核酸實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)高危HPV(16和18型分型)聯(lián)合TCT檢查應(yīng)用于宮頸癌篩查的價(jià)值分析※

李海萍，高博文

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤婦科；2.武警后勤學(xué)院)

核酸實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)高危HPV(16和18型分型)聯(lián)合TCT檢查應(yīng)用于宮頸癌篩查的價(jià)值分析※

李海萍1，高博文2

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤婦科；2.武警后勤學(xué)院)

目的 分析核酸實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法檢測(cè)高危HPV(16和18型分型)(PCR12+2)聯(lián)合TCT檢查應(yīng)用于宮頸癌臨床篩查中的價(jià)值。方法 將進(jìn)行宮頸癌篩查的480例受檢對(duì)象行宮頸脫落細(xì)胞的薄層液基細(xì)胞學(xué)(TCT)、核酸實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的同時(shí)，對(duì)HPV16和HPV18進(jìn)行分型檢測(cè)(PCR12+2)、陰道鏡活檢及組織病理學(xué)檢查。對(duì)檢測(cè)結(jié)果分組(TCT組、PCR12+2組、TCT聯(lián)合PCR12+2)評(píng)價(jià)、分析。結(jié)果 三組患者病理學(xué)檢查≥宮頸上皮內(nèi)瘤變Ⅱ級(jí)(CIN II)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3．35，P>0.05)；TCT組陽(yáng)性率為59.09%，PCR組為64.0%，聯(lián)合組檢測(cè)陽(yáng)性率為94.44%，聯(lián)合檢測(cè)的陽(yáng)性率明顯高于單獨(dú)對(duì)HPV16和HPV18進(jìn)行分型檢測(cè)的結(jié)果，差異具有顯著性(P<0.05)。結(jié)論 聯(lián)合核酸實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)高危HPV(16和18型分型)(PCR12+2)與TCT聯(lián)合檢查應(yīng)用于宮頸癌臨床篩查的陽(yáng)性診斷率高，具有更好的準(zhǔn)確性。

核酸實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法 HPV 液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查 宮頸癌

美國(guó)已將宮頸細(xì)胞HPV檢測(cè)作為宮頸細(xì)胞學(xué)檢查的輔助手段用于宮頸癌初級(jí)篩查。國(guó)際癌癥研究中心則認(rèn)為，可以將HPV檢測(cè)作為獨(dú)立的宮頸癌初級(jí)篩查的選擇之一[1]。有研究顯示，有15種HR-HPV感染與宮頸癌的發(fā)病密切相關(guān)，50%以上的宮頸癌是由HPV16感染導(dǎo)致，10%～15%的宮頸癌是由HPV18導(dǎo)致[2]。當(dāng)前臨床中應(yīng)用宮頸癌篩查的方法主要有宮頸涂片檢查、液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查等，對(duì)于患者疾病的診斷和治療具有重要意義。為探討HPV16和HPV18分型檢測(cè)在宮頸癌前病變和宮頸癌篩查中的臨床價(jià)值，本研究通過(guò)分組對(duì)照研究探討單獨(dú)液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查、實(shí)時(shí)熒光PCR同時(shí)對(duì)HPV16和HPV18進(jìn)行分型檢測(cè)(PCR12+2)，以及聯(lián)合兩種檢測(cè)方式的陽(yáng)性率，明確核酸實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)高危HPV(16和18型分型)聯(lián)合TCT檢查應(yīng)用于宮頸癌篩查的分析價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2013年1月～2015年12月之間來(lái)我院進(jìn)行宮頸癌篩查的480例受檢對(duì)象作為研究資料，年齡20～55歲，平均(39±12)歲。所有患者均出現(xiàn)程度不一的外陰瘙癢、白帶異常、性交出血、間歇性陰道出血等臨床癥狀。對(duì)觀察對(duì)象行TCT檢測(cè)、PCR12+2檢測(cè)和陰道鏡活檢及組織病理學(xué)檢查。

