青南高原多房棘球蚴myophilin基因的克隆和序列分析*

何順偉，張耀剛，李超群，彭 源，魏曉星，#

(1.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，青海 西寧 810016 )

青南高原多房棘球蚴myophilin基因的克隆和序列分析*

何順偉1，張耀剛2，李超群2，彭 源2，魏曉星1，2#

(1.青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，青海 西寧 810016 )

目的 克隆多房棘球絳蟲(Em)的myophilin基因并對(duì)其序列進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)。方法 提取Em原頭節(jié)總RNA，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增myophilin基因，將PCR產(chǎn)物連接入pGM-T載體，轉(zhuǎn)化入DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆送測(cè)序。采用生物信息學(xué)軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)分析，同時(shí)預(yù)測(cè)編碼蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、翻譯后修飾位點(diǎn)、結(jié)構(gòu)域和抗原表位。結(jié)果 擴(kuò)增出長度為576 bp的cDNA片段，包含完整開放閱讀框(ORF)，編碼190個(gè)氨基酸，與已知細(xì)粒棘球絳蟲的序列同源性達(dá)99%。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，編碼蛋白分子式為C935H1519N255O285S11，理論分子質(zhì)量為212 876，PI為8.66。α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲在二級(jí)結(jié)構(gòu)中所占的比例分別為51.58%、10.00%和38.42%。含有10個(gè)翻譯后修飾位點(diǎn)，各1個(gè)Calponin結(jié)構(gòu)域和CH結(jié)構(gòu)域，8個(gè)B細(xì)胞抗原表位和6個(gè)T細(xì)胞抗原表位。結(jié)論 成功克隆出Em的myophilin基因并對(duì)其進(jìn)行了有效分析和預(yù)測(cè)。

多房棘球蚴 親肌肉抗原 基因 克隆 序列 分析

細(xì)粒棘球絳蟲(Echinococcosis granulosa，Eg)和多房棘球絳蟲(Echinococcus multilocularis，Em)的幼蟲感染機(jī)體可分別引發(fā)囊型包蟲病(Cystic echinococcosis，CE)和泡型包蟲病(Alveolar echinococcosis，AE)，是我國西北畜牧地區(qū)流行的人畜共患寄生蟲病。近年來，免疫診斷和疫苗預(yù)防研究是包蟲病防控研究的重點(diǎn)[1]。而尋找靈敏特異的抗原是包蟲病免疫診斷和疫苗預(yù)防的基礎(chǔ)和前提[2]。

研究發(fā)現(xiàn)，親肌肉蛋白(myophilin)為棘球絳蟲的一種具有特異免疫原性的天然抗原，在CE的免疫研究中已取得良好的效果[3-5]，而目前在AE中的研究較少。因此，本研究擬從Em原頭節(jié)中克隆出myophilin基因，分析其基因序列，預(yù)測(cè)編碼蛋白屬性，為進(jìn)一步研究myophilin蛋白的免疫保護(hù)作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料選擇

Em原頭節(jié)來自青海西寧地區(qū)經(jīng)Em感染的小鼠。TRIzol?LS Reagent購自上海索萊寶公司；TIANScript RT Kit、2×Taq PCR MasterMix、GeneGreen核酸染料、D2000 DNA Marker、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、pGM-T連接試劑盒、DH 5α感受態(tài)細(xì)胞均購自北京天根公司。引物由上海生工公司合成，其中上游引物為5′-ATGGATCCATGTCGAACGTTCCACCTCC-3′，下游引物為5′-GCCTCGAGAATCTAATCCATGATCATGC-3′(下劃線為BamHI/Xhol酶切位點(diǎn))。

