白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞線粒體跨膜電位影響研究*

唐晶　姜鮮　李茂　孫玉紅　章卓△

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理教研室，四川 瀘州　646000；

2.達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)教研室，四川 達(dá)州　635000；

3.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，四川 瀘州　646000)

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白藜蘆醇對(duì)LPS誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞線粒體跨膜電位影響研究*

唐晶1,2姜鮮3李茂1孫玉紅1章卓1△

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥理教研室，四川 瀘州646000；

2.達(dá)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)教研室，四川 達(dá)州635000；

3.瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院麻醉科，四川 瀘州646000)

摘要目的：探討白藜蘆醇對(duì)LPS刺激HUVEC細(xì)胞活性及線粒體跨膜電位影響。方法：體外培養(yǎng)HUVEC，隨機(jī)分為L(zhǎng)PS組、陰性組、白藜蘆醇160、80、40、20 μg·l(-1)劑量組。其中，LPS組與白藜蘆醇各組分別以1 μg·ml(-1)LPS刺激細(xì)胞24 h后，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，熒光顯微鏡下觀察羅丹明染色后細(xì)胞線粒體跨膜電位。結(jié)果：白藜蘆醇各組均能提高LPS誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞存活率，提高細(xì)胞線粒體跨膜電位，與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。結(jié)論：白藜蘆醇能提高LPS刺激HUVEC細(xì)胞活性，提高細(xì)胞線粒體跨膜電位。

關(guān)鍵詞：白藜蘆醇；HUVEC細(xì)胞；線粒體跨膜電位

血管內(nèi)皮細(xì)胞(Vascular endothelial cell，VEC)參與了血管通透性，具有參與機(jī)體炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，調(diào)節(jié)血管舒張、參與止血和趨化白細(xì)胞的作用[1]。脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)屬于革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要成分，可以通過(guò)激活多種細(xì)胞因子損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，引起血管內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重炎性反應(yīng)[2]。而炎癥所致血管內(nèi)皮損傷是多種疾病和綜合征發(fā)生、發(fā)展的病理基礎(chǔ)，比如急性肺損傷、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病、創(chuàng)傷、休克、腫瘤等[2]，因此探討尋找保護(hù)內(nèi)皮損傷的措施有重要意義。白藜蘆醇(Resveratro1，Res)是多年生草本植物蓼科蓼屬虎杖的根莖中的提取物，廣泛存在于葡萄、花生、虎杖等天然食物或藥物中，具有抗炎、抗血小板聚集、抗氧化等生物藥理活性[3-5]。白藜蘆醇對(duì)LPS致HUVEC細(xì)胞凋亡保護(hù)效應(yīng)是否與細(xì)胞線粒體跨膜電位有關(guān)目前仍不清楚。據(jù)此，本文通過(guò)觀察不同劑量白藜蘆醇對(duì)LPS刺激下HUVEC細(xì)胞凋亡保護(hù)效應(yīng)，分析其保護(hù)效應(yīng)是否與影響細(xì)胞線粒體跨膜電位有關(guān)。

1材料與方法

1.1試劑

白藜蘆醇(陜西森弗生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20081478，純度98%)；LPS(Sigma，L2880)；HUVEC細(xì)胞(購(gòu)自武漢大學(xué)CCTCC細(xì)胞庫(kù))；羅丹明123(碧云天生物技術(shù)研究所)；RPMI1640培養(yǎng)基，胎牛血清(Hyclone，USA)；CCK-8試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2儀器

超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司，SW-CJ-1F型)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司，CKX41型)；酶標(biāo)分析儀(北京普朗新技術(shù)有限公司，DNM-9602型)；熒光顯微鏡(德國(guó)LEICA公司，DMR型)。

1.3CCK-8法檢測(cè)白藜蘆醇對(duì)LPS刺激HUVEC后細(xì)胞活性的影響

將LPS配成10 mg·ml-1母液分裝后-20℃凍存?zhèn)溆?。將白藜蘆醇用DMSO與無(wú)血清培養(yǎng)基配成640 μg·ml-1母液(DMSO濃度小于0.1%)。HUVEC細(xì)胞株采用RPMI1640+10%胎牛血清培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC細(xì)胞，按1×105·ml-1細(xì)胞濃度接種于96孔板，每孔90 μl，培養(yǎng)24 h后處理。將細(xì)胞分為L(zhǎng)PS組(1 μg·ml-1LPS+細(xì)胞)，陰性組(細(xì)胞+培養(yǎng)基)，空白組(僅有培養(yǎng)基無(wú)細(xì)胞)以調(diào)整培養(yǎng)基的顏色誤差，白藜蘆醇分為160、80、40、20 μg·l-14個(gè)劑量組(白藜蘆醇+1 μg·ml-1LPS+細(xì)胞)，溶媒對(duì)照組(DMSO+細(xì)胞)加終濃度為0.1%DMSO，處理時(shí)間為24 h，加入CCK-8 10 μl繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度值，以O(shè)D值反應(yīng)細(xì)胞活力。每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔，連續(xù)重復(fù)3次。

1.4羅丹明染色檢測(cè)線粒體跨膜電位

細(xì)胞分組同1.4，將不同處理后的HUVEC細(xì)胞用0.25%胰酶消化，收集1×l06個(gè)細(xì)胞，經(jīng)PBS清洗2次，與1 μmol·L-1羅丹明(Rhodamine 123，Rh123)在37℃共同孵育30 min，PBS清洗2次，熒光顯微鏡下觀察熒光強(qiáng)度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1白藜蘆醇對(duì)LPS刺激HUVEC細(xì)胞后細(xì)胞活性影響

