• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    大鼠腦、肝組織3種RNA相對(duì)表達(dá)量與死亡時(shí)間的關(guān)系

    2016-04-18 02:29:58董智杰
    關(guān)鍵詞:內(nèi)參腦組織引物

    董智杰,陳 亮,吳 岳△

    (1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院;2.青海省公安廳刑事技術(shù)研究管理中心)

    大鼠腦、肝組織3種RNA相對(duì)表達(dá)量與死亡時(shí)間的關(guān)系

    董智杰1,陳 亮2,吳 岳1△

    (1.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院;2.青海省公安廳刑事技術(shù)研究管理中心)

    目的 研究大鼠腦、肝臟組織3種RNA相對(duì)表達(dá)量與死亡時(shí)間的關(guān)系,比較兩組織用于死亡時(shí)間推斷的適用性。方法 將48只Wistar大鼠隨機(jī)分為6組,斷頸處死,分別于死后0、24、48、72、120、168 h取大鼠腦皮質(zhì)及肝右外葉。提取腦、肝組織總RNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)技術(shù)檢測(cè)兩組織中miR(腦特異性miR-124、肝特異性miR-122)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)mRNA的循環(huán)閾值(cyclic threshold,Ct)。用BestKeeper程序篩選內(nèi)參,對(duì)目的RNA的Ct值進(jìn)行2-ΔΔCt轉(zhuǎn)換,用SPSS及GraphPad軟件對(duì)其進(jìn)行單因素方差分析,并對(duì)ΔCt值進(jìn)行曲線回歸分析。結(jié)果 miR-124和miR-122分別為腦、肝組織的內(nèi)參。腦組織GAPDH、β-actin mRNA的相對(duì)表達(dá)量在死后72 h內(nèi)逐漸增加,并于死后72 h達(dá)到峰值,之后逐漸下降(P<0.05);而肝GAPDH、β-actin mRNA的相對(duì)表達(dá)量從死后48 h開始逐漸下降(P<0.05)。所有分子的最適回歸模型均為三次模型,且肝組織的相關(guān)系數(shù)r大于腦組織。結(jié)論 大鼠腦、肝組織中GAPDH、β-actin mRNA的相對(duì)表達(dá)量與死亡時(shí)間具有相關(guān)性,肝組織比腦組織更適用于死亡時(shí)間推斷。

    大鼠腦肝臟組織RNA表達(dá)量死亡時(shí)間

    準(zhǔn)確推斷死亡時(shí)間(postmortem interval,PMI)是刑事技術(shù)的一大挑戰(zhàn),而傳統(tǒng)的PMI推斷方法易受外界環(huán)境因素、個(gè)體差異及檢驗(yàn)者主觀因素和經(jīng)驗(yàn)的影響,準(zhǔn)確性較差。近年來(lái),研究者以分子生物學(xué)指標(biāo)為研究對(duì)象,將核酸(DNA、RNA)的降解[1]情況應(yīng)用于PMI推斷的研究中,但研究結(jié)果不一。本研究采用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)大鼠腦、肝臟組織miR(腦特異性miR-124、肝特異性miR-122)和GAPDH、β-actin mRNA的相對(duì)表達(dá)量,并分析其與PMI的關(guān)系,進(jìn)一步明確不同組織中不同RNA分子在PMI推斷中的應(yīng)用價(jià)值。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

    健康成年雄性Wistar大鼠48只,體重(250±20)g,購(gòu)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)SCXK(甘)2015-0002;于青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)7天(自由進(jìn)食進(jìn)水)。將大鼠隨機(jī)分為死后0、24、48、72、120、168 h六組,每組8只。將大鼠斷頸處死,置于溫度12±1 ℃、濕度40±2%的環(huán)境中,于死后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)取大鼠腦皮質(zhì)及肝右外葉,一部分組織凍存(-80℃),一部分組織制片(4%多聚甲醛固定,HE染色)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)試劑選擇

    4%多聚甲醛(北京Solarbio公司),無(wú)水乙醇、二甲苯(上海廣諾化學(xué)科技有限公司),濃鹽酸、氨水、冰醋酸(西安三浦化學(xué)試劑有限公司),蘇木素、伊紅(上海誠(chéng)凜生物科技有限公司),中性樹膠、50×TAE(北京biotopped公司),氯仿、異丙醇(上海中泰化學(xué)試劑有限公司),Trizol(美國(guó)Sigma公司),GeneGreen核酸染料、RNase-Free H2O、5*RNA電泳Loading Buffer(北京TIANGEN公司),BiowestAgarose(西班牙Biowest公司),RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(美國(guó)Thermo公司),gDNA Eraser、SYBR? Premix Ex TaqTMII (TliRNaseH Plus)(日本Takara公司)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)儀器選擇

    Leica TP1020型全自動(dòng)脫水機(jī)、Leica EG1150型石蠟包埋機(jī)、Leica EG1150C冷凍臺(tái)、Leica RM2126型輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)、攤片機(jī)、Leica H1220型烘片機(jī)(德國(guó)Leica公司),Thermo PrintMate150型組織盒書寫儀、NanoDrop 2000c核酸分析儀(美國(guó)Thermo公司),OLYMPUS BX41型系統(tǒng)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、IKAVortex Genius 3震蕩器(德國(guó)IKA集團(tuán)),SCILOGEXD1008E掌上離心機(jī)(美國(guó)SCILOGEX公司),Eppendorf Centrifuge 5424 R離心機(jī)、EppendorfMastercyclerpro S梯度PCR儀(德國(guó)eppendorf公司),F(xiàn)6/10 勻漿機(jī)(上海凈信科技),ABI 7500RT-qPCR儀(美國(guó)ABI公司),BIO-RAD GelDocXR+凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司),DYY-8C型電泳儀(北京市六一儀器廠)。