1.2 總RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

按TRIzol?LS Reagent的操作說明提取原頭節(jié)總RNA，隨后反轉(zhuǎn)錄成cDNA模板，置-20 ℃冰箱保存。

1.3 myophilin基因的擴(kuò)增與測(cè)序

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：cDNA 1 μL，2×Taq PCR MasterMix 10 μL，上、下游引物各1 μL，補(bǔ)水至20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將目的片段切膠回收，連接入pGM-T載體，轉(zhuǎn)化入E.coli DH 5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于培養(yǎng)皿上過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆測(cè)序(上海生工公司)。

1.4 myophilin基因序列分析

利用BLAST軟件(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)將測(cè)序結(jié)果同已報(bào)道的Eg的myophilin核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.5 myophilin蛋白預(yù)測(cè)

1.5.1 理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

使用ProtParam軟件(http：//expasy.org/tools/protparam.html)推算蛋白質(zhì)的基本理化性質(zhì)。

1.5.2 二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用GOR4軟件(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。使用SWISS-MODEL服務(wù)器(https：//swissmodel.expasy.org/)模擬蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.5.3 翻譯后修飾位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

使用MotifScan軟件(http：//myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)預(yù)測(cè)酰胺化、糖基化等翻譯后修飾位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)域。

1.5.4 抗原表位預(yù)測(cè)

使用DNAstar軟件的Protean模塊中不同分析方法預(yù)測(cè)蛋白抗原表位。選用Hopp-Woods親水性、Emini表面可及性、Karplus-Schulz柔性、Jameson-wolf抗原性指數(shù)4種參數(shù)綜合預(yù)測(cè)B細(xì)胞抗原表位。選用AMPHI和Rothbard-Taylor兩種方法聯(lián)合預(yù)測(cè)T細(xì)胞抗原表位。

2 結(jié)果

2.1 myophilin基因的擴(kuò)增與測(cè)序

采用RT-PCR技術(shù)從Em原頭節(jié)中擴(kuò)增出約576 bp的目的條帶(圖1)。

2.2 基因序列分析

經(jīng)測(cè)序后共得到576 bp的cDNA序列(圖2)。Blast比對(duì)顯示，該序列包含573 bp的開放閱讀框，編碼190個(gè)氨基酸。與Eg的myophilin核苷酸序列(GenBank：Z29075.1)和氨基酸序列(GenBank：CAA82316.1)同源性均為99%。編碼區(qū)有6個(gè)堿基不同，分別是54位的C-T、123位的A-G、287位的T-G、324位的T-C、351位T-C和528位的T-C；一處氨基酸有差異，為第96位的V-G(纈氨酸-甘氨酸)。

M：DNA標(biāo)志物(D2000)；1：目的基因，2：陰性對(duì)照

圖2 myophilin基因的測(cè)序結(jié)果圖

圖3 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果圖

2.3 蛋白預(yù)測(cè)

2.3.1 理化性質(zhì)

經(jīng)Protparam在線預(yù)測(cè)，myophilin蛋白Lys含量最多(10.5%)，His和Trp含量最少(0.5%)，理論分子量為212 876，pI為8.66，酸性氨基酸(D，E)為24個(gè)，堿性氨基酸(K，R)為27個(gè)。原子組成為C935H1519N255O285S11，不穩(wěn)定指數(shù)為31.97，半衰期為30 h(mammalian reticulocytes，in vito)。脂肪族氨基酸指數(shù)為82.11，總平均親水性為-0.473。

2.3.2 二、三級(jí)結(jié)構(gòu)

GOR4軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示(圖3)，α-螺旋占氨基酸總數(shù)的51.58%，β-折疊占10.00%，無規(guī)則卷曲占38.42%。運(yùn)用SWISS-MODEL軟件模擬蛋白的3D構(gòu)象(圖4)，該模型主要由4個(gè)α螺旋和1個(gè)β折疊以及多個(gè)無規(guī)則卷曲組成。

