PKH26標(biāo)記的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在大鼠子宮內(nèi)膜的示蹤

韓　華，趙紅偉，康進(jìn)生，高海祥(.河北省人民醫(yī)院婦一科,河北 石家莊 05005；.河北省人民醫(yī)院消化科，河北 石家莊 05005；.河北省人民醫(yī)院功能神經(jīng)外科,河北 石家莊 05005；.河北省人民醫(yī)院呼吸科,河北 石家莊 05005)

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·論著·

PKH26標(biāo)記的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在大鼠子宮內(nèi)膜的示蹤

韓華1，趙紅偉2，康進(jìn)生3，高海祥4(1.河北省人民醫(yī)院婦一科,河北 石家莊 050051；2.河北省人民醫(yī)院消化科，河北 石家莊 050051；3.河北省人民醫(yī)院功能神經(jīng)外科,河北 石家莊 050051；4.河北省人民醫(yī)院呼吸科,河北 石家莊 050051)

[摘要]目的觀察PKH26標(biāo)記人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesencymal stem cells,UC-MSCs)在大鼠子宮內(nèi)膜的遷移分布情況，評價PKH26的標(biāo)記和示蹤效果。方法分離、培養(yǎng)UC-MSCs, 應(yīng)用PKH26進(jìn)行細(xì)胞標(biāo)記, 將標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)尾靜脈移植入大鼠體內(nèi)，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞向子宮內(nèi)膜遷移情況。結(jié)果PKH26標(biāo)記后細(xì)胞形態(tài)和生長活力無明顯差別，熒光顯微鏡下可見幾乎所有標(biāo)記細(xì)胞呈紅色熒光，主要分布于大鼠子宮內(nèi)膜腺上皮和間質(zhì)中。結(jié)論P(yáng)KH26熒光標(biāo)記是一種安全有效的標(biāo)記UC-MSCs的方法，可以用于干細(xì)胞移植方面的研究。

[關(guān)鍵詞]間充質(zhì)干細(xì)胞移植;子宮內(nèi)膜；細(xì)胞標(biāo)記

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.006

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一類多向分化潛能的成體干細(xì)胞，能進(jìn)行高度自我更新，在體外可以誘導(dǎo)分化為骨骼、肝臟、脂肪、神經(jīng)等多種組織細(xì)胞[1-2]，具有向受損組織歸巢、修復(fù)重建病變器官的特點[3-4]。其中人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesencymal stem cells,UC-MSCs)具有獲取簡便、免疫原性弱、增殖能力強(qiáng)、細(xì)胞含量高等優(yōu)點，已成為組織工程、基因治療和再生醫(yī)學(xué)研究中理想的干細(xì)胞來源。而在干細(xì)胞移植的研究中，選擇合適的方法對干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記和示蹤是非常重要的。本研究應(yīng)用PKH26在體外標(biāo)記培養(yǎng)的UC-MSCs，并將其經(jīng)尾靜脈途徑移植到大鼠體內(nèi)，觀察其在子宮內(nèi)膜遷移情況，評價PKH-26標(biāo)記和示蹤UC-MSCs的效果，旨在為下一步應(yīng)用UC-MSCs移植修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷奠定實驗基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1標(biāo)本來源選取2014年3月—2014年5月河北省人民醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的正常足月剖宮產(chǎn)新生兒臍帶5份。排除母兒各種傳染性疾病及家族遺傳病，獲得產(chǎn)婦及家屬知情同意。

本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2實驗動物、主要試劑及儀器實驗動物采用未交配的SD雌鼠5只，8～10周齡，體質(zhì)量220～260 g，購自河北省實驗動物中心。主要試劑及儀器有PKH26試劑盒(Sigma公司)、DMEM/F12培養(yǎng)液(Hyclone公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、胰蛋白酶/EDTA消化液(Hyclone公司)、超凈工作臺、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀、培養(yǎng)箱、離心機(jī)、無菌培養(yǎng)瓶等。

