基于純種分離技術(shù)對(duì)古井貢酒桃花曲微生物進(jìn)行分離鑒定的研究

周慶伍，湯　斌，李安軍，湯有宏（.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽亳州3680；.安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖4000）

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基于純種分離技術(shù)對(duì)古井貢酒桃花曲微生物進(jìn)行分離鑒定的研究

周慶伍1，湯斌2，李安軍1，湯有宏1
（1.安徽古井貢酒股份有限公司，安徽亳州236820；2.安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心，安徽蕪湖241000）

摘要：根據(jù)大曲微生物的特性和生長(zhǎng)特點(diǎn)，模擬大曲的微生態(tài)環(huán)境以不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對(duì)微生物進(jìn)行分離、純化，用細(xì)菌16S rRNA、真菌ITS-5.8S rRNA目的基因擴(kuò)增、序列同源性分析鑒定、構(gòu)建大曲中霉菌和酵母菌基于ITS-5.8S rRNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，確定并應(yīng)用純種分離技術(shù)分離大曲微生物各種菌株。結(jié)果表明，古井貢酒大曲微生物表現(xiàn)出高度的多樣性，窖泥中微生物很大一部分來(lái)源于大曲。

關(guān)鍵詞：純種分離技術(shù)；大曲；微生物；分離；鑒定

濃香型白酒風(fēng)味的形成除了與原料、釀造工藝有關(guān)，還與大曲的質(zhì)量有著重要聯(lián)系。大曲是濃香型白酒生產(chǎn)的前提，大曲中微生物的構(gòu)成與大曲的質(zhì)量有著直接的關(guān)系。微生物的表觀特征和系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性是分類(lèi)學(xué)中對(duì)生物分類(lèi)的兩種原則。16S rRNA是研究細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育最早的方法，由于其片段的足夠長(zhǎng)以及進(jìn)行過(guò)程中的保守性，在細(xì)菌鑒定領(lǐng)域已得到廣泛認(rèn)可。而5.8S rRNA由于序列過(guò)短，且過(guò)度保守，其在真菌鑒定方面最初并未得到認(rèn)可,但由于其兩端的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列具有相對(duì)較快的進(jìn)行速度，故結(jié)合ITS-5.8S rRNA使其非常適合真菌的系統(tǒng)發(fā)育分析。

1　材料與方法

1.1分析樣品

樣品來(lái)自于古井貢酒儲(chǔ)藏成熟的桃花曲，將曲塊粉碎待用。

1.2分離培養(yǎng)基

土豆培養(yǎng)基；YPD培養(yǎng)基；察氏培養(yǎng)基；醋酸鈉培養(yǎng)基；孟加拉紅培養(yǎng)基；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；高氏一號(hào)培養(yǎng)基；MRS培養(yǎng)基；巴氏培養(yǎng)基。

窖泥提取液培養(yǎng)基[1]：取窖泥50 g，加入200 mL水，充分搖勻，紗布過(guò)濾，滅菌。

1.3微生物發(fā)酵培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：土豆培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉2 %，硫酸銨0.3 %，磷酸二氫鉀0.1 %，MgSO40.1 %，CaCl20.2 %,吐溫80(0.025 %)，微量元素1 mL(微量元素：5.0 mg硫酸亞鐵；1.56 mg硫酸錳；1.4 mg硫酸鋅；2.0 mg氯化鈷，定容至1000 mL)。

淀粉培養(yǎng)基：可溶性淀粉2 %，牛肉膏0.5 %，Pep-tone 0.5 %，NaCl 0.5 %,加水至100 mL。

糖化酶培養(yǎng)基：葡萄糖0.1 %，可溶性淀粉1.9 %，其他同淀粉培養(yǎng)基。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1大曲中微生物的分離篩選

采用梯度稀釋的方法，每個(gè)梯度涂布4個(gè)平板，30℃培養(yǎng)，每天觀察分離平板，記錄菌落大小、顏色、邊緣特點(diǎn)、表面光滑程度并鏡檢來(lái)篩選菌株，挑取單菌落劃線培養(yǎng)保存。

1.4.2篩選菌株的分子鑒定

1.4.2.1細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系[1]

