HPLC法比較心臟釆血和頸總動脈釆血對家兔水楊酸鈉血漿半衰期的影響

魏瑩　陳珍　馬雪　楊梅　劉丹　廖榮瓊　陳小云　張語　譚茜　田瑞敏△

(1.川北醫(yī)學院藥學院，四川 南充　637100；

2.川北醫(yī)學院本科生，四川 南充　637100)

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HPLC法比較心臟釆血和頸總動脈釆血對家兔水楊酸鈉血漿半衰期的影響

魏瑩1陳珍1馬雪2楊梅2劉丹2廖榮瓊2陳小云2張語2譚茜2田瑞敏2△

(1.川北醫(yī)學院藥學院，四川 南充637100；

2.川北醫(yī)學院本科生，四川 南充637100)

摘要目的：觀察心臟釆血和頸總動脈釆血對家兔水楊酸鈉血漿半衰期的影響。方法：將12只家兔按隨機數(shù)字單盲法分為心臟釆血組和頸總動脈釆血組(n=6)，經(jīng)耳緣靜脈注射10%水楊酸鈉溶液2 ml·kg(-1)，分別于0 min，10 min和40 min后釆血，處理血樣，HPLC測定血漿水楊酸的峰面積，計算其半衰期。結(jié)果：心臟釆血組半衰期比頸總動脈釆血組明顯延長(P<0.05)，頸總動脈釆血組的實驗數(shù)據(jù)較心臟釆血組更為穩(wěn)定。結(jié)論：頸總動脈釆血較心臟釆血對水楊酸鈉半衰期的測定更為穩(wěn)定。

關(guān)鍵詞：水楊酸鈉；半衰期；心臟；頸總動脈；HPLC

藥物半衰期是藥動學重要參數(shù)，可以揭示機體內(nèi)藥物代謝情況，藥物排泄規(guī)律等[1-2]?！八畻钏徕c血漿半衰期的測定”實驗是藥理學實驗或機能學實驗當中的一個重要內(nèi)容[3]，然而其半衰期的測定結(jié)果各醫(yī)學院實驗室差距較大。在該實驗操作中，準確，多次，及時的采取足量的動物血液[4]是保證實驗成功的重要因素。故本文分別采用了心臟釆血和頸總動脈釆血兩種途徑釆血，并采用了HPLC測定，觀察其對水楊酸鈉半衰期測定結(jié)果的影響，以期為以后藥物血漿半衰期的測定實驗中家兔采血方法的改進提供一定依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物

健康家兔12只(2.5 kg左右，由川北醫(yī)學院實驗中心提供)。

1.1.2實驗器材

Agilent 1260 高效液相色譜儀(Agilent 1200四元泵、柱溫箱、VWD檢測器、Agilent 1200 色譜工作站)，Mettle AE240電子天平(瑞士梅特勒公司，十萬分之一)；哺乳動物手術(shù)器械，5 ml注射器及針頭，兔臺。

1.1.3藥物試劑

10%水楊酸鈉溶液，1%戊巴比妥鈉，1%肝素鈉溶液；水楊酸對照品(批號100106-201104)購于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1分組與血樣采集

將家兔12只隨機數(shù)字單盲法分為兩組：心臟釆血組和頸總動脈釆血組，每組6只；分別將兩組家兔用1%戊巴比妥鈉溶液(3 ml·kg-1)全身麻醉，頸部正中皮膚做5-7 cm縱行切口；將心臟釆血組的家兔用1%肝素鈉溶液(1 ml·kg-1)全身肝素化；將頸總動脈釆血組的家兔的左側(cè)頸總動脈分離出來，用1%肝素鈉溶液(1 ml·kg-1)全身肝素化，然后在頸總動脈上插管；分別自心臟和頸總動脈取血2 ml；耳緣靜脈注射10%水楊酸鈉溶液后，分別自心臟和頸總動脈于0、10和40 min各取血2 ml備用。

1.2.2色譜條件[5-6]

水楊酸的含量測定 色譜柱：Wondasil C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-乙腈-0.3%磷酸水(32:18:50)；流速：1.0 ml·min-1；檢測波長：283 nm；柱溫：25℃；進樣量20 μl。

1.2.3對照品制備

精密稱取水楊酸對照品9 mg至10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得到含水楊酸0.91 mg·ml-1的對照品溶液母液；精密量取2 ml至25 ml容量瓶中，加甲醇溶解并定容，得0.0728 mg·ml-1的對照品溶液。

1.2.4供試品溶液制備[7]

精密量取血液樣品0.5 ml，乙腈2 ml，旋渦振蕩2 min，15000 r·min-1離心5 min，取上清夜微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液20 μl，在上述色譜條件下進樣，在高效液相色譜儀上進行檢測水楊酸在不同時間點的峰面積，計算其半衰期。

1.3統(tǒng)計學處理

2結(jié)果

2.1線性關(guān)系考察

在上述色譜條件下，精密吸取對照品適量進樣，測定目標物峰面積，以進樣量X(μg或μg·μl-1)為橫坐標，以峰面積Y為縱坐標，做線性回歸，得水楊酸的線性方程分別為Y=1206X+95.575(r=0.9995)；線性范圍為2.97~4.83 μg。

