1.胃腸結直腸肛門外科;2.麻醉科,吉林 長春130033)

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CD-DST技術在結直腸癌術后輔助化療的個體化應用

郭惠玲1，任圣男1，金洪永1，高素潔2，房學東1，陳學博1*

(吉林大學中日聯誼醫(yī)院 1.胃腸結直腸肛門外科;2.麻醉科,吉林 長春130033)

摘要：目的探討膠原凝膠滴包埋腫瘤細胞培養(yǎng)法化療藥物敏感性檢測技術(CD-DST)對結直腸癌術后輔助化療的指導作用及臨床應用可行性。方法將30例結直腸癌患者的新鮮手術標本分別對5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、伊立替康3種化療藥物進行CD-DST檢測，觀察檢測成功率、藥物敏感性差異。以CD-DST檢測結果為指導治療的患者28例作為實驗組，未行CD-DST檢測以傳統(tǒng)經驗治療的30例患者作為對照組，研究檢測結果與臨床療效的一致性，比較2組患者術后1年的無進展生存期(PFS)。結果(1)檢測成功率為93.3%(28/30)。三種化療藥物的敏感率分別為(35.7%，35.7%，28.6%)(2)實驗組和對照組1年的無進展生存期[(92.9%(1/28)vs 83.3%(5/30)]差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論CD-DST技術對結直腸癌術后輔助化療的方案選擇具有一定的臨床指導價值。

關鍵詞：CD-DST；結直腸癌；個體化應用

(ChinJLabDiagn,2016,20:0405)

術后輔助化療仍是目前結直腸癌綜合治療中重要的手段之一。臨床醫(yī)生對結直腸癌患者術后輔助化療的選擇多參照NCCN指南推薦或經驗性用藥為主，由于腫瘤的異質性，即使是同一類型腫瘤同一化療方案的患者臨床療效及預后差別顯著，對于化療效果不佳的患者承受了巨大的病痛之苦以及沉重的經濟負擔。膠原凝膠滴包埋腫瘤細胞培養(yǎng)法化療藥物敏感性檢測技術(collagen geldroplet embedded culture drug sensitivity test CD-DST)是一種化療藥物體外藥敏檢測技術，它與其他檢測技術相比，具有培養(yǎng)成功率高、所需細胞少、細胞的生物學特性與體內相似、結果與臨床一致性高等優(yōu)點。我科自2013年6月開展此項目以來對30例患者術中新鮮腫瘤標本進行檢測，目的是探討CD-DST技術在結直腸癌術后輔助化療個體化應用的意義。

1資料與方法

1.1病例選擇

收集吉林大學中日聯誼醫(yī)院新民院區(qū)從2013年6月到2014年2月間連續(xù)收治的結直腸癌患者60例，年齡28-79歲，中位年齡為56歲，所有患者均經術前腸鏡及病理結果確診，術前盆腔MR或腹部CT檢查確定，按照2013年NCCN指南的TNM分期，術前分期均為T3N1-2M0-1的III、IV期。術后病理證實需要行術后輔助化療。隨機選取30例患者行CD-DST檢測，根據檢測結果指導術后輔助化療的為實驗組(CD-DST組)，其余30例患者根據2013年版NCCN指南推薦進行術后輔助化療作為對照組(control組)。兩組患者的年齡、性別、TNM分期、病理類型、淋巴結轉移數等均無統(tǒng)計學意義。

1.2治療方案

兩組患者術前均未行任何放化療，充分術前準備后行結腸癌根治或直腸癌根治手術，術后無嚴重出血、腸瘺、腸梗阻等并發(fā)癥，于術后3周開始進行化療。對照組患者根據2013年版NCCN指南推薦給予XELOX方案，出現復發(fā)后給予FOLFRI方案或聯合分子靶向治療。實驗組患者根據CD-DST檢測結果決定選擇XELOX，FOLFRI或單藥口服等方案，若對三種化療藥物均耐藥，則在化療基礎上聯合分子靶向治療。所有患者均完成6-8療程化療。通過門診或電話隨訪，包括每3-6個月復查腫瘤標志物(CEA和CA199)、盆腔CT或腹部CT檢查，到發(fā)現腫瘤復發(fā)或進展后終止隨訪。

1.3主要試劑及儀器

1.3.1主要試劑5-氟尿嘧啶注射液(天津金耀)；注射用奧沙利鉑(哈藥集團)；伊立替康注射液(sigma)；培養(yǎng)液DMEM/F12(hyclone)；特級胎牛血清(Gibco)；10%中性福爾馬林(北京益利精細化學品有限公司)；PBS(biotopped)；EGTA(Genview)；EZ酶、制膠原液A、B、C、PCM-1、PCM-2培養(yǎng)液、膠原凝膠包被培養(yǎng)瓶(購自korabo公司)。