    1.4 實(shí)驗(yàn)

    1.4.1 總RNA提取

    取50~100 mg腦或肝組織,加入1 mL Trizol,冰上勻漿,室溫放置10 min。加0.2 mL氯仿,劇烈振蕩15 s,室溫放置10 min。4 ℃,12000×g離心15 min。取上層無(wú)色水相至新1.5 mL EP管中,加入0.5 mL異丙醇,顛倒混勻,室溫放置10 min。4 ℃,12000×g離心10 min,管底可見白色沉淀。棄上清,加入75%乙醇1 mL,渦旋混合,4 ℃,12000×g離心5 min。重復(fù)上一步驟,棄上清。在濾紙上倒置吸干,室溫干燥5 min。腦組織總RNA中加入90 μLRNase-Free H2O使其溶解,肝加入360 μL。用NanoDrop 2000 c核酸分析儀檢測(cè)RNA的濃度及純度、1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。分裝后凍存(-80℃)。

    1.4.2 引物合成

    miR反轉(zhuǎn)錄采用莖環(huán)引物,miR-124:5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATA

    CGACGGCATT-3',miR-122:5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCAAA

    CA-3'。miR-124、miR-122及GAPDH、β-actinmRNART-qPCR的引物序列均引自參考文獻(xiàn)[2-5],并由上海生工生物工程股份有限公司合成,其序列見表1。

    表1 各RNA指標(biāo)RT-qPCR引物序列

    1.4.3 gDNA去除與cDNA合成

    用gDNA Eraser去除總RNA中的gDNA,反應(yīng)體系10 μL:RNA 1 μg,gDNA Eraser 1 μL,5×gDNA Eraser Buffer 2 μL,RNase-Free H2O補(bǔ)足至10 μL;反應(yīng)條件:42 ℃ 2 min。用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒對(duì)上述RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,反應(yīng)體系20 μL:①RNA 1 μg,miR加入莖環(huán)引物2 μL(10 pmol/μL),GAPDH、β-actin mRNA加入Oligo(dT)18 primer 1 μL,RNase-Free H2O補(bǔ)足至12 μL;反應(yīng)條件:65 ℃ 5 min,冰上冷卻。②向上述12 μL體系中加入5×Reaction Buffer 4 μL,RiboLockRNase Inhibitor(20 U/μL)1 μL,10 mMdNTP Mix 2 μL,RevertAid M-MuLV RT(20 U/μL)1 μL;反應(yīng)條件:42 ℃ 60 min,70 ℃ 5 min。將上述反轉(zhuǎn)錄cDNA按1:10稀釋,分裝后凍存(-20℃)。

    1.4.4 RT-qPCR檢測(cè)

    用SYBR? Premix Ex TaqTMII 試劑盒進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng),反應(yīng)體系20 μL:SYBR Premix Ex Taq II(2×)10 μL,PCR Forward Primer(10 μM)0.8 μL,PCR Reverse Primer(10 μM)0.8 μL,ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL,cDNA模板2 μL,RNase-Free H2O 6 μL。用ABI 7500RT-qPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增條件:①Stage 1:95 ℃ 30 s;②Stage 2:95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,40 Reps;③ Stage 3:95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s。每個(gè)樣本3個(gè)復(fù)孔。Ct值由7500 Software v2.0.6軟件測(cè)得。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    運(yùn)用BestKeeper程序篩選腦、肝臟組織的內(nèi)參基因,將同一組織各候選基因的Ct值導(dǎo)入軟件,計(jì)算各基因標(biāo)準(zhǔn)差(SD)和變異系數(shù)(CV)的大小,其值越小,則該基因越穩(wěn)定。因此,選取標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)最小的RNA分子為內(nèi)參基因。除內(nèi)參外,以其余各RNA分子為目的基因,以大鼠死后0 h組為對(duì)照組,其余各組為處理組。將目的RNA分子的Ct值進(jìn)行2-ΔΔCt[ΔΔCt=(Ct目的RNA-Ct內(nèi)參)處理組-(Ct目的RNA-Ct內(nèi)參)對(duì)照組]轉(zhuǎn)換,表示處理組各樣本的表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組的倍數(shù),之后運(yùn)用SPSS 21.0及GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行單因素方差分析,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。并對(duì)內(nèi)參校正后的目的RNA分子的ΔCt(ΔCt=Ct目的RNA-Ct內(nèi)參)與PMI進(jìn)行曲線回歸分析。

    2 結(jié)果

    2.1 HE染色情況

    組織大體改變:死后24、48 h時(shí),腦、肝臟的形態(tài)未見明顯變化,之后組織變軟,色澤較晦暗。腦組織在死后72 h開始糊化,120 h及168 h時(shí)糊化加重,腦組織結(jié)構(gòu)尚完整。