1.2 倫理和知情同意

所有觀察對(duì)象均知情同意，項(xiàng)目通過(guò)醫(yī)療倫理委員會(huì)審查。

1.3 方法

所有組患者給予TCT檢測(cè)，采用美國(guó)TriPath公司生產(chǎn)的AutoCyte Prep型自動(dòng)制片染色機(jī)系列制片，由具備細(xì)胞學(xué)診斷資質(zhì)的專業(yè)病理醫(yī)師負(fù)責(zé)細(xì)胞學(xué)診斷。細(xì)胞學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2001年國(guó)際癌癥協(xié)會(huì)的The Bethesda system(TBS)系統(tǒng)[3]。具體方法：使用特制塑料毛刷收集受檢對(duì)象宮頸外部鱗狀上皮與柱狀上皮交接位置宮頸管的脫落細(xì)胞，然后將組織標(biāo)本放入到振蕩器震蕩10 min；然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到裝有保存液的保存瓶中，在離心機(jī)上進(jìn)行離心處理，隨后將上層清液倒掉；使用稀釋液對(duì)底部收集得到的細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行稀釋，達(dá)到合適的比例之后再次使用振蕩器進(jìn)行均勻處理。放入到自動(dòng)制片機(jī)進(jìn)行高速打散處理，隨后吸附到膜管中，最終印制在玻片上，得到直徑為2 cm、細(xì)胞數(shù)在2萬(wàn)個(gè)左右的玻片；等待涂片自然干之后使用濃度為95%的酒精進(jìn)行固定處理，時(shí)間為15 min，隨后選擇應(yīng)用巴氏法進(jìn)行染色。

所有組患者給予核酸實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，采用廣東凱普生物有限公司生產(chǎn)的HR—HPV核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)HR、HPV，同時(shí)對(duì)HPV16和HPV18進(jìn)行分型檢測(cè)，可在同一反應(yīng)管中通過(guò)儀器的4種熒光檢測(cè)通道分別檢測(cè)：(1)不分型12種HR．HPV(31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，66，68)；(2)HPV16；(3)HPV18。

所有患者行陰道鏡活檢及組織病理學(xué)檢查。在陰道鏡下對(duì)醋酸上皮和碘試驗(yàn)不著色區(qū)進(jìn)行多點(diǎn)活檢，正常轉(zhuǎn)化區(qū)則取3、6、9、12點(diǎn)活檢。

1.4 患者的觀察指標(biāo)

對(duì)所有患者行不典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS)、高度病變鱗狀上皮細(xì)胞(HSIL)、低度病變鱗狀上皮細(xì)胞(LSIL)以及組織學(xué)檢查，根據(jù)TBS分類(lèi)法對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)。檢查結(jié)果為ASCUS、HSIL或者LSIL、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ、CA時(shí)認(rèn)定為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本研究中的相關(guān)數(shù)據(jù)均錄入到SPSS18.0軟件實(shí)施數(shù)據(jù)處理，三組患者的檢測(cè)結(jié)果采用百分比(%)的形式表現(xiàn)，以組織病理學(xué)檢查結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算三組篩查宮頸癌及癌前病變的敏感度、特異度及陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值。組間比較采用確切概率法，檢驗(yàn)比較采用卡方檢驗(yàn)。以P<0.05代表差異結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCT與組織病理學(xué)檢查結(jié)果的關(guān)系

480份標(biāo)本經(jīng)TCT檢測(cè)，陽(yáng)性結(jié)果經(jīng)陰道鏡和宮頸組織病理學(xué)檢查，以病變程度≥CINⅡ?yàn)殛?yáng)性，病變程度ASCUS為陽(yáng)性病例，TCT≤ASCUS為陰性病例。在TCT檢測(cè)為正?；蜓装Y患者中有7例陽(yáng)性患者，陽(yáng)性率為16.3%；ASCUS患者中共5例，陽(yáng)性率為11.6%；LSIL患者中共3例，陽(yáng)性率為7.0%；HSIL患者中共7例，陽(yáng)性率為16.3%；ASC-H患者中有12例患者，陽(yáng)性率為27.9%；AGC患者中共9例，陽(yáng)性率為20.9%。見(jiàn)表1。

表1 TCT檢測(cè)與組織病理學(xué)檢查結(jié)果的關(guān)系表 例(%)

CIN：宮頸上皮內(nèi)瘤變；CA：宮頸癌.