圖4 三級(jí)結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果圖

2.3.3 翻譯后修飾位點(diǎn)和結(jié)構(gòu)域

MotifScan特定位點(diǎn)分析結(jié)果顯示，myophilin蛋白可能存在以下翻譯后修飾位點(diǎn)：1處酰胺化位點(diǎn)(19-22位氨基酸)，2處N-糖基化位點(diǎn)(76-79、86-89位氨基酸)，1處酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位點(diǎn)(132-135位氨基酸)，4處N-肉豆蔻酰位點(diǎn)(55-60、98-103、170-175、179-184位氨基酸)，2處蛋白激酶C(PKC)磷酸化位點(diǎn)(64-66、171-173位氨基酸)?？赡艽嬖?處典型的蛋白結(jié)構(gòu)域：1處鈣調(diào)理蛋白結(jié)構(gòu)域(Calponin)，位于165-189位氨基酸和1處鈣調(diào)理蛋白同源結(jié)構(gòu)域(CH)，位于25-131位氨基酸。

2.3.4 抗原表位

用DNAstar軟件分析各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果(圖5，表1)。結(jié)合Hopp-Woods親水性、Emini表面可及性、Karplus-Schulz柔性和Jameson-wolf抗原性指數(shù)4種參數(shù)中分值較高的表位區(qū)域，預(yù)測(cè)出8個(gè)B細(xì)胞抗原表位，分別為15-29、41-48、72-77、110-115、130-136、145-161、169-177和181-188位氨基酸。結(jié)合AMPHI和Rothbard-Taylor兩種分析結(jié)果預(yù)測(cè)出6個(gè)T細(xì)胞抗原表位，分別為46-53、59-75、82-96、100-108、117-123和155-163位氨基酸。

圖5 DNAstar分析結(jié)果圖

表1 不同分析方法所得預(yù)測(cè)結(jié)果

3 討論

Myophilin基因編碼區(qū)全長573 bp，編碼190個(gè)氨基酸。Martin等[3]最早從Eg中克隆和鑒定出myophilin基因，因其編碼蛋白特殊的分布位置及與其他肌肉蛋白高度同源故稱之為親肌肉基因。隨后，他們克隆了397 bp Em的部分myophilin cDNA序列[6]。張靜等[7]首次克隆了我國大陸株Eg的myophilin基因，序列與Martin等報(bào)道的相一致。本研究從青南高原Em原頭節(jié)中成功擴(kuò)增出了myophilin基因完整的開放閱讀框，將測(cè)序結(jié)果與Eg的參考序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)二者相似度達(dá)99%，僅有6個(gè)堿基和1個(gè)氨基酸不同，而與前述報(bào)道Em的myophilin序列相一致。

氨基酸的排列順序決定了蛋白質(zhì)的特殊功能和高級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白的生物活性和天然構(gòu)象很大程度上依賴于其氨基酸的編碼區(qū)序列。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和廣泛應(yīng)用，使用生物信息學(xué)軟件分析和預(yù)測(cè)蛋白氨基酸序列，操作簡便、迅速，不僅可以清楚地了解蛋白的基本性質(zhì)，而且還可直觀地得到該蛋白的特殊結(jié)構(gòu)。本研究選用相應(yīng)的在線網(wǎng)絡(luò)軟件對(duì)Em的myophilin蛋白的理化性質(zhì)和二、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。推測(cè)該蛋白理論分子質(zhì)量為212 876，等電點(diǎn)為8.66，這與同源的Eg myophilin蛋白的研究結(jié)果相一致。預(yù)測(cè)的α-螺旋、β-折疊和無規(guī)則卷曲在二級(jí)結(jié)構(gòu)中所占的比例分別為51.58%、10.00%和38.42%，由于α-螺旋和β-折疊有利于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，無規(guī)則卷曲處有利于形成抗原表位，因此myophilin蛋白具有良好的穩(wěn)定性和較強(qiáng)的抗原性。通過對(duì)三維結(jié)構(gòu)的模擬，可以加深我們對(duì)其線性和空間結(jié)構(gòu)的了解。