LPS組細(xì)胞活力明顯下降，表明LPS抑制HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)明顯。與LPS組比較，白藜蘆醇160, 80, 40與20 μg·L-1可明顯提高細(xì)胞活力，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或0.01)，見(jiàn)圖1。

圖1　白藜蘆醇對(duì)LPS刺激HUVEC后細(xì)胞活力影響注：同LPS組比較，*P<0.05；**P<0.01

2.2白藜蘆醇對(duì)LPS刺激HUVEC細(xì)胞后對(duì)線粒體跨膜電位影響

熒光顯微鏡結(jié)果顯示，LPS組熒光較強(qiáng)，表明線粒體跨膜電位較低。陰性對(duì)照組熒光較弱，表明線粒體膜完整，線粒體跨膜電位較高。與LPS組比較，白藜蘆醇160, 80, 40 μg·L-1劑量組熒光強(qiáng)度弱于模型組，提示白藜蘆醇各劑量組能夠提高LPS刺激HUVEC細(xì)胞后的線粒體跨膜電位，見(jiàn)圖2。

(A)陰性組　　　　　　　　　　　　　　(B)LPS組

(C)Res 160 μg·L-1　　　　　　　　　　　(D)Res 80 μg·L-1

(E)Res 40 μg·L-1　　　　　　　　　　(F)Res 20 μg·L-1圖2　白藜蘆醇對(duì)LPS刺激HUVEC后線粒體跨膜電位影響(×200)

3討論

脂多糖致血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡機(jī)制復(fù)雜，但主要與脂多糖激活多種細(xì)胞因子，激活NF-κB，改變線粒體跨膜電位有關(guān)[6]。線粒體跨膜電位(△ψm)與細(xì)胞凋亡間關(guān)系密切?！鳓譵是由線粒體內(nèi)膜兩側(cè)電子的不對(duì)稱(chēng)分布造成。正常生理情況下，線粒體內(nèi)膜通透性很低，僅允許不帶電荷的小分子物質(zhì)通過(guò)，是維持電化學(xué)質(zhì)子梯度、進(jìn)行氧化磷酸化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[7]。在細(xì)胞凋亡早期，線粒體外膜對(duì)蛋白質(zhì)的通透性增高，線粒體內(nèi)膜的跨膜潛能降低。線粒體膜電位降低，可引起細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[8]。本實(shí)驗(yàn)選擇羅丹明染色后熒光顯微鏡檢測(cè)線粒體跨膜電位。Rh123是一種可透過(guò)細(xì)胞膜的陽(yáng)離子熒光染料，其在正常細(xì)胞中能夠依賴(lài)線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì)，熒光強(qiáng)度減弱或消失。而在凋亡發(fā)生時(shí)，線粒體膜完整性破壞，線粒體跨膜電位破壞，Rh123重新釋放出線粒體，發(fā)出強(qiáng)黃綠色熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，正常細(xì)胞熒光較弱，表明線粒體膜完整。LPS刺激后的HUVEC細(xì)胞熒光較強(qiáng)，表明線粒體跨膜電位受到破壞。白藜蘆醇干預(yù)后可以明顯看見(jiàn)熒光減弱，提示白藜蘆醇減少HUVEC細(xì)胞凋亡可能是與提高線粒體跨膜電位有關(guān)。

綜上可以看出，脂多糖對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性影響與線粒體跨膜電位改變有關(guān)，白藜蘆醇能夠改善LPS刺激HUVEC細(xì)胞后活性，可能與改變HUVEC線粒體跨膜電位有關(guān)。但由于白藜蘆醇藥理作用較多，涉及作用機(jī)制亦較多，因此白藜蘆醇對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制以及相關(guān)應(yīng)用尚需進(jìn)一步探討和研究。

參考文獻(xiàn)

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Effects of resveratrol on mitochondrial membrane potential of HUVEC cells induced by LPS*

Tang Jing1,2, Jiang Xian3, Li Mao1, Sun Yu-hong1,2, Zhang Zhuo1△(1.Department of Pharmacology, Luzhou Medical College, Sichuan Luzhou 646000;2.Department of Pharmacy, Dazhou Vocational and Technical College, Sichuan Dazhou 63500;3.Department of Anesthesia, Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Sichuan Luzhou 646000)

AbstractObjective：To investigate the effects of resveratrol on the mitochondrial membrane potential of the HUVEC cells induced by LPS. Methods: HUVEC cells were cultured in vitro and divided into LPS group, normal group, 160, 80, 40, 20 μg·L-1resveratrol group. LPS group and resveratrol groups were stimulated by 1 μg·m l-1LPS for 24 h, cell viability was observed by CCK-8; mitochondrial membrane potential were tested by the fluorescence microscope. Results: Compared with model group, resveratrol at the concentration of 160, 80, 40, 20 μg·L-1could increase the cell viability and increase the mitochondrial membrane potential significantly(P<0.05). Conclusion: Resveratrol could against the apoptosis of HUVEC cell induced by LPS, and the mechanism may be associated with the increasion of the mitochondrial membrane potential.

Key Words:Resveratrol; HUVEC cell; Mitochondrial membrane potential

(收稿日期：2015-10-24)

作者簡(jiǎn)介：唐晶，女，講師，主要從事神經(jīng)藥理研究，Email：498926268@qq.com?！魍ㄓ嵶髡撸赫伦浚?，副教授，主要從事神經(jīng)與免疫藥理學(xué)，Email：zhhuozhang100@163.com。

*基金項(xiàng)目：四川省教育廳課題(編號(hào)：14ZA0143)