1.3UC-MSCs的分離、培養(yǎng)無菌取剖宮產(chǎn)新鮮臍帶約10 cm，用生理鹽水洗去臍帶中殘留血液，剪成2～3 cm的小段，再次進(jìn)行漂洗，從臍帶中間縱行剖開，剔除其內(nèi)1條臍靜脈、2條臍動脈，剝離華通膠。用眼科剪將華通膠剪碎成1 mm3的小組織塊，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，向其中加入含有體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液，在5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。用倒置顯微鏡每天觀察細(xì)胞生長情況。于1周后首次換液，此后3～4 d換液1次。觀察細(xì)胞長至80%～90%融合時，用胰蛋白酶/EDTA消化液消化傳代，在顯微鏡下控制消化時間。

1.4UC-MSCs的鑒定取第3代細(xì)胞，達(dá)到80%～90%融合時用胰蛋白酶/EDTA消化液消化，制成1×106/mL的細(xì)胞懸液，然后用流式細(xì)胞儀檢測CD29、CD44、CD90、CD105、CD34、CD45的表達(dá)。

1.5用PKH26標(biāo)記UC-MSCs(組織免疫熒光染色)取經(jīng)鑒定的UC-MSCs，制成單細(xì)胞懸液，DMEM/F12培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞，加入稀釋液C重懸細(xì)胞。按PKH26試劑盒說明書操作，在染色之前，將PKH26 染料應(yīng)用液(250倍稀釋)置入離心管，然后迅速將細(xì)胞液加入PKH26染液中，立即用吸管均勻、快速混合樣品，25 ℃孵育5 min，定時輕輕混勻充分，加入等量血清中止染色反應(yīng)，孵育1 min，用完全培養(yǎng)液稀釋，離心，去上清，將細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)入新的離心管中，PBS洗滌3次。加10 mL完全培養(yǎng)液，離心，重新懸置細(xì)胞至所需濃度,然后在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的染色情況和熒光強(qiáng)度。隨機(jī)選取其中5個視野，計算標(biāo)記率(暗視野下紅色熒光細(xì)胞數(shù)/明視野下細(xì)胞總數(shù))，平均值即為PKH26的即時標(biāo)記率。

1.6PKH26標(biāo)記的UC-MSCs在大鼠子宮內(nèi)膜組織中的示蹤觀察每日固定時間段行大鼠陰道涂片檢查，觀察大鼠動情周期，將PKH26標(biāo)記的UC-MSCs 1 mL經(jīng)尾靜脈途徑注射到動情期大鼠體內(nèi)，于移植后2個動情周期的動情期處死大鼠，取大鼠子宮制成冰凍切片，熒光顯微鏡觀察PKH26標(biāo)記的UC-MSCs在大鼠子宮內(nèi)膜組織的分布。

2結(jié)果

2.1 UC-MSCs的形態(tài)觀察及生長情況從臍帶組織中分離出華通膠，接種后1～2 d組織塊開始貼壁，7 d后可見部分細(xì)胞從組織塊周圍爬出，形態(tài)呈梭形、紡錘形，局部可成集落生長，14 d左右細(xì)胞可形成片狀融合達(dá)80%，呈旋渦狀形態(tài)生長，即可進(jìn)行1∶3傳代。細(xì)胞傳代后生長能力明顯增強(qiáng)，形態(tài)呈現(xiàn)均一的長梭形，類似成纖維細(xì)胞，成典型的旋渦狀排列生長(圖1～3)。此外，細(xì)胞在增殖傳代過程中形態(tài)無明顯變化。

2.2UC-MSCs表面標(biāo)志物測定用流式細(xì)胞儀檢測UC-MSCs的免疫表型，結(jié)果看到，原代培養(yǎng)的UC-MSCs能夠高表達(dá)CD44、CD90、CD105，但仍然表達(dá)一定程度的CD34、CD45，而第3代的UC-MSCs高度表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD105等間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志，幾乎不表達(dá)CD34、CD45等造血細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志和主要組織相容性抗原HLA-DR。

2.3UC-MSCs的標(biāo)記情況經(jīng)PKH26標(biāo)記后，UC-MSCs在熒光顯微鏡下觀察呈紅色熒光，細(xì)胞輪廓清晰，胞膜完整，紅色染料均勻分布在細(xì)胞表面，標(biāo)記率達(dá)100%。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后觀察，標(biāo)記細(xì)胞貼壁生長，形態(tài)良好(圖4)。