表2 TCT檢測(cè)與組織病理學(xué)檢測(cè)方法的比較結(jié)果

TCT檢測(cè)陰性患者中有12例宮頸癌癥患者，373例非癌患者；在TCT陽(yáng)性患者中有31例宮頸癌癥患者，64例非癌患者，經(jīng)卡方檢驗(yàn)，χ2為81.38，P為0.00，可見(jiàn)TCT檢測(cè)與病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)過(guò)組織病理學(xué)檢測(cè)證實(shí)，TCT檢測(cè)的敏感性為72.1%，特異性為85.4%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為32.6%，陰性預(yù)測(cè)值為96.9%。見(jiàn)表2。

2.2 PCR12+2與組織病理學(xué)檢查結(jié)果的關(guān)系

480例經(jīng)過(guò)PCR12+2法檢測(cè)，在43例確診為≥CINⅡ者中，確定HPV16陽(yáng)性共19例，陽(yáng)性率為44.2%；確定HPV18陽(yáng)性有8例，陽(yáng)性率為18.6%；確定其他HR-HPV陽(yáng)性共6例，陽(yáng)性率為14.0%；HR-HPV陰性患者共10例，陽(yáng)性率為23.3%。見(jiàn)表3。

表3 PCR12+2檢測(cè)與組織病理學(xué)檢查結(jié)果關(guān)系表例(%)

a：有2例為HPV16、HPV18陽(yáng)性者，經(jīng)過(guò)病理證實(shí)為炎癥，此例分別計(jì)人HPV16(+)、HPV18(+).

PCR檢測(cè)的陽(yáng)性患者中宮頸癌患者33例，陰性患者中有癌患者10例，經(jīng)卡方檢驗(yàn)得知，χ2為60.97，P為0.00，可以認(rèn)為PCR檢測(cè)結(jié)果與病理學(xué)檢查有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。經(jīng)過(guò)組織病理學(xué)檢測(cè)證實(shí)，PCR12+2作為診斷宮頸癌及其癌前病變篩查的的敏感性為76.7%，特異性為78.4%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為25.8%，陰性預(yù)測(cè)值為97.2%。見(jiàn)表4。

表4 PCR12+2檢測(cè)與組織病理學(xué)檢測(cè)方法的比較表

2.3 TCT聯(lián)合PCR12+2檢測(cè)與組織病理學(xué)檢查結(jié)果的關(guān)系

在病理學(xué)檢查確診的43例患者中，聯(lián)合檢測(cè)方法確診出40人，437例非宮頸癌患者中聯(lián)合檢測(cè)顯示陰性的人群有334例，經(jīng)過(guò)卡方檢驗(yàn)，χ2為90.28，P為0.00，可以認(rèn)為聯(lián)合檢測(cè)與病理學(xué)檢查的檢測(cè)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。聯(lián)合檢測(cè)的敏感性為93.0%，特異性為76.9%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為28.0%，陰性預(yù)測(cè)值為99.1%，可見(jiàn)該篩選方法用于區(qū)別是否患有宮頸癌的效率比較高。見(jiàn)表5。

表5 TCT聯(lián)合PCR12+2檢測(cè)與組織病理學(xué)檢查的關(guān)系表

2.4 三種篩選方法的比較

經(jīng)病理學(xué)檢測(cè)確診的43例宮頸癌患者中，經(jīng)TCT檢測(cè)出陽(yáng)性病例31例，12例假陰性；經(jīng)PCR12+2檢測(cè)出陽(yáng)性病例33例，10例假陰性；經(jīng)TCT聯(lián)合PCR12+2檢測(cè)，確診出陽(yáng)性病例40人，3例假陰性，三組篩選方案經(jīng)卡方檢驗(yàn)可知，χ2為6.65，P為0.04，小于0.05，可見(jiàn)三種檢測(cè)方案檢測(cè)能力有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。聯(lián)合檢測(cè)方案檢出正確率要比單獨(dú)的高，顯示聯(lián)合檢測(cè)方案的檢驗(yàn)準(zhǔn)確性更好。