1.3.2主要儀器HWS-24型電熱恒溫水浴鍋(昆山一恒儀器)；DHG-9140A型電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器)；SW-CJ-2FD型雙人單面垂直凈化工作臺(蘇州智凈設備有限公司)；KQ2200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；CKX41型倒置顯微鏡(Olympus)；XA205DU型電子天平(梅特勒)；TDZ5-WS型臺式離心機(湖南湘儀)；YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅醫(yī)療設備)；HERAcell150i型二氧化碳培養(yǎng)箱(熱電)；Primage 圖像分析系統(tǒng)(Kurabo)。

1.4研究方法

CD-DST技術對結直腸癌細胞抗癌藥物敏感性檢測實驗。

1.4.1樣本前處理在無菌條件下，用眼科剪把新鮮腸癌組織剪成0.5-1.0 mm3碎塊，用刀片將其切碎成泥狀。收集腫瘤組織并使用細胞分散酶EZ 37℃、CO2培養(yǎng)箱消化3 h。

1.4.2樣本預培養(yǎng)終止消化后，EGTA-Trypsin處理細胞沉淀使組織進一步分散，300 μm膜過濾，將細胞液收集到50 ml離心管中，離心去上清，加入5-10 ml PCM-1培養(yǎng)基，吹散混勻。將細胞懸液移入膠原凝膠包被培養(yǎng)瓶中，37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.4.3膠原凝膠滴培養(yǎng)預培養(yǎng)后，棄去膠原凝膠包被培養(yǎng)瓶中未貼壁死細胞，EZ酶消化后，EGTA-Trypsin處理成細胞懸液。125 μm膜過濾，吸出少量細胞，進行活細胞計數，用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基調整細胞濃度為(2-5)×106/ml。在冰水上預冷50 ml離心管加入試劑盒膠原凝膠制備套裝中A、B、C溶液，制成膠原原液。將離心后的細胞分散液加入到膠原原液中，使細胞最終密度為(2-5)×105/ml。取30 μl膠原混合液滴注到6孔培養(yǎng)板上制成膠原凝膠滴，每孔接種3滴。待膠原凝膠滴凝固后，在6孔板中加入3 ml 10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24 h。

1.4.4抗癌藥物接觸向6孔培養(yǎng)板中分別加入抗癌藥稀釋液5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑、伊立替康，同時設不加藥對照孔。

1.4.5抗癌藥物去除和清洗及無血清培養(yǎng)待藥物作用24 h，吸除6孔板中培養(yǎng)基，每孔加入4 ml DMEM/F12培養(yǎng)基清洗除去抗癌藥物，重復2次。去除抗癌藥物后，在每孔中加入4 ml PCM-2，37℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天。

1.4.6固定和染色通過中性紅固定染色干燥后，使用Primage圖像分析系統(tǒng)讀數，保存結果。

1.4.7判斷標準評價指標用T/C的百分比值表示，其中T為加藥處理組的光密度值，C為對照組光密度值。腫瘤細胞存活率越低，說明受試藥物對腫瘤細胞的殺傷力越強，腫瘤細胞對藥物越敏感。如果T/C的百分比值≤50%時，說明個體腫瘤細胞對相應藥物敏感度較高；如果50%

1.5統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數資料的比較采用χ2檢驗，應用Kaplan-Meier法計算無進展生存期。

2結果

2.1CD-DST檢測結果

30例檢測患者有28例順利完成檢測，檢測成功率為93.3%(28/30)，2例檢測失敗原因分別為樣本量過少和樣本受到污染。實驗組28例患者中有10例對三種藥物均耐藥，完全耐藥率為：35.7%，12例(42.9%)對一種藥物敏感，5例(17.9%)對兩種藥物敏感，僅有1例(3.6%)對三種藥物均敏感。三種化療藥物的敏感率分別為：5-氟尿嘧啶35.7%(10/28)，奧沙利鉑35.7%(10/28)，伊立替康28.6%(8/28)，三種化療藥物之間的敏感率無顯著性差異(表1)。

2.2CD-DST法指導化療對1年無進展生存期PFS的影響

對兩組全部患者通過門診及電話隨訪，無1例失訪，根據腫瘤標志物(CEA和CA199)、盆腔CT或腹部CT檢查結果來判定腫瘤復發(fā)或進展。CD-DST組一年的PFS(96.4%)顯著高于對照組(83.3%)，差異具有統(tǒng)計學意義(圖1)。