    鏡下結(jié)果:死后不同時(shí)間腦和肝臟組織形態(tài)學(xué)變化分界不明顯。死后即刻,腦組織形態(tài)學(xué)變化較肝組織明顯,腦組織可見神經(jīng)元腫脹及紅色神經(jīng)元。各組腦、肝臟組織實(shí)質(zhì)細(xì)胞均可見空泡形成,核固縮、碎裂、溶解。隨著死亡時(shí)間的延長(zhǎng),肝細(xì)胞染色質(zhì)邊集逐漸明顯,死后168 h時(shí),肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清,肝索排列紊亂,細(xì)胞核溶解消失,核數(shù)量明顯減少。見圖1~2。

    A:0 h;B:24 h;C:48 h;D:72 h;E:120 h;F:168 h

    A:0 h;B:24 h;C:48 h;D:72 h;E:120 h;F:168 h

    2.2 RNA純度、濃度、完整性檢測(cè)及RT-qPCR結(jié)果

    用NanoDrop 2000c核酸分析儀檢測(cè)總RNA的純度及濃度,測(cè)得所有樣本的OD260/280在1.8~2.1之間,表明RNA的純度良好。濃度在356 ng/μL~933 ng/μL之間。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖3。表明腦組織總RNA在死后168 h內(nèi)未見明顯降解,而肝組織總RNA在死后120 h開始明顯降解。

    所有樣本的cDNA均進(jìn)行了有效擴(kuò)增,擴(kuò)增曲線良好,均得到Ct值。溶解曲線均為單峰,表明無(wú)引物二聚體及非特異性擴(kuò)增。

    圖3 腦(左)和肝(右)組織總RNA瓊脂糖凝膠電泳圖

    2.3 內(nèi)參基因篩選結(jié)果

    運(yùn)用BestKeeper程序篩選腦、肝臟的內(nèi)參基因,結(jié)果見表2。表2顯示,腦組織中miR-124的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)最小,肝組織中miR-122的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)最小。因此,將miR-124作為腦的內(nèi)參基因、miR-122作為肝的內(nèi)參基因。對(duì)兩組織中的GAPDH、β-actin mRNA的Ct值進(jìn)行內(nèi)參校正,得到ΔCt值。

    表2 腦和肝組織3種候選內(nèi)參基因表達(dá)穩(wěn)定性結(jié)果(Ct值)

    2.4 各RNA的相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCt與PMI的單因素方差分析結(jié)果

    大鼠死后不同時(shí)間腦和肝臟組織各RNA的相對(duì)表達(dá)量2-ΔΔCt的組間差異性比較結(jié)果見表3。大鼠腦組織GAPDH、β-actin mRNA的相對(duì)表達(dá)量在死后72 h內(nèi)逐漸增加,并于死后72 h達(dá)到峰值,之后逐漸下降(P<0.05);而肝GAPDH、β-actin mRNA的相對(duì)表達(dá)量從死后48 h開始逐漸下降(P<0.05)。其變化趨勢(shì)見圖4。

    表3 死后不同時(shí)間各RNA的相對(duì)表達(dá)量

    *:與同組織該分子0 h組相比P<0.05;△:與同組織該分子72 h組相比P<0.05.

    圖4 腦(左)和肝(右)組織各RNA相對(duì)表達(dá)量隨PMI的變化趨勢(shì)圖

    2.5 各RNA的ΔCt值與PMI的曲線回歸分析結(jié)果

    對(duì)腦和肝組織的GAPDH、β-actin mRNA的ΔCt值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以PMI為自變量x、ΔCt值為因變量y進(jìn)行曲線回歸分析,構(gòu)建一次、二次和三次模型,結(jié)果見表4,曲線圖見圖5。以腦GAPDH mRNA為例(見表4),相關(guān)系數(shù)r三次(0.659)>r二次(0.645)>r一次(0.310),且三個(gè)模型P<0.05。因此,三次模型可作為腦GAPDH mRNA的最適模型。同理,腦β-actin mRNA及肝GAPDH、β-actin mRNA的最適模型均為三次模型。腦組織與肝組織相比,腦組織兩RNA最適模型的相關(guān)系數(shù)r介于0.4~0.7之間,為中度相關(guān),而肝組織的大于0.7,為高度相關(guān)。因此,肝組織比腦組織更適用于PMI推斷。

    表4 各RNA的ΔCt值與PMI的回歸模型

    注:#為RNA指標(biāo)的最適模型.

    圖5 腦(A、B)和肝(C、D)組織GAPDH(A、C)、β-actin(B、D)mRNA的ΔCt值與PMI的回歸曲線圖

    3 討論

    本研究結(jié)果顯示,大鼠神經(jīng)元與肝細(xì)胞形態(tài)隨PMI發(fā)生變化,且大鼠腦和肝組織中GAPDH、β-actin mRNA的相對(duì)表達(dá)量與PMI具有相關(guān)性,肝臟比腦組織更適用于PMI推斷。

    大鼠死后,各組織缺血缺氧,膜穩(wěn)定性下降,溶酶體膜破裂,釋放出各種水解酶,使核酸、蛋白質(zhì)等物質(zhì)逐漸降解,表現(xiàn)為核固縮、碎裂、溶解,隨著PMI的延長(zhǎng),自溶加重,表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)不清直至消失。由于腦組織對(duì)缺氧更敏感,因此死后即刻神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化較肝細(xì)胞更為明顯。由于死后各組織缺血缺氧,導(dǎo)致細(xì)胞氧化磷酸化過(guò)程受阻,使ATP的合成減少,Na+-K+-ATP酶的功能下降,導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)水、鈉潴留,表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹。