2.4標(biāo)記細(xì)胞子宮內(nèi)膜示蹤觀察PKH26標(biāo)記的UC-MSCs經(jīng)尾靜脈移植到大鼠體內(nèi)，移植后2個動情周期，熒光顯微鏡下可見標(biāo)記細(xì)胞散在分布于子宮內(nèi)膜間質(zhì)和腺上皮中，表現(xiàn)呈紅色熒光(圖5)，而未經(jīng)移植的正常大鼠子宮內(nèi)膜未見紅色熒光。

圖1 第1代細(xì)胞第1天的細(xì)胞形態(tài)(×100)

Firgure1 CellmorphologyofP1-1d(×100)

圖2 第1代細(xì)胞第2天的細(xì)胞形態(tài)(×100)

Firgure2 CellmorphologyofP1-2d(×100)

圖3 第1代細(xì)胞第4天的細(xì)胞形態(tài)(×100)

Firgure3 CellmorphologyofP1-4d(×100)

圖4 PKH26標(biāo)記的UC-MSCs(免疫熒光染色×200)

Firgure 4UC-MSCs labeled with PKH26 (immunofluorescence staining ×200)

圖5PKH26標(biāo)記的UC-MSCs在大鼠子宮內(nèi)膜組織和腺上皮的分布(免疫熒光染色 ×200)

A、B、C為子宮內(nèi)膜組織；D、E、F為子宮內(nèi)膜腺上皮

Firgure 5Distribution of UC-MSCs labeled with PKH26 in endometrial tissue and glandular epithelium(immunofluorescence staining ×200)

3討論

MSCs是來源于中胚層間充質(zhì)的成體干細(xì)胞，具有全能干細(xì)胞的特點，能進(jìn)行多向分化，主要存在于骨髓、臍血、臍帶、外周血等組織中。目前臨床和科研應(yīng)用MSCs的主要來源是骨髓和臍帶組織。由于骨髓取材困難、有創(chuàng)傷、易污染，且隨著年齡老化細(xì)胞數(shù)量和分化能力相對減少和減弱，因而限制了其臨床應(yīng)用。與其相比，人臍帶組織作為“醫(yī)療廢物”，取材方便，來源廣泛，不存在倫理問題，且細(xì)胞含量高、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低，可為實驗和臨床提供充足的MSCs來源[5]。因此，本實驗中采用臍帶組織，從臍帶華通膠中提取MSCs，采取尾靜脈注射方式移植入大鼠體內(nèi)，觀察干細(xì)胞移植后在體內(nèi)的遷移分化。

為追蹤觀察干細(xì)胞移植后在體內(nèi)的存活、遷移和分布情況，將干細(xì)胞加以標(biāo)記，以便進(jìn)行識別和監(jiān)測[6]。目前，常用的細(xì)胞標(biāo)記方法有基因轉(zhuǎn)染標(biāo)記法如綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)[7]、熒光染料標(biāo)記法[8]、熒光原位雜交標(biāo)記法[9]、核酸標(biāo)記法如5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BrdU) 、磁共振成像技術(shù)[10]、近紅外熒光成像技術(shù)[11]、Y染色體標(biāo)記示蹤、常染色體標(biāo)記示蹤、循環(huán)細(xì)胞標(biāo)記示蹤[12]等。其中，GFP的具體半衰期還未知，不利于在實驗中對時間的掌控，并且一些物理因素(如高溫等)和化學(xué)因素(如強(qiáng)酸等)可以破壞它的水化層或雙電層，對其進(jìn)行降解。BrdU的標(biāo)記率尚不理想，且細(xì)胞凋亡后釋放出的BrdU可能會摻入處于細(xì)胞周期S期的任何細(xì)胞，使移植細(xì)胞和宿主細(xì)胞難以辨別，因此可能會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。磁共振成像技術(shù)標(biāo)記效率高、細(xì)胞毒性小，但對試劑和檢測設(shè)備要求較高。Y 染色體標(biāo)記檢測試劑價格昂貴，應(yīng)用較困難。PKH26是一種親脂性的熒光染料，與細(xì)胞膜脂質(zhì)區(qū)發(fā)生不可逆的結(jié)合，對細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，并發(fā)出紅色熒光，產(chǎn)生穩(wěn)定、清晰、精確的熒光標(biāo)記細(xì)胞。既往研究表明，PKH26標(biāo)記的細(xì)胞種類廣，對細(xì)胞無明顯的不良反應(yīng)[13]，不影響細(xì)胞增殖、凋亡[14]，標(biāo)記后的細(xì)胞仍保留原有的生物學(xué)特性，而且標(biāo)記強(qiáng)度穩(wěn)定，具有良好的可重復(fù)性，因此目前主要用于細(xì)胞體外標(biāo)記、體外細(xì)胞增殖研究及體內(nèi)外細(xì)胞示蹤研究[15]。本研究中對UC-MSCs進(jìn)行PKH26標(biāo)記，結(jié)果顯示標(biāo)記細(xì)胞和未標(biāo)記細(xì)胞的生長狀態(tài)、凋亡周期、增殖能力均無明顯差別，表明PKH26標(biāo)記后，UC-MSCs的生物學(xué)特性無明顯改變，可用于研究UC-MSCs在體內(nèi)的遷移示蹤。實驗中，將標(biāo)記細(xì)胞經(jīng)尾靜脈途徑移植入正常大鼠體內(nèi)，移植后2個動情周期觀察，熒光顯微鏡下可見子宮內(nèi)膜間質(zhì)和腺上皮均有紅色熒光標(biāo)記，而正常大鼠子宮內(nèi)膜未見紅色熒光標(biāo)記物，表明PKH26可作為體內(nèi)示蹤的一項有效標(biāo)記方法。但本研究中只是采用正常大鼠，尚未對大鼠建立子宮內(nèi)膜損傷模型，在下一步實驗中我們將應(yīng)用無水乙醇致使大鼠子宮內(nèi)膜損傷，應(yīng)用干細(xì)胞進(jìn)行移植修復(fù)，觀察經(jīng)PKH26標(biāo)記的干細(xì)胞在子宮內(nèi)膜的示蹤情況。