表1　三種化療藥物的敏感率對比

圖1　CD-DST法指導化療對1年無進展生存期PFS的影響

統(tǒng)計到一年的無進展生存期(PFS)，對照組(control組)一年的PFS為83.3%(25/30)，CD-DST組一年的PFS為96.4%(27/28)，二者差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.047)。

3討論

雖然外科手術技術不斷提高，精細化解剖的手術根治、化療藥的不斷更新換代，但是結直腸癌的治療仍然沒有質的飛躍，由于結直腸癌具有高度的異質性[1]，可能導致了分期相同、治療相同的結直腸癌患者的預后會截然不同。

3.1術后輔助化療的現狀和個體化趨勢

術后輔助化療是結直腸癌綜合治療中的關鍵，對手術后腫瘤的復發(fā)和轉移、患者的預后起到至關重要的作用，目前常見的結直腸癌的化療方案包括：FOLFOX4,XELOX,FOLFRI,FOLFOXRI,希羅達或替吉奧單藥等。對結直腸癌的術后輔助化療多以NCCN指南為參照給予以鉑類為主的經驗性用藥為主，且各地醫(yī)生的用藥習慣差異較大，成為患者術后輔助化療的選擇的決定因素，然而，腫瘤本身存在異質性，即使是同一類型腫瘤同一化療方案的患者的臨床療效及預后會有明顯差別，化療的整體有效率僅為30%左右，有相當一部分患者因為化療效果不佳而承受病痛之苦、給家庭帶來沉重的經濟負擔，對我國的醫(yī)保資金也是一種浪費。經驗用藥無法保證腫瘤患者個體的有效性，規(guī)范化治療也是針對群體療效提高為目的，仍不能保證腫瘤患者的個體化治療。因此，腫瘤的個體化治療越來越受到醫(yī)生、患者及家庭的關注，腫瘤的分子診斷、體外抗癌藥物敏感試驗等均是個體化治療的發(fā)展趨勢。個體化技術的先進程度與臨床實用性之間的關系：從基因、蛋白質表達、細胞培養(yǎng)到人體及臨床試驗，臨床效果相關度逐漸提高。

體外抗癌藥物敏感試驗為患者的術后輔助化療的方案選擇提供了一種客觀有效的參考。常見的有ATP生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術(ATP-TCA法)、四氮唑衍生物比色法(MTT法)、組織塊培養(yǎng)終點染色計算機圖像分析法(TECIA法)以及膠原凝膠滴包埋腫瘤細胞培養(yǎng)法化療藥物敏感性檢測技術(CD-DST)等。傳統(tǒng)體外抗癌藥物敏感試驗的常見問題包括：原代培養(yǎng)成功率低、藥物接觸濃度過高導致真陽性率低、無法區(qū)分混在一起的成纖維細胞和癌細胞、缺乏臨床驗證數據等。這可能是目前臨床醫(yī)生較少選擇該類實驗進行化療藥物選擇的原因。因此，準確快速的抗癌藥敏試驗對個體化治療結直腸癌具有重要意義。

3.2CD-DST 法的特點和優(yōu)勢

CD-DST法具有培養(yǎng)成功率高、所需細胞少、細胞的生物學特性與體內相似、結果與臨床一致性高等優(yōu)點。它具有無血清的增殖培養(yǎng)基可以有效抑制成纖維細胞增殖。Higashiyama等[2]對胸膜間皮瘤研究CD-DST檢測的敏感度100%，特異度36%，準確度50%。

CD-DST法具有良好的腫瘤縮小效果預見性。Takamura等[3]報道59例乳腺癌患者根據CD-DST檢測結果指導治療，高敏感患者臨床有效率達87.5%，而低敏感患者為3.6%。說明試驗結果與臨床一致性高。Yamagami等[4]個案報道1例卵巢囊性畸胎瘤晚期伴廣泛轉移，經CD-DST法,篩選敏感化療藥物，經6個周期化療后臨床癥狀完全緩解。該法于2004年在日本作為先進醫(yī)療方法被廣泛應用，且被日本厚生省列為醫(yī)療保險項目。Ochiai T等[5]對結直腸癌患者使用CD-DST檢測建立AUC-IR50曲線判斷5-氟尿嘧啶的敏感性，認為CD-DST法將成為選擇5-氟尿嘧啶治療的必要參考條件。在消化道腫瘤方面，Ochiai T等[6]還通過CD-DST法檢測對進展性結腸癌患者的奧沙利鉑或伊立替康聯合5-氟尿嘧啶時的效果，認為FOLFRI應該作為5-氟尿嘧啶低敏感患者的一線化療方案。國內譚志軍等[7]對胃癌標本進行CD-DST檢測評價了多種化療藥物的敏感性，具有良好的臨床指導價值。