反應(yīng)體系：PCR Buffer( Mg2+) 5 μL；Forward primer 1 μL；Reverse primer 1 μL；10 mmol/L dNTP 1 μL；TaqDNA聚合酶3 μL；DNA模板2 μL；ddH2O 37 μL。

圖1　細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增條件

1.4.2.2真菌ITS-5.8S rRNA的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系

反應(yīng)體系：PCR Buffer 5 μL；10 mmol/L dNTP 1 μL；25 mM MgCl24 μL；Forward primer 1 μL；Reverse primer 1 μL；5 UTaqDNA聚合酶3 μL；DNA模板1 μL；ddH2O 34 μL。

圖2　真菌ITS-5.8S rRNA的PCR擴(kuò)增條件

1.4.2.3瓊脂糖凝膠電泳

將所擴(kuò)增的目的片段用1 %瓊脂糖電泳檢測(cè)，電壓150 V,電泳20 min。電泳結(jié)束后用UV凝膠成像儀采集照片。

1.4.2.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化

采用上海生工的PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行純化。純化的原理是微孔膜吸附大于100 bp的DNA片斷，而引物、酶、dNTP、單核甘酸等小片段可以用溶液洗滌除去。最后吸附到微孔膜上的DNA片斷用Elution Buffer或水洗脫下來(lái)。

1.4.2.5目的基因測(cè)序

將純化好的目的片段低溫保存，送上海生工測(cè)序。16S rRNA測(cè)序?yàn)殡p向測(cè)通兩個(gè)反應(yīng)，ITS-5.8S rRNA測(cè)序?yàn)閱畏较蛞粋€(gè)反應(yīng)。

1.4.2.6真菌ITS-5.8S rRNA同源性分析和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

所測(cè)得序列用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)在線比對(duì)，從NCBI上下載相似序列，用Clustal X以最大同源性原則進(jìn)行多序列比對(duì)，利用MEGA4.0軟件選用P-distance距離模式（Neighbor-Joining）來(lái)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),利用Bootstrap法重復(fù)1000次來(lái)檢測(cè)發(fā)育樹(shù)。

2　結(jié)果與分析

2.1大曲中微生物的分離篩選

從古井貢酒大曲中分離篩選出10株霉菌、酵母菌5株、12株細(xì)菌，霉菌有Aspergillus、Mucor、Lichtheimia、Paecilomyces 4個(gè)屬；酵母菌有Saccharomyces cerevisiae、Candida tropicalis、Pichia burtonii 3個(gè)屬；細(xì)菌共有4個(gè)屬，分別為Bacillus、Lactobacillus、Brevibacillus、Sporosarcina。

對(duì)篩選得到的微生物進(jìn)行表觀特征分析和顯微鏡鏡檢來(lái)去除冗余。表1中生理生化等信息是通過(guò)比對(duì)中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心或查閱相關(guān)資料獲得的。

2.2篩選菌株的分子鑒定

2.2.1基因組的提取結(jié)果

將基因組DNA用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其結(jié)果，電壓150 V，電泳20 min。一般基因組的提取往往是為了后續(xù)進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)（如目的基因的擴(kuò)增），故含有的一些彌散條帶并不影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2.2真菌的ITS-5.8S rRNA基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果

在圖3中，圖3A是大曲細(xì)菌16S rRNA目的基因的擴(kuò)增結(jié)果，泳道1～5為目的條帶，從圖中可看出，條帶單一，大小約為1500 bp。圖3B是大曲真菌的ITS-5.8S rRNA目的基因擴(kuò)增結(jié)果，從圖中可見(jiàn)，條帶單一，清晰，大小約600 bp，可進(jìn)行下一步純化實(shí)驗(yàn)。

2.2.3目的基因測(cè)序

將純化過(guò)后的目的條帶送上海生工測(cè)序，16S rRNA測(cè)序?yàn)殡p向測(cè)通兩個(gè)反應(yīng)，ITS-5.8S rRNA測(cè)序?yàn)閱畏较蛞粋€(gè)反應(yīng)。