綜上所述，應(yīng)用PKH26標(biāo)記UC-MSCs簡便易行、標(biāo)記率高、染色速度快、染色后不影響細(xì)胞生長特性，可示蹤UC-MSCs在體內(nèi)的遷移分布情況，為下一步進(jìn)行干細(xì)胞移植修復(fù)子宮內(nèi)膜損傷奠定了實驗基礎(chǔ)。但本實驗僅觀察了細(xì)胞移植后2個動情周期的組織形態(tài)，沒有進(jìn)行長期觀察，因此可以在后續(xù)的實驗中進(jìn)一步研究遠(yuǎn)期示蹤效果，觀察PKH26的長期示蹤情況。

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(本文編輯：許卓文)

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《河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》編輯部

Tracing effect of PKH26-labeled human umbilical cord mesenchymal stem cells in endometrium of rats

HAN Hua1， ZHAO Hong-wei2， KANG Jin-sheng3， GAO Hai-xiang4

(1.Department of Obstetrics and Gynecology, the People′s Hospital of Hebei Province, Shijiazhuang 050051, China; 2.Department of Gastroenterology, the People′s Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 050051, China； 3.Department of Neurosurgery, the People′s Hospital of Hebei Province, Shijiazhuang 050051, China；4.Department of Respiration,the People′s Hospital of Hebei Province, Shijiazhuang 050051, China)

[Abstract]ObjectiveBy labeling the human umbilical cord mesenchymal stem cells(UC-MSCs) with PKH26, the migration of cell in endometrium of rats were observed. Labeling and tracing effects of PKH26 were evaluated. MethodsIsolated human UC-MSCs were labeled with PKH26.The labeled cells were transplanted to rats through caudal vein. Then the distribution of cells in rat endometrium was observed under fluorescence microscope. ResultsThere were no detectable differences in cell morphology and growth after PKH26 labeling. And the cells were mainly labeled with red fluorescence under inverted fluorescence microscope and were mainly distributed in epithelial cells and stromal cells, in endometrial glandular epithelium and mesenchyme.ConclusionLabeling the human UC-MSCs with PKH26 is a safe and effective method, which can be used in the study of transplantation of stem cells.

[Key words]mesenchymal stem cells; endometrium; cells labeling

[中圖分類號]R617

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)03-0268-04

[作者簡介]韓華(1982-)，女，河北邯鄲人，河北省人民醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事婦產(chǎn)科疾病診治研究。

[基金項目]河北省衛(wèi)計委青年科技課題(20150122)

[收稿日期]2015-11-18；[修回日期]2015-12-03