本研究中通過對30例結直腸癌患者進行CD-DST法檢測，檢測成功率為93.3%(28/30)，應取黃豆大小的標本較為合適，取結直腸癌樣本時，由于容易受到糞便的污染，除需要充分清洗干凈外，還應該在抗生素的培養(yǎng)液中再次清洗，同時準備雙份標本，以防止取材失敗，隨著取樣經驗的增加和檢測技術的熟練，即使是有細菌污染的結直腸癌的手術標本的檢測成功率仍是比較高的。三種化療藥物的整體敏感性在28.6-35.7%。而對三種化療藥物均敏感的僅有1例。三種化療藥物之間的敏感率并無顯著性差異。根據檢測結果指導治療的CD-DST組一年的無進展生存期顯著高于對照組，具有統(tǒng)計學意義，說明CD-DST法檢測指導化療藥物選擇提高了臨床的療效。

綜上所述，CD-DST技術對結直腸癌患者的個體化治療及臨床化療藥物的指導具有一定的價值，避免經驗性臨床用藥的盲目性，在一定程度上可以改善預后，提高患者的生存期。然而，不同的聯合化療方案對結直腸癌細胞的敏感性不同，針對聯合化療方案的CD-DST檢測是今后研究的方向。

參考文獻：

[1]王利峰,俞金龍,陳海金.結直腸腫瘤異質性及個體化靶向治療[J].廣東醫(yī)學,2014,14:2290.

[2]Higashiyama M,Oda K,Okami J,et al.In vitro-chemosensitivity test using the collagen gel droplet embedded culture drug test (CD-DST) for malignant pleural mesothelioma:possibility of clinical application[J].Ann Thorac Cardiovasc Surg,2008,14(6):355.

[3]Takamura Y,Kobayashi H,Taguchi T,et al.Prediction of chemotherapeutic response by collagen gel droplet embedded culture-drug sensitivity test in human breast cancers[J].Int J Cancer,2002,98(3):450.

[4]Yamagami W,Banno K,Kawaguchi M,et al.Use of the collagen gel droplet embedded drug sensitivity test to determine drug sensitivity against ovarian mature cystic teratoma with malignant transformation to adenocarcinoma:a case report[J].Chemotherapy,2007,53(2):137.

[5]Ochiai T,Nishimura K,Watanabe T,et al.Evaluation of the individual 50% inhibitory area under the concentration curve of 5-fluorouracil based on the collagen gel droplet embedded culture drug sensitivity test in colorectal cancer[J].Mol Med Rep,2009,2(3):405.

[6]Ochiai T,Nishimura K,Watanabe T,et al.Leucovorin and fluorouracil plus oxaliplatin or leucovorin and fluorouracil plus irinotecan as individualized first-line therapy based on a drug sensitivity test[J].Exp Ther Med,2010,1(2):325.

[7]譚志軍,姜偉,谷川,等.膠滴腫瘤藥敏試驗檢測胃癌細胞化療敏感度[J].腫瘤防治研究,2011,09:1074.

The Individual application of CD-DST technology in adjuvant chemotherapy after operation for colorectal cancer

GUOHui-ling,RENSheng-nan,JINHong-ying,etal.

(DepartmentofGastrointestinalColorectalandAnalSugery,China-JapanUnionHospitalofJilinUniversity,Changchun130033,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the guiding role and the feasibility of collagen gel droplet-embedded culture drug-sensitivity test(CD-DST) in adjuvant chemotherapy after operation for colorectal cancer.MethodsThe surgery- specimens of thirty patients with colorectal cancer were carried out the CD-DST test for 5-FU ,oxaliplatin and irinotecan.twenty-eight patients were included in pilot group receiving chemotherapy guided by the result of CD-DST test,and thirty patients received traditional chemotherapy for colorectal cancer were in control group.The postoperative and one-year survival rate were compared between the two groups Results(1)The CD-DST test was success in twenty-eight of thirty patients(93.3%),and sensitivity rate of three drugs was respectively 35.7%,35.7% and 28.6%.(2)The progression free survival in pilot and control group was respectively 92.9%(1/28) and 83.3%(5/30)(P<0.05).ConclusionCD-DST technology has a certain value in applying valid chemotherapy in colorectal caner.

Key words:CD-DST;colorectal cancer;individual application

(收稿日期：2015-10-10)

文獻標識碼：A

中圖分類號：R730.53

文章編號：1007-4287(2016)03-0405-04

*通訊作者

基金項目：吉林省科學技術廳(201201037)