    近年來(lái),RNA的穩(wěn)定性[6]得到證實(shí),通過(guò)RNA的降解情況尤其是定量檢測(cè)RNA的相對(duì)表達(dá)量推斷PMI成為研究的熱點(diǎn)。本研究通過(guò)RT-qPCR技術(shù)定量檢測(cè)大鼠死后不同時(shí)間腦和肝組織3種RNA的相對(duì)表達(dá)量來(lái)推斷PMI,不像普通RT-PCR技術(shù)只能在擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行粗略定量(分析擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖像),而RT-qPCR技術(shù)可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)擴(kuò)增全程,通過(guò)在DNA雙鏈間嵌入熒光基團(tuán)增加熒光信號(hào)強(qiáng)度,進(jìn)而監(jiān)測(cè)模板的表達(dá)量,更方便、準(zhǔn)確。RT-qPCR技術(shù)具有靈敏、快速、高效等優(yōu)點(diǎn)[7],但其結(jié)果的準(zhǔn)確性依賴于內(nèi)參的正確選擇和較小的操作誤差。本研究應(yīng)用BestKeeper程序,通過(guò)計(jì)算各分子的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù),以最小者作為內(nèi)參,并非在實(shí)驗(yàn)前默認(rèn)某個(gè)分子作為內(nèi)參,有效避免了因?qū)嶒?yàn)處理因素導(dǎo)致的內(nèi)參表達(dá)量的變化而引起的誤差;同時(shí)對(duì)每個(gè)樣本做3個(gè)復(fù)孔以減少人為操作誤差。本研究中腦和肝臟組織均選取3個(gè)候選內(nèi)參基因,miR在兩組織中表達(dá)最為穩(wěn)定,說(shuō)明其受PMI的影響較小,與Lv等[8-9]研究結(jié)果一致。miR的表達(dá)具有保守性和組織特異性,miR-124和miR-122分別在腦和肝臟組織中特異性高表達(dá),可有效減少個(gè)體差異引起的誤差;且其僅含有22個(gè)左右核苷酸,片段小,穩(wěn)定性強(qiáng),這些因素決定了miR為較理想的內(nèi)參,可提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)中miR在反轉(zhuǎn)錄的過(guò)程中采用莖環(huán)引物而非線性引物,莖環(huán)引物特異性高,可以區(qū)分miR前體及僅有個(gè)別堿基差異的miR分子[10]。

    本研究選取管家基因GAPDH和β-actin推斷PMI,因?yàn)楣芗一蚴蔷S持細(xì)胞基本生命活動(dòng)所必需的基因,在所有組織細(xì)胞中高豐度且恒定表達(dá),可減少個(gè)體差異造成的誤差。GAPDH是糖酵解過(guò)程中的酶,在缺氧條件下,機(jī)體通過(guò)上調(diào)GAPDH的表達(dá)量增加對(duì)葡萄糖的利用,以增加機(jī)體的能量供應(yīng)。機(jī)體死后一段時(shí)間,各組織細(xì)胞殘存部分活性,尚能感受機(jī)體缺氧狀態(tài),此時(shí)GAPDH的增加速率大于降解速率。因此,GAPDH mRNA的相對(duì)表達(dá)量在死后一段時(shí)間內(nèi)升高;隨著PMI的延長(zhǎng),糖酵解過(guò)程逐漸減弱,GAPDH的增加速率小于降解速率,表現(xiàn)為下降。腦組織處于相對(duì)封閉的環(huán)境中,有顱骨作為天然屏障,受外界因素影響較小[11],因此腦組織GAPDH mRNA的相對(duì)表達(dá)量表現(xiàn)為先升高后下降;而肝臟位于腹腔中,與腸管相鄰,所處環(huán)境含有大量細(xì)菌,且肝臟本身含有大量的酶,均加速GAPDH mRNA的降解,因此肝臟中降解速率大于腦組織,肝臟GAPDH mRNA沒(méi)有出現(xiàn)升高而是逐漸下降。β-actin參與構(gòu)成細(xì)胞骨架,是微絲的組成成分,在缺氧條件下,細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)可能遭到破壞或成分發(fā)生改變,使其相對(duì)表達(dá)量升高;β-actinmRNA在腦組織和肝臟中的變化原因同GAPDH。

    本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與Lv[5]、Pan[12]、呂葉輝[13]等不同,可能與死因、環(huán)境、組織類型等有關(guān)。在后續(xù)研究中應(yīng)添加動(dòng)物及人體驗(yàn)證模型,以檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。目前,用RNA的相對(duì)表對(duì)量推斷PMI仍處于理論研究階段,如何將理論研究結(jié)果應(yīng)用于法醫(yī)實(shí)踐將是未來(lái)研究的重點(diǎn)。

    [1]Mundorff A,Davoren J M.Examination of DNA yield rates for different skeletal elements at increasing postmortem intervals[J].Forensic Science International:Genetics,2014,8(1):55-63.

    [2]劉越.MicroRNA-124與腦缺血后腦室下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化關(guān)系的初步探討[D].南昌大學(xué),2012.

    [3]王成剛.rno-miR-122與rno-miR-182在對(duì)ACI大鼠移植性肝癌經(jīng)動(dòng)脈栓塞的相關(guān)功能性研究[D].復(fù)旦大學(xué),2013.