2.2精密度試驗

分別于0.5 ml 的空白血清中加入4 ml的水楊酸對照品溶液混勻，制得0.0728 mg·ml-1水楊酸濃度的血清樣品，按上述色譜條件，精密移取20 μl進樣，以水楊酸的峰面積計算RSD(n=6)，結(jié)果分別為2.4%，表明精密度良好。

2.3穩(wěn)定性試驗

按“1.2.3”項下方法，分別制備樣品，在上述色譜方法下，在0、2、4、8、12、24 h進樣測定血樣中水楊酸的峰面積，得出峰面積的RSD分別為2.1%。表明該血樣在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4回收率試驗

分別于0.5 ml 的空白血清中加入3種不同濃度水楊酸對照品溶液，混勻，7.28、72.8、728 mg·μl-1水楊酸血液樣品，按“2.3”項下方法，測定空白血漿中水楊酸的含量，計算回收率及RSD，其結(jié)果為95.8%(RSD=2.7%)。

2.5樣品測定

按照“1.2.3”項下方法制備供試品溶液，“1.2.2”項下色譜條件測定，對不同取血方式和時間點的血樣中水楊酸的含量進行測定，樣品及對照品色譜圖見圖1。

2.6心臟釆血和頸總動脈釆血對藥物半衰期的比較

實驗結(jié)果統(tǒng)計值：T值是4.085，P值0.002，見表1。實驗結(jié)果表明，心臟采血組與頸總動脈釆血組比較半衰期較長(*P<0.05)，頸總動脈釆血組半衰期的測定結(jié)果更穩(wěn)定，與文獻報道一致[8]。

3討論

藥物的半衰期是臨床給藥的參考依據(jù)，故半衰期的測定十分重要[9]?！八畻钏徕c半衰期的測定”，目前該實驗半衰期測定不同時間點血液中的水楊酸鈉的光密度值，多采用分光光度法[10-11]，但有關(guān)半衰期的測定結(jié)果各實驗室相差較大[8]。本實驗采用HPLC測定水楊酸鈉的半衰期，從檢測方法上提高準確度減少誤差。本實驗另一重要影響因素則是定點定量血。目前多采用心臟釆血法[3]，也有改良使用兔耳中央動脈取血法[12]，但這兩種方法取血對學生的技術(shù)要求較高，很難準時取出足量血，造成測定誤差。

(A)對照品HPLC圖(1.水楊酸)

(B)樣品HPLC圖圖1　血樣中水楊酸含量測定的HPLC圖

組 別半衰期(min)心臟釆血組 85.48±30.21頸總動脈釆血組34.47±4.85*

注：與心臟采血組相比，*P<0.05。

綜上，筆者分別采取頸總動脈釆血法和心臟釆血法兩種方法取血，為了避免由于手術(shù)和麻醉所致誤差，兩組采用均在全麻下進行，該實驗結(jié)果提示頸總動脈取血法可以縮小實驗誤差。本實驗在樣品處理時采用乙晴沉降蛋白，經(jīng)高速離心后可直接吸取上清液進行測定，方法簡捷、易操作、回收率高測定速度快，勿需特殊控制的實驗條件。HPLC法測定水楊酸鈉的半衰期，靈敏度高，樣品用量少，是研究藥物藥動學的常用方法。

參考文獻

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Effect of blood samples collected from heart and common carotid artery on the half-life of plasma sodium salicylic in rabbits by HPLC

Wei Ying1, Chen Zhen1, Ma Xue2, Yang Mei2, Liu Dan2,Liao Rong-qiong2, Chen Xiao-yun2, Zhang Yu2, Wang Ling-ling2, Tian Rui-min1△

(1.School of Pharmacy, North Sichuan Medical College, Sichuan Nanchong 637100;2.Students of North Sichuan Medical College, Sichuan Nanchong 637100)

AbstractObjective：To observe the effects of blood samples were collected from heart and common carotid artery on the half-life of plasma sodium salicylic in rabbits. Methods: Twelve rabbits were divided into two groups(n=6)according to the random number and single blind method. Blood samples collected from one group werefrom heart and another from the common carotid artery. Rabbits were injected 10% sodium salicylic solution 2 ml kg-1through ear vein. Blood samples were collected at 0, 10 and 40 min respectively from heart and common carotid artery to measure the half-life of plasma salicylic sodium by high performance liquid chromatograph(HPLC). Results: The half-life in the groups whose blood samples were collected from heart were significantly longer than those in another groups(P<0.05).Theexperimental data in the groups whose blood samples were collected from common carotid artery were more stable. Conclusions: The blood samples from common carotid artery are more stable than those from heart on the half-life of plasma sodium salicylic.

Key Words:Sodium Salicylic; Half-life; Heart; Common carotid artery; HPLC

(收稿日期：2016-1-29)

作者簡介：魏瑩，女，助教，主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量標準化研究，Email：414697669@qq.com?！魍ㄓ嵶髡撸禾锶鹈簦?，講師，主要從事藥理學研究，Email：truimin@126.com。