2.2.416S rRNA和ITS-5.8S rDNA序列同源性分析

本次從古井貢酒大曲中共分離出10株霉菌，5株酵母菌。霉菌有Aspergillus、Mucor、Lichtheimia、Paecilomyces 4個(gè)屬；酵母菌有Saccharomyces cerevisiae、Candida tropicalis、Pichia burtonii 3個(gè)屬。霉菌中主要以曲霉屬為主，黑曲霉2株、米曲霉2株、溜曲霉1株、棘孢曲霉1株、傘枝犁頭霉1株、卷枝毛霉2株、擬青霉屬1株、酵母菌包括釀酒酵母2株[2]、假絲酵母2株、伯頓畢氏酵母1株。微生物分類(lèi)學(xué)認(rèn)為，全序列具有97 %～99 %相似性的判定為1個(gè)屬，將全序列具有99 %～100 %的定位1個(gè)種。而全序列相似性在93 %～95 %則可認(rèn)為屬于不同的屬。將本次研究獲得的15株菌株與NCBI中同源性比對(duì)過(guò)后，除了#Y2相似性為96 %以外，其他相似性均大于99 %（見(jiàn)表2）。

表1　大曲中真菌的菌落形態(tài)及相似性比對(duì)

圖3　16S rRNA和ITS-5.8S rRNA的PCR擴(kuò)增結(jié)果

表2　濃香型白酒大曲中ITS-5.8S rRNA的同源性比較結(jié)果

16S rRNA序列同源性分析：

從大曲中分離篩選出12株細(xì)菌，這12株細(xì)菌有4個(gè)屬，分別為Bacillus、Lactobacillus、Brevibacillus, Sporosarcina，其中乳酸菌屬Lactobacillus有4株，芽孢桿菌屬Bacillus有5株，短芽孢桿菌屬有1株，芽孢八疊球菌屬Sporosarcina有2株，通過(guò)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)此次所有序列相似性均高于97 %。這些菌株在窖泥中都能分離篩選到[3]，而濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中窖泥周期性地與酒醅中菌群、營(yíng)養(yǎng)成分相互交換等作用，說(shuō)明窖泥中的細(xì)菌很大一部分來(lái)源于大曲（表3）。

表3　大曲中細(xì)菌的同源性比較結(jié)果

2.2.5大曲中真菌基于ITS-5.8S rRNA和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

圖4　霉菌基于ITS-5.8S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（N-J）

由圖4的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可看出，霉菌主要分為四大類(lèi)菌群，#M3、#18、#19、#22為一類(lèi)，其中#M3、#19處于一小分支上，與Aspergillus oryzae(JN561266.1)和Aspergillus tamarii(FR851849.1)親緣關(guān)系比較近。#18、#22各自在一小分支上，分別與Aspergillus niger(HQ401273.1)、Paecilomyces sp(HM626196.1)親緣關(guān)系較近。雖然與Aspergillus aculeatus(JX501394.1)距離很近，但與其他曲霉屬距離較遠(yuǎn)。#M5與#1相對(duì)于#2、#M3、#18、#19、#22來(lái)說(shuō)處于相對(duì)較外群的位置，#M5與Mucor circinelloides (GQ376118.1)、Rhizomucor variabilis(FJ227895.1)親緣關(guān)系均比較近，但相似性上與Mucor更為接近，故判斷為Mucor菌屬。

由圖5的酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可看出，酵母主要分為三大分支，#Y2、#Y7處于一支，而#Y5、#9各自處在一分支上。#Y2、#Y7與Saccharomyces cerevisiae親緣關(guān)系較近，而#Y5、#9分別與Candida tropicalis、Pichia burtonii距離較近，這與NCBI同源性比較的結(jié)果也是一致的。

圖5　酵母菌基于ITS-5.8S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（N-J樹(shù)）

3結(jié)論

從古井貢酒的大曲中微生物分離篩選的結(jié)果來(lái)看，古井貢酒大曲中微生物菌群呈現(xiàn)明顯的多樣性。本次從古井貢酒大曲中共分離出12株細(xì)菌，10株霉菌，5株酵母菌。

從大曲中分離篩選出這12株細(xì)菌有4個(gè)屬，分別為Bacillus、Lactobacillus、Brevibacillus、Sporosarcina，其中乳酸菌屬Lactobacillus有4株，芽孢桿菌屬Bacillus有5株，短芽孢桿菌屬有1株，芽孢八疊球菌屬Sporosarcina 有2株，通過(guò)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后發(fā)現(xiàn)此次所有序列相似性均高于97 %。這些菌株在窖泥中都能分離篩選到，而濃香型白酒發(fā)酵過(guò)程中窖泥周期性地與酒醅中菌群、營(yíng)養(yǎng)成分相互交換等作用，說(shuō)明窖泥中細(xì)菌很大一部分來(lái)源于大曲。大曲中細(xì)菌的篩選鑒定結(jié)果也證明了與濃香型白酒發(fā)酵工藝是保持一致的。