    [4]劉季,宋貞柱,謝潤(rùn)紅,等.大鼠死后腦組織RNA降解與死亡時(shí)間推斷的研究[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志,2007,22(4):226-228.

    [5]Lv Y H,Zhang H,Pan H,et al.Relationship between PMI and relative expression of myocardial various RNAs in rats died of different causes[J].Fayixuezazhi,2014,30(1):7-12.

    [6]Bauer M.RNA in forensic science[J].Forensic Science International:Genetics,2007,1(1):69-74.

    [7]紀(jì)冬,辛紹杰.實(shí)時(shí)熒光定量PCR的發(fā)展和數(shù)據(jù)分析[J].生物技術(shù)通訊,2009.

    [8]Lv Y,Ma K,Zhang H,et al.A time course study demonstrating mRNA,microRNA,18S rRNA,and U6 snRNA changes to estimate PMI in deceased rat's spleen[J].Journal of forensic sciences,2014,59(5):1286-1294.

    [9]Ma J,Pan H,Zeng Y,et al.Exploration of the R code-based mathematical model for PMI estimation using profiling of RNA degradation in rat brain tissue at different temperatures[J].Forensic Science,Medicine,and Pathology,2015,11(4):530-537.

    [10]王正,張霽,唐丹舟,等.microRNA的檢測(cè)技術(shù)及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2014,30(1):55-59.

    [11]安志遠(yuǎn),張曉東,鄭吉龍,等.腦組織與法醫(yī)學(xué)死亡時(shí)間推斷[J].中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志,2009,24(4):257-259.

    [12]Pan H,Zhang H,Lü Y H,et al.Correlation between five RNA markers of rat′s skin and PMI at different temperatures[J].Fayixuezazhi,2014,30(4):245-249.

    [13]呂葉輝,李志宏,托婭,等.不同溫度下大鼠腦組織RNA降解與早期 PMI 的相關(guān)性[J].法醫(yī)學(xué)雜志,2016,32(3):165-170.

    Relationship among relative expression levels of 3 kinds of RNA and postmortem intervalin brain and livertissues of rats

    DONG Zhi-jie1,CHEN Liang2,WU Yue1

    (1.Qinghai University Medical College;2.Department of Criminal Technology Research and Management Center,Qinghai Provincial Public Security)

    Objective To study the relationship between the relative expression levels of 3 kinds of RNA and postmortem intervalin two different tissues of brain and liver in rats,and to compare the applicability of the two tissues in the estimation of PMI.Methods 48 Wistar rats were randomly divided into 6 groups,and all of them were killed by neck dislocation.Atthe postmortem 0 h,24 h,48 h,72 h,120 h,168 h,cerebral cortex and right hepatic lobe were taken.Thentotal RNA of brain and liver tissues were extracted,and the cyclic thresholds(Ct values)of miR(brain specific miR-124,liver specific miR-122)and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH),beta -actin(β-actin)mRNA in the two tissues were detected by real-time fluorescence quantitative PCR(RT-qPCR).Theinternal reference was selected by BestKeeper program,and the Ct value of target RNA was converted into 2-ΔΔCt.Single factor variance analysis was used to examine 2-ΔΔCtby SPSS and GraphPad software,and the curve regression analysis was used to examine ΔCtvalue.Results MiR-124 and miR-122 were the most suitable internal reference in brain and liver tissues respectively.The relative expression levels of brain tissue GAPDH and β-actin mRNA increased gradually within the postmortem72 h,and the peak was reached at the postmortem 72 h,after the postmortem 72 h the relative expression levels decreased gradually(P< 0.05).The relative expression levels of hepatic GAPDH and β-actin mRNA decreased gradually after the postmortem 48h(P<0.05).The optimal regression models of all RNA were the cubic model.The correlation coefficient of liver tissue was larger than that of the brain tissue.Conclusion The relative expression levels of GAPDH and β-actin mRNA in brain and liver tissues of rats are correlated with PMI.The liver tissue is more suitable forthe estimation of PMI than the brain tissue.

    rats brain liver tissue RNA expression level postmortem interval

    R89

    A

    10.13452/j.cnki.jqmc.2016.04.008

    2016-06-12

    ※:董智杰(1990~),女,漢族,河南籍,青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院2014級(jí)碩士研究生.△:通信作者,碩士生導(dǎo)師,E-mail:1577697749@qq.com