3 討論

我國(guó)宮頸癌的發(fā)病率和死亡率均居于世界前列，占據(jù)全世界的三分之一[4]。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌會(huì)從早期宮頸CIN不斷演變，隨著時(shí)間的發(fā)展早期CIN逐漸演變?yōu)樵缙诮?rùn)癌，隨后發(fā)展為浸潤(rùn)癌。大量的研究結(jié)果顯示，早期宮頸原位癌的5年生存期超過(guò)100%，早期癌生存率在90%以上，而宮頸浸潤(rùn)性癌只有67%[5，6]。

根據(jù)美國(guó)陰道鏡和宮頸病理協(xié)會(huì)(American Society forColposcopy and Cervical Pathology，ASCCP)發(fā)布的指南建議：年齡≥30歲的婦女，如果宮頸細(xì)胞學(xué)檢查陰性，但HR、HPV陽(yáng)性可以選擇在12個(gè)月后復(fù)檢HPV和宮頸細(xì)胞，或者直接進(jìn)行HPV16和HPV18的分型檢測(cè)，如果檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性應(yīng)立即進(jìn)行陰道鏡檢查，而那些HPV16和(或)18陰性，但其他型別HR-HPV陽(yáng)性者，應(yīng)該在12個(gè)月后重復(fù)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查和HR-HPV檢測(cè)，葉波等對(duì)1374例宮頸鱗癌患者的HPV檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，HPV16和HPV18可以在74.3%的宮頸癌病例中被檢測(cè)到[7]。此外，HPV18還引起了超過(guò)35%的宮頸腺癌的發(fā)生，而宮頸腺癌通過(guò)現(xiàn)有的細(xì)胞學(xué)篩查手段是很難發(fā)現(xiàn)的。

本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果存在定量差異，許劍利[8]等回顧性分析了184例患者行高危型HPV檢測(cè)及TCT檢查，比較兩種檢測(cè)方法在宮頸癌篩查中陽(yáng)性和陰性預(yù)測(cè)值，結(jié)果顯示184例患者中63例病理檢查結(jié)果為陽(yáng)性，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值分別為34.23%、50.00%，陰性預(yù)測(cè)值分別為0、67.06%，二者應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用于宮頸癌的篩查具有更高的準(zhǔn)確性。臧元怡[9]等對(duì)2140例門(mén)診宮頸標(biāo)本同時(shí)行HR-HPV檢測(cè)和TCT檢查，結(jié)果顯示HR-HPV DNA檢測(cè)與TCT聯(lián)合檢測(cè)靈敏度(95.64%)、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值(43.07%)及陰性預(yù)測(cè)值(98.75%)與單獨(dú)檢查比較均有不同程度的提高(P<0.05)。本研究結(jié)果與其他研究結(jié)果存在定量差異，分析原因，考慮與樣本數(shù)量不同；TCT取材位置不當(dāng)(未包括整個(gè)宮頸液基表面，特別是絕經(jīng)后婦女，鱗柱交界退縮至頸管內(nèi)，刮片時(shí)不易刮到)；染色液未及時(shí)更換，核染色過(guò)淺，看不清染色質(zhì)結(jié)構(gòu)；光源不穩(wěn)定導(dǎo)致光線太弱看不清核的結(jié)構(gòu)，光線太強(qiáng)，核內(nèi)染色質(zhì)變淺，易把惡性誤認(rèn)為良性[10]；HPV檢測(cè)結(jié)果受實(shí)驗(yàn)溫度、pH等因素有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，TCT聯(lián)合HR-HPV檢測(cè)在宮頸癌篩查中均具有良好的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性：TCT與HR-HPV的PCR檢測(cè)均采用專門(mén)的采樣器采集子宮頸細(xì)胞樣本，并將樣本置入裝有細(xì)胞保存液的小瓶中進(jìn)行漂洗，可有效確保獲取足量、有效的宮頸脫落細(xì)胞樣本，同時(shí)前者通過(guò)對(duì)樣本進(jìn)行分散和過(guò)濾后，可有效清除宮頸黏液和炎性細(xì)胞，減少對(duì)檢測(cè)的干擾；而后者則可能通過(guò)熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤和實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過(guò)程，利用其高通量特性對(duì)HR-HPV基因亞型進(jìn)行同步檢測(cè)和篩查，從而準(zhǔn)確檢測(cè)HR-HPV及其分型，且二者相比于傳統(tǒng)病理學(xué)檢測(cè)，可有效減少樣本采集操作對(duì)患者的創(chuàng)傷，且操作也較為簡(jiǎn)單和快速，更適合于大范圍人群的篩查。故TCT聯(lián)合HR-HPV的PCR檢測(cè)適合作為臨床宮頸癌篩查方法[11]。