從大曲中分離篩選出10株霉菌，其中曲霉屬是大曲中的優(yōu)勢(shì)菌屬，共有6株；曲霉屬是良好的糖化菌，其中黑曲霉的糖化酶較高，具有一定的發(fā)酵能力及產(chǎn)酸能力；而米曲霉的液化力較高，且可以產(chǎn)蛋白酶。

從大曲中分離篩選出的5株酵母菌有3個(gè)屬，釀酒酵母[4]是釀酒的主體發(fā)酵菌，是酒精的主要來(lái)源；而假絲酵母是生香酵母，可以產(chǎn)生酯化酶，促進(jìn)酯類(lèi)物質(zhì)的生成；而伯頓畢氏酵母（擬內(nèi)孢霉）也是產(chǎn)酯酵母，此外還能夠代謝產(chǎn)生一定的多元醇，可以增加白酒的綿甜感。

這些微生物對(duì)白酒、醬油等釀造的過(guò)程都起著重要的作用，也都是不可缺少的微生物。與國(guó)內(nèi)相關(guān)研究比較，此次從大曲中分離篩選的微生物與國(guó)內(nèi)的研究者也有著相似和不同的地方。劉效毅等[5]利用傳統(tǒng)的分離方

法從高溫大曲中分離出50株霉菌，主要包括曲霉屬、毛霉屬、青霉屬等菌屬，并篩選鑒定了20株典型菌株。張磊等[6]從濃香型白酒大曲中分離出典型的5株純培養(yǎng)菌株，并鑒定這5株菌株分別屬于Saccharomyces sp、Candida、Debaryomyces、Issatchenkia orientali、Saccharomyces cerevisiae。不同的地方主要是在文獻(xiàn)中報(bào)道的根霉此次并沒(méi)有分離出來(lái)。此外，從大曲中分離得到伯頓畢氏酵母也較少見(jiàn)報(bào)道。對(duì)于研究結(jié)果的差異性，一方面可能和釀酒酒廠的地理環(huán)境、釀酒工藝有關(guān)，另一方面也可能和大曲儲(chǔ)藏時(shí)間及分離方法的局限性有關(guān)。

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Isolation and Identification of Microbes in Gujing Daqu Based on Purebred Separation Technology

ZHOU Qingwu1, TANG Bin2, LIAnjun1and TANG Youhong1
(1.Anhui Gujing Gongjiu Distillery Co. Ltd., Bozhou,Anhui 236820; 2.Anhui Engineering Technology Research Center of Microbial Fermentation，Anhui Polytechnic University，Wuhu,Anhui 241000，China)

Abstract:According to the properties and growth characteristics of Daqu microbes, the microenvironment of Daqu was simulated and microbes were separated and purified by different culture mediums in different culture conditions. Through gene amplification and sequence homologous identification of bacteria 16S rRNA and fungus ITS-5.8S rRNA, the phylogenetic tree of mildew and yeast in Daqu was constructed. The results showed that, microbes in Gujing Daqu exhibited a high degree of diversity and a large number of microbes in pits came from Daqu.

Key words:purebred separation technology; Daqu; microbes; separation; identification

通訊作者：湯有宏，高級(jí)工程師，安徽古井貢酒股份有限公司技術(shù)中心，E-mail：tyouh@163.com。

作者簡(jiǎn)介：周慶伍，男，高級(jí)工程師，國(guó)家白酒評(píng)委，碩士，安徽古井貢酒股份有限公司總經(jīng)理，從事釀酒發(fā)酵技術(shù)管理與研究，發(fā)表論文十多篇。

收稿日期：2015-06-04

DOI：10.13746/j.njkj.2015251

中圖分類(lèi)號(hào)：TS261.1；TQ925.7；TS262.3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-9286（2016）03-0037-05

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-01-18；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160118.1430.004.html。