    猜你喜歡
    內(nèi)參腦組織引物
    DNA引物合成起始的分子基礎(chǔ)
    高中生物學(xué)PCR技術(shù)中“引物”相關(guān)問(wèn)題歸類分析
    SSR-based hybrid identification, genetic analyses and fingerprint development of hybridization progenies from sympodial bamboo (Bambusoideae, Poaceae)
    內(nèi)參報(bào)道如何在全媒體時(shí)代“出圈”
    小腦組織壓片快速制作在組織學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用
    辦好黨報(bào)內(nèi)參的思考與探索
    芒果苷對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腦組織炎癥損傷的保護(hù)作用
    中成藥(2017年6期)2017-06-13 07:30:35
    火炬松SSR-PCR反應(yīng)體系的建立及引物篩選
    DNA雙加氧酶TET2在老年癡呆動(dòng)物模型腦組織中的表達(dá)及其對(duì)氧化應(yīng)激中神經(jīng)元的保護(hù)作用
    內(nèi)參影響力與媒體公信力
    新聞傳播(2015年10期)2015-07-18 11:05:39
    国产男靠女视频免费网站| 亚洲人成电影免费在线| 久久久精品欧美日韩精品| avwww免费| 午夜福利18| 精品人妻偷拍中文字幕| 不卡一级毛片| 国产免费一级a男人的天堂| 成年女人看的毛片在线观看| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产亚洲精品av在线| 人人妻人人看人人澡| 国产色婷婷99| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产综合懂色| 国产综合懂色| 99久久精品国产亚洲精品| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲内射少妇av| 国产三级黄色录像| 国产三级黄色录像| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 90打野战视频偷拍视频| 国产精品精品国产色婷婷| av在线天堂中文字幕| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲七黄色美女视频| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 午夜亚洲福利在线播放| 色播亚洲综合网| 超碰av人人做人人爽久久| av在线天堂中文字幕| 日日干狠狠操夜夜爽| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲黑人精品在线| 97热精品久久久久久| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 男人的好看免费观看在线视频| 青草久久国产| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲成av人片免费观看| 青草久久国产| 熟女人妻精品中文字幕| 精品无人区乱码1区二区| 国产淫片久久久久久久久 | 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产高清激情床上av| 草草在线视频免费看| 国产欧美日韩一区二区三| 国产精品,欧美在线| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 久久国产乱子免费精品| 永久网站在线| av在线蜜桃| 亚洲专区中文字幕在线| 国产精品影院久久| 亚洲精品日韩av片在线观看| 精品久久久久久久久亚洲 | 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲最大成人中文| 婷婷精品国产亚洲av| 精品不卡国产一区二区三区| av在线蜜桃| 人妻夜夜爽99麻豆av| 免费黄网站久久成人精品 | 国产aⅴ精品一区二区三区波| xxxwww97欧美| 免费在线观看成人毛片| 青草久久国产| 日韩欧美精品免费久久 | 少妇高潮的动态图| 婷婷亚洲欧美| 看十八女毛片水多多多| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 国产一区二区三区视频了| 一区二区三区高清视频在线| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 国产真实伦视频高清在线观看 | www.色视频.com| 香蕉av资源在线| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产黄a三级三级三级人| 一区福利在线观看| 亚州av有码| 淫秽高清视频在线观看| 舔av片在线| 国产精品日韩av在线免费观看| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 欧美日本视频| 天天一区二区日本电影三级| av福利片在线观看| 亚洲成人久久性| 亚洲精品一区av在线观看| 欧美日韩黄片免| av天堂中文字幕网| 国内精品一区二区在线观看| 久久久久久久久中文| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 特级一级黄色大片| 久久国产精品影院| 一区二区三区激情视频| 2021天堂中文幕一二区在线观| 高清日韩中文字幕在线| 日本免费a在线| 好男人在线观看高清免费视频| 国产69精品久久久久777片| 高潮久久久久久久久久久不卡| 18+在线观看网站| 午夜两性在线视频| 深夜a级毛片| 国产黄a三级三级三级人| 久久午夜福利片| 国产日本99.免费观看| 久久人妻av系列| 亚洲国产精品合色在线| 又粗又爽又猛毛片免费看| 丰满的人妻完整版| 亚洲无线在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲一区高清亚洲精品| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 大型黄色视频在线免费观看| 99久久精品热视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 精品欧美国产一区二区三| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 18+在线观看网站| 一本综合久久免费| 成人永久免费在线观看视频| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 日韩欧美在线乱码| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 天美传媒精品一区二区| 国产精品三级大全| 国产一区二区在线av高清观看| 日韩欧美免费精品| 超碰av人人做人人爽久久| 男女床上黄色一级片免费看| 国产精品av视频在线免费观看| 熟女电影av网| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| av欧美777| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 日本熟妇午夜| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲国产精品合色在线| 一进一出抽搐gif免费好疼| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 俄罗斯特黄特色一大片| 99精品久久久久人妻精品| 欧美黄色淫秽网站| 麻豆av噜噜一区二区三区| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 久久久久亚洲av毛片大全| 宅男免费午夜| 欧美成人a在线观看| 日本黄色片子视频| 国产av麻豆久久久久久久| 久久国产精品影院| av欧美777| 亚洲七黄色美女视频| 久久99热6这里只有精品| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 999久久久精品免费观看国产| 一区福利在线观看| 嫩草影院新地址| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产综合懂色| 全区人妻精品视频| 