甲基化、糖基化等常見的翻譯后修飾是蛋白質(zhì)成熟的必要程序，對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要[8]。Martin等[6]對(duì)Eg中myophilin蛋白的亞型和PKC磷酸化研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白與鈣結(jié)合蛋白不僅氨基酸序列高度同源，而且在組織定位、蛋白亞型、體外PKC磷酸化、相對(duì)保守區(qū)域等方面都十分相似，因此認(rèn)為myophilin蛋白很可能參與平滑肌收縮，與棘球絳蟲的肌肉運(yùn)動(dòng)有關(guān)。他們采用生物化學(xué)的方法體外證實(shí)myophilin蛋白含有兩個(gè)PKC位點(diǎn)(Ser-64、Ser-171)。同時(shí)通過二維蛋白電泳分離Eg幼蟲體內(nèi)的蛋白，獲得了4種myophilin蛋白亞型(α、β、γ、δ)，推測(cè)這些亞型可能為翻譯后修飾的結(jié)果。本研究預(yù)測(cè)myophilin蛋白可能含有10個(gè)翻譯后修飾位點(diǎn)和2個(gè)典型的蛋白結(jié)構(gòu)域，這同上述Eg中myophilin蛋白的生物學(xué)功能研究相一致。

Myophilin蛋白是一種保護(hù)性抗原。多項(xiàng)研究表明[9～11]，使用myophilin重組蛋白免疫小鼠，可使小鼠獲得較高的免疫保護(hù)力。此外，在旋毛蟲[12]、日本血吸蟲[13]和華支睪吸蟲[14]等蟲體中已相繼發(fā)現(xiàn)親肌肉蛋白或類似蛋白，并且實(shí)驗(yàn)證實(shí)這些蛋白都是特異性肌肉抗原。因此，myophilin蛋白是一個(gè)極具應(yīng)用潛能的診斷和疫苗候選分子。目前，信息學(xué)技術(shù)已逐漸成為蛋白抗原表位篩選的重要工具，為判斷蛋白是否具有疫苗分子潛力或者怎樣設(shè)計(jì)才能具有更好的免疫效果提供了便利條件。本研究使用DNAstar軟件中多個(gè)參數(shù)對(duì)myophilin蛋白的B、T細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測(cè)與分析，共評(píng)估出8個(gè)B細(xì)胞抗原表位和6個(gè)T細(xì)胞抗原表位，為后續(xù)保護(hù)性抗原表位的篩選提供參考。但myophilin蛋白能否作為Em有效抗原的基本條件和誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

本研究對(duì)Em的myophilin基因進(jìn)行了分析研究，從分子水平了解了Em的生理代謝、致病機(jī)制和生物學(xué)功能，為后續(xù)基于myophilin蛋白的包蟲病免疫診斷和疫苗研發(fā)提供了理論依據(jù)。

[1]Nunnari G，Pinzone MR，Gruttadauria S，et al.Hepatic echinococcosis：clinical and therapeutic aspects[J].World J Gastroenterol，2012，18(13)：1448-1458.

[2]趙莉，張旭，張狀志，等.包蟲病診斷技術(shù)與預(yù)防疫苗的研究進(jìn)展[J].疾病預(yù)防控制通報(bào)，2013，28(2)：84-87.

[3]Martin RM，Gasser RB，Jones MK.et al.Identification and characterization of myophilin，a muscle-specific antigen of Echinococcus granulosus[J].Mol and Biochem Parasitol，1995，70：139-148.

[4]Martin RM，Colebrook AL，Gasser RB，et al.Antibody responses of patients with cystic hydatid disease to recombinant myophilin of Echinococcus granulosus[J].Acta Tropica，1996，61：307-314.

[5]馬銳，師志云，李昭宇，等.細(xì)粒棘球絳蟲(中國大陸株)親肌肉抗原重組蛋白的免疫保護(hù)性研究[J].中國人畜共患病學(xué)報(bào)，2010，26(4)：330-332.