此外，本研究通過(guò)對(duì)不同方法篩查宮頸癌的效能進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)TCT聯(lián)合HR-HPV檢測(cè)的敏感度、準(zhǔn)確度明顯高于單獨(dú)TCT檢測(cè)，前者漏診率明顯低于后者，但兩種檢測(cè)方法在宮頸癌篩查中的特異度和誤診率基本相同。這可能是由于HR-HPV感染后人體后，引起機(jī)體宮頸黏膜的鱗狀上皮增殖而出現(xiàn)上皮細(xì)胞受損癥狀，顯著增加誘發(fā)宮頸病變的風(fēng)險(xiǎn)，檢測(cè)是否感染雖可協(xié)助醫(yī)師進(jìn)一步篩查宮頸癌，但并非所有HR-HPV患者會(huì)伴隨出現(xiàn)宮頸病變癥狀，且在HR-HPV感染并引起宮頸病變的過(guò)程中，可能需要一定的時(shí)間，同時(shí)出現(xiàn)宮頸病變后并非所有HR-HPV患者會(huì)發(fā)生發(fā)展為癌變，故其對(duì)宮頸癌變并無(wú)特異性，這也提示當(dāng)患者持續(xù)出現(xiàn)HR-HPV感染癥狀 ，其出現(xiàn)宮頸病變及癌變的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)呈持續(xù)不斷增加的趨勢(shì)，因此可將HR-HPV的PCR檢測(cè)作為宮頸癌篩查中必要的手段之一，并不斷擴(kuò)大篩查范圍，除有效提高宮頸癌篩查的敏感性和準(zhǔn)確性外，還可指導(dǎo)對(duì)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性者進(jìn)行早期的干預(yù)治療，進(jìn)而降低宮頸癌發(fā)生發(fā)展的風(fēng)險(xiǎn)，提高高危人群的治療療效。

綜上所述，TCT聯(lián)合HR-HPV的PCR檢測(cè)在宮頸癌篩查中具有更為良好的敏感性和準(zhǔn)確性，有利于避免漏診的發(fā)生，且具有操作簡(jiǎn)單、快捷、低創(chuàng)等優(yōu)點(diǎn)，值得臨床作進(jìn)一步推廣。

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Nucleic acid real-time fluorescence PCR detecting high risk HPV(type 16 and 18)combined with TCT to screen cervical cancer

LI Hai-ping1，GAO Bo-wen2

(Department of Gynecological Oncology，Qinghai University Affiliated Hospital；2.Logistics University of PAP)

Objective To analyze the value of nucleic acid real-time polymerase chain reaction method on detection of high risk HPV(16 and 18 type)(PCR12+2) combined with TCT to screen cervical cancer.Methods 480 cases of cervical cancer screening were examined as follows：Thin - layer liquid-based cytology(TCT)of cervical exfoliative cells and real-time PCR detection of nucleic acid，andclassification detection(PCR12+2)，colposcopic biopsy and histopathological examination of HPV6 and HPV18.Results There was no significant difference in pathological examination of cervical intraepithelial neoplasia(CIN II)among the three groups(χ2=3．35，P>0.05).The positive rate of each group were as follows：TCT group 59.09%，PCR group 64.0%，combined group 94.44%，respectively.The positive rate of combined detection was significantly higher than those of HPV16 and HPV18 which were carried out respectively，and the difference was significant(P<0.05).Conclusion The real-time PCR assay for detection of high-risk HPV(type 16 and 18)(PCR12+2)combined with TCT for cervical cancer screening show higher positive rate and better accuracy for diagnosis.

Nucleic acid RT-PCR HPV Thinprep Cytology Test Cervical cancer

※：青海省醫(yī)藥衛(wèi)生科技項(xiàng)目課題2015年指導(dǎo)性科研課題 李海萍(1972～)女，滿族，青海籍，副教授

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10.13452/j.cnki.jqmc.2016.04.010

2016-03-03