91麻豆精品激情在线观看国产| 嫩草影院入口| 特大巨黑吊av在线直播| 欧美日本视频| 老熟妇仑乱视频hdxx| 亚洲自偷自拍三级| 桃红色精品国产亚洲av| 久久99热6这里只有精品| 国产激情偷乱视频一区二区| 亚洲一区二区三区色噜噜| 久久精品国产清高在天天线| 69av精品久久久久久| 亚洲一区高清亚洲精品| 91在线观看av| 久久久久亚洲av毛片大全| 丰满乱子伦码专区| av女优亚洲男人天堂| 精品久久久久久久久久免费视频| 一级黄色大片毛片| 少妇丰满av| 欧美成人性av电影在线观看| 久久久国产成人精品二区| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久久久久久午夜电影| 午夜精品久久久久久毛片777| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 九九在线视频观看精品| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 69av精品久久久久久| 成熟少妇高潮喷水视频| 内射极品少妇av片p| 国产av在哪里看| 最近视频中文字幕2019在线8| x7x7x7水蜜桃| 亚洲午夜理论影院| 亚洲美女黄片视频| 色哟哟·www| 亚洲国产色片| 日日夜夜操网爽| 久久久久久九九精品二区国产| 床上黄色一级片| 午夜精品在线福利| 欧美一级a爱片免费观看看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 国产高清视频在线观看网站| 一本一本综合久久| 国内精品久久久久精免费| 久久精品91蜜桃| 亚洲18禁久久av| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲在线观看片| 欧美日韩黄片免| 国产一区二区激情短视频| 精品久久久久久久久av| 成人无遮挡网站| av在线老鸭窝| 国产精品一区二区性色av| 亚洲内射少妇av| 午夜激情福利司机影院| 欧美高清成人免费视频www| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产91精品成人一区二区三区| 高清毛片免费观看视频网站| 日本一本二区三区精品| 成年女人看的毛片在线观看| 精品午夜福利在线看| av女优亚洲男人天堂| 国内精品久久久久精免费| 久久久久久九九精品二区国产| 亚洲av成人av| 久9热在线精品视频| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 亚洲专区中文字幕在线| 欧美性猛交黑人性爽| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产伦在线观看视频一区| 亚洲精品成人久久久久久| 啪啪无遮挡十八禁网站| www.熟女人妻精品国产| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 日本 av在线| 最近视频中文字幕2019在线8| 能在线免费观看的黄片| 久久久久久久久中文| 亚洲自拍偷在线| 欧美zozozo另类| www.熟女人妻精品国产| 伊人久久精品亚洲午夜| 亚洲乱码一区二区免费版| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 1024手机看黄色片| 午夜日韩欧美国产| 午夜福利在线在线| 久久久久久久精品吃奶| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 欧美日韩综合久久久久久 | 精品国产亚洲在线| bbb黄色大片| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产高清视频在线播放一区| 国产一区二区激情短视频| 在线看三级毛片| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 日韩有码中文字幕| 韩国av一区二区三区四区| 日韩欧美精品v在线| 99久久无色码亚洲精品果冻| 乱码一卡2卡4卡精品| 永久网站在线| or卡值多少钱| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产精品1区2区在线观看.| 国产精品免费一区二区三区在线| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 特级一级黄色大片| 亚洲最大成人中文| 香蕉av资源在线| 99精品久久久久人妻精品| 国产午夜精品论理片| 午夜a级毛片| 毛片女人毛片| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 精品久久久久久,| 亚洲五月天丁香| 欧美最黄视频在线播放免费| 人人妻人人澡欧美一区二区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产视频一区二区在线看| АⅤ资源中文在线天堂| 久久久久性生活片| 亚洲色图av天堂| 久久99热这里只有精品18| 国产精华一区二区三区| 中文字幕av在线有码专区| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 最后的刺客免费高清国语| 国产激情偷乱视频一区二区| 深夜a级毛片| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 十八禁国产超污无遮挡网站| 精品人妻偷拍中文字幕| 日本a在线网址| 日本一本二区三区精品| 久久欧美精品欧美久久欧美| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美高清性xxxxhd video| 三级国产精品欧美在线观看| 乱人视频在线观看| 欧美高清性xxxxhd video| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看| 一二三四社区在线视频社区8| 最近在线观看免费完整版| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产精品综合久久久久久久免费| 性色av乱码一区二区三区2| 色综合欧美亚洲国产小说| 成人特级黄色片久久久久久久| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲人成网站在线播| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 丰满乱子伦码专区| 内地一区二区视频在线| 91久久精品电影网| 亚洲最大成人av| 极品教师在线视频| 亚洲一区二区三区色噜噜| 超碰av人人做人人爽久久| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 成人国产一区最新在线观看| 欧美激情在线99| 精品久久久久久久久久免费视频| 淫秽高清视频在线观看| 久久性视频一级片| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 日本精品一区二区三区蜜桃| 日本黄色片子视频| 日韩中文字幕欧美一区二区| 精品久久久久久久久av| 亚洲精品456在线播放app | 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 99国产综合亚洲精品| 国产在视频线在精品| 午夜免费成人在线视频| 一边摸一边抽搐一进一小说| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 少妇人妻精品综合一区二区 | 757午夜福利合集在线观看| 国产高清视频在线观看网站| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 在线天堂最新版资源| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 亚洲avbb在线观看| 成人毛片a级毛片在线播放| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久精品国产自在天天线| 亚洲人成电影免费在线| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产精品美女特级片免费视频播放器| 国产毛片a区久久久久| 99热只有精品国产| 久久九九热精品免费| 午夜精品一区二区三区免费看| 亚洲中文字幕日韩| 国产精品女同一区二区软件 | 精品久久久久久久久久久久久| 又紧又爽又黄一区二区| 日韩欧美三级三区| 美女cb高潮喷水在线观看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久国产精品影院| 