[6]Martin RM，Csar XF，Gasser RB，et al.Myophilin of Echinococcus granulosus：isoforms and phosphorylation by protein kinase C[J].Parasitology，1997，115(Pt 2)：205-211.

[7]張靜，趙嘉慶，王婭娜，等.細(xì)粒棘球蚴中國大陸株親肌肉基因分子克隆和序列分析[J].寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，28(3)：185-192.

[8]Garavelli JS，The RESID Database of Protein Modifications as a resource and annotation tool[J].Proteomics，2004，4(6)：1527-1533.

[9]馬銳，師志云，于晶晶，等.細(xì)粒棘球蚴中國大陸株親肌肉抗原重組蛋白的表達(dá)、純化及免疫學(xué)鑒定[J].寧夏醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2008，30(1)：1-3.

[10]于晶晶，王婭娜，趙巍，等.細(xì)粒棘球絳蟲(中國大陸株)親肌肉抗原重組蛋白誘導(dǎo)小鼠免疫應(yīng)答的研究[J].中國病原生物學(xué)雜志，2012，7(12)：909-911.

[11]Sun J，Wang Y，Li Z，et al.Echinococcus granulosus：immunoprotection accompanyied by humoral and cytokine response against secondary hydatidosis in mice immunized with rEg.myophilin[J].Vet Res Commun，2011，35(4)：193-200.

[12]趙香菊，王麗娜，王晶，等.旋毛蟲親肌肉抗原的基因克隆和序列分析[J].中國病原生物學(xué)雜志，2014，9(2)：168-171.

[13]Peng H，Song K，Huang C，et al.Expression，immunolocalization and serodiagnostic value of a myophilin-like protein from Schistosoma japonicum[J].Exp Parasitol，2008，119(1)：117-124.

[14]Wang L，Wang ZQ，Hu DD，et al.Proteomic analysis of Trichinella spiralis muscle larval excretory-secretory proteins recognized by earlyinfection sera[J].Biomed Res Int，2013，2013：139745.

Cloning and sequence analysis of the myophilin gene in Echinococcus multilocularis from Southern Qinghai Plateau

HE Shun-wei，ZHANG Yao-gang，LI Chao-qun，PENG Yuan，WEI Xiao-xing*

(1.Department of Ecologically-environment Engineering，Qinghai University；2.Department of Medical College，Qinghai University，Qinghai 810016，China)

Objective Cloning the myophilin gene in Echinococcus multilocularis，analysis and forecast of its sequence.Methods Total RNA was exacted from the protoscoleces of Em and the myophilin gene was cloned by reverse transcription RCR(RT-PCR).The PCR products were connected into the pGM-T vectors and then transformed into DH 5α competent cells.Positive clone was sequenced.Bioinformatics softwares were used to analysis the sequencing results and predict the physical and chemical properties，secondary structure，tertiary structure，post-translated modification sites，domains and antigen epitopes of the encoded protein.Results The 576 bp cDNA fragment was cloned，containing the complete open reading frame(ORF)and encoding 190 amino acids.The homology was up to 99% with the known sequence of Eg.Prediction results showed that the molecular formula of the encoded protein was C935H1519N255O285S11.Its theoretical molecular weight was 212876 and isoelectric point was 8.66.Alpha helix，β-sheet，and random coil accounted for 51.58%，10.00% and 38.42% in the secondary structure，respectively.There were 10 post-translated modification sites，a calponin domain，a CH domain，8 potentail B cell antigen epitopes and 6 potential T cell antigen epitopes in the myophilin protein.Conclusions The myophilin gene was cloned from Em successfully，and effective analysised and predicted.

Echinococcus multilocularis Myophilin Gene Cloning Sequence Analysis

*青海省科技廳項(xiàng)目(N0.2016-ZJ-746)；#：通訊作者，碩士生導(dǎo)師，Email：weixiaoxing@tsinghua.org.cn

R383.3

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.04.002

2016-09-25

何順偉(1988～)，女，漢族，河南籍，在讀碩士研究生