亚洲18禁久久av| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久欧美精品欧美久久欧美| 午夜老司机福利剧场| 欧美日本视频| 精品久久久久久,| 成年人黄色毛片网站| 国产精品久久久久久久电影| 简卡轻食公司| 国产三级在线视频| 特大巨黑吊av在线直播| 丰满的人妻完整版| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 长腿黑丝高跟| 亚洲午夜理论影院| av视频在线观看入口| 亚洲av二区三区四区| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产精品一区二区性色av| 日韩有码中文字幕| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 午夜日韩欧美国产| 嫩草影院新地址| 亚洲av五月六月丁香网| 在线观看午夜福利视频| 国产午夜福利久久久久久| 成年人黄色毛片网站| 亚洲色图av天堂| 国产亚洲欧美在线一区二区| 久久伊人香网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 99视频精品全部免费 在线| 一夜夜www| 午夜日韩欧美国产| www.999成人在线观看| 亚洲久久久久久中文字幕| 午夜影院日韩av| 99精品久久久久人妻精品| 欧美日韩综合久久久久久 | 哪里可以看免费的av片| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 日本与韩国留学比较| 在现免费观看毛片| 国产精品98久久久久久宅男小说| 超碰av人人做人人爽久久| a级一级毛片免费在线观看| 国产精品久久久久久精品电影| 久久草成人影院| 大型黄色视频在线免费观看| 禁无遮挡网站| 波野结衣二区三区在线| 一级毛片久久久久久久久女| 真人做人爱边吃奶动态| 88av欧美| 亚洲第一电影网av| 一级a爱片免费观看的视频| 免费在线观看成人毛片| 亚洲成人久久性| 国产精华一区二区三区| 白带黄色成豆腐渣| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 一本综合久久免费| 久久精品综合一区二区三区| 免费在线观看日本一区| av欧美777| 免费看日本二区| av中文乱码字幕在线| 国产美女午夜福利| 国产免费一级a男人的天堂| 99riav亚洲国产免费| 亚洲经典国产精华液单 | 国产精品国产高清国产av| 免费大片18禁| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产大屁股一区二区在线视频| 一区福利在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| av女优亚洲男人天堂| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 一级毛片久久久久久久久女| 久久精品国产亚洲av天美| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲最大成人手机在线| 国产精品野战在线观看| 一a级毛片在线观看| 成年女人毛片免费观看观看9| 日本五十路高清| 精品无人区乱码1区二区| 国产精品综合久久久久久久免费| 最近最新免费中文字幕在线| 国产毛片a区久久久久| 搡老妇女老女人老熟妇| 国产在线男女| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲在线观看片| 88av欧美| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 嫩草影院精品99| 午夜日韩欧美国产| 九九热线精品视视频播放| 窝窝影院91人妻| 国产一区二区激情短视频| 脱女人内裤的视频| 国产高清视频在线观看网站| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲av.av天堂| 国产在视频线在精品| 我的女老师完整版在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 99久久精品热视频| 国产成人啪精品午夜网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 成熟少妇高潮喷水视频| eeuss影院久久| 成熟少妇高潮喷水视频| 少妇被粗大猛烈的视频| 成人亚洲精品av一区二区| 国产高清激情床上av| 成人一区二区视频在线观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 日本黄大片高清| 国产亚洲欧美98| 亚洲美女视频黄频| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| av欧美777| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 久久99热这里只有精品18| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 男女下面进入的视频免费午夜| 国产成人av教育| 欧美一区二区精品小视频在线| 最近在线观看免费完整版| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 亚洲av成人精品一区久久| 欧美一区二区亚洲| 久久精品91蜜桃| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品一及| 9191精品国产免费久久| a在线观看视频网站| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产成人啪精品午夜网站| 久久久久久久午夜电影| 免费av不卡在线播放| x7x7x7水蜜桃| 我的女老师完整版在线观看| 国产午夜精品论理片| 国产精华一区二区三区| 亚洲国产精品999在线| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 我要搜黄色片| 精品一区二区三区人妻视频| 婷婷丁香在线五月| 长腿黑丝高跟| 精品福利观看| 一级黄片播放器| 国产欧美日韩一区二区三| 在线观看舔阴道视频| 男插女下体视频免费在线播放| 日韩欧美精品v在线| 天堂网av新在线| 亚洲av熟女| 日韩人妻高清精品专区| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 欧美性感艳星| 色哟哟哟哟哟哟| 特大巨黑吊av在线直播| 国产亚洲欧美在线一区二区| 一级黄色大片毛片| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产欧美日韩精品亚洲av| 激情在线观看视频在线高清| 久99久视频精品免费| 亚洲片人在线观看| 亚洲中文日韩欧美视频| 一本久久中文字幕| 婷婷色综合大香蕉| 真人做人爱边吃奶动态| 日韩高清综合在线| 成人三级黄色视频| 丁香六月欧美| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产男靠女视频免费网站| 精品久久久久久久久久免费视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| xxxwww97欧美| 久久精品国产清高在天天线| 老司机深夜福利视频在线观看| 亚洲国产色片| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久性视频一级片| 久久精品国产自在天天线| 久久久久久久久中文| 午夜福利视频1000在线观看| 午夜福利欧美成人| 欧美高清成人免费视频www| 国产亚洲av嫩草精品影院| 欧美bdsm另类| 9191精品国产免费久久| 亚洲av免费高清在线观看| 午夜a级毛片| 中文资源天堂在线| 精品一区二区三区视频在线| 色综合亚洲欧美另类图片| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 熟女人妻精品中文字幕| 我的女老师完整版在线观看| 少妇熟女aⅴ在线视频| 午夜激情福利司机影院| 88av欧美| 亚洲av二区三区四区| 欧美3d第一页| 国产精品日韩av在线免费观看| 在线天堂最新版资源| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 国产成年人精品一区二区| 亚洲色图av天堂| 亚洲一区高清亚洲精品| 成年女人永久免费观看视频| 又紧又爽又黄一区二区|