葎草中木犀草苷和蘆丁的提取工藝研究

趙留存 李莉 靳鳳云 　劉樂環(huán) 　唐秀勝

【摘 要】 目的：優(yōu)選葎草中木犀草苷和蘆丁的最佳提取工藝。方法：采用正交實(shí)驗(yàn)法，以乙醇濃度、乙醇用量、提取次數(shù)、提取時(shí)間為考察因素；采用UPLC以木犀草苷和蘆丁為考察指標(biāo)進(jìn)行含量測定，色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100mm×2.1mm，1.7μm）；流動(dòng)相：甲醇- 1%冰醋酸溶液（28∶72）；流速：0.15ml/min；檢測波長：350nm；柱溫：30℃。結(jié)果：木犀草苷和蘆丁的質(zhì)量濃度分別在25.8～645μg和12.5～313.2μg范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系；最佳提取工藝為加25ml 75%乙醇，回流提取三次，每次1h；影響提取的主次因素為：乙醇濃度>提取次數(shù)>提取時(shí)間>乙醇用量。工藝驗(yàn)證結(jié)果：木犀草苷和蘆丁的平均總量為0.267mg/g。結(jié)論：優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定、可行，有效成分提取率高。

【關(guān)鍵詞】 葎草；木犀草苷；蘆?。徽辉囼?yàn)；提取工藝

【中圖分類號】R284.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2016）06-0016-04

葎草為桑科植物葎草Humulus scandens （ Lour.） Merr.的全草，別名拉拉秧、鋸子草、五爪龍、降龍草等[1]，始載于《唐本草》[2-3]。葎草為一年或多年生草本，除青海、新疆以外，全國各地均有分布，另外東北亞、北美洲也有分布[4]。葎草含有黃酮類、萜類、揮發(fā)油類、甾體等化合物[5-7]，具有清熱解毒、利尿通淋功效，主治肺熱咳嗽、肺癰、虛熱煩渴、熱淋、水腫、小便不利、濕熱瀉痢、熱毒瘡瘍、皮膚瘙癢等癥[8-9]。目前，葎草的研究主要集中在紫外分光光度法測定葎草中總黃酮的量及HPLC法測定葎草中木犀草素和木犀草苷的含量[10-12]，為更好的控制葎草質(zhì)量，本文以葎草的有效成分木犀草苷和蘆丁為考察指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)法對葎草的提取工藝進(jìn)行考察，篩選出最佳提取工藝。為以后建立更加全面可靠的葎草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定研究基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 超高液相色譜儀（Waters Acquity UPLC H-Class系統(tǒng)，包括四元梯度泵、恒溫自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA檢測器和Empower3數(shù)據(jù)處理工作站，美國waters）；AE240電子天平（上海梅特勒有限公司）；AB204-S分析天平（上海臺(tái)衡儀器儀表有限公司）；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琦公司）；HS10260D型超聲波清洗器（天津奧泰儀器有限公司）；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海浦東物理光學(xué)儀器廠）。

1.2 材料 葎草采自貴陽市花溪區(qū)十里河灘，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院生藥教研室王祥培教授鑒定為Humulus scandens （ Lour.） Merr.；木犀草苷對照品（批號“111720-201106 ）、蘆丁對照品（批號：0080-97050，純度：98.6%）均購中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；水為純凈水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱定對照品木犀草苷、蘆丁適量，加甲醇適量制成每毫升含木犀草苷25.8μg，含蘆丁12.5μg的對照品溶液，備用。

2.2 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（100mm×2.1mm，1.7μm）；流動(dòng)相：甲醇-1%冰醋酸溶液（28∶72）；流速：0.15ml/min；檢測波長：350nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：1μl。木犀草苷和蘆丁與相鄰峰的分離度均大于1.5。UPLC色譜圖如下。

2.3 線性關(guān)系與靈敏度 分別精密吸取上述木犀草苷對照品溶液（25.8μg/ml）、蘆丁對照品溶液（12.5μg/ml）0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5μl ，在上述色譜條件下進(jìn)樣，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，得出木犀草苷線性回歸方程：Y=2.4×107X-16133（r=0.9998）；蘆丁線性回歸方程：Y=1.0×107X-2418.8（ r=0.9998），結(jié)果表明，木犀草苷和蘆丁質(zhì)量濃度分別在25.8～645μg和12.5～313.2μg范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。以3倍信噪比（S/N）對應(yīng)分析物濃度作為檢出限（LOD），木犀草苷LOD為310.8×10-3μg/ml，蘆丁LOD為150.6×10-3μg/ml；以10倍信噪比（S/N）對應(yīng)分析物濃度作為定量限（LOQ），木犀草苷LOQ為1036×10-3μg/ml，蘆丁LOQ為502×10-3μg/ml。

2.4 供試品溶液的制備 取本品粉末（過三號篩）約1.6g，精密稱定，置具塞圓底燒瓶中，精密加入75%乙醇25ml，密塞，稱定重量，回流提取40min，放冷，再稱定重量，用75%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。進(jìn)樣前用0.22μm微孔濾膜過濾，吸取1μl，注入超高液相色譜儀，照前述色譜條件進(jìn)行測定。

2.5 精密度 取木犀草苷和蘆丁對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，，每次進(jìn)樣1μl，分別測定峰面積，其中木犀草苷的峰面積RSD為1.32%，蘆丁的峰面積RSD為1.86%，表明儀器精密度良好。木犀草苷和蘆丁的平均回收率分別為98.28%和99.35%，RSD分別為2.94%和2.94。

2.6 葎草提取工藝的設(shè)計(jì)

2.6.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 參考文獻(xiàn)[12]，確定用乙醇為提取溶劑，采用回流提取方法，選擇提取工藝中對提取含量有影響的四項(xiàng)因素，即乙醇濃度A，乙醇用量B，提取次數(shù)C，提取時(shí)間D。以木犀草苷和蘆丁的總提取含量為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，采用四因素三水平正交試驗(yàn)表L9（34）設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，見表4。

2.6.2 正交試驗(yàn)方案及結(jié)果 由正交試驗(yàn)結(jié)果（見表5）和方差分析（見表6）可知：乙醇濃度、提取次數(shù)、提取時(shí)間對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而乙醇用量對實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，4個(gè)因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響大?。阂掖紳舛?gt;提取次數(shù)>提取時(shí)間>乙醇用量，四因素最優(yōu)水平組合是A2B1C3D2，即加25ml 75%乙醇回流提取3次每次1h。

2.6.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 取同一批藥材粉末，平行稱取三份，每份約1.6g，按最佳提取工藝A2B1C3D2進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測定葎草中木犀草苷和蘆丁的含量，結(jié)果三份藥材中木犀草苷和蘆丁的總量分別為0.258、0.279、0.263mg/g，因此木犀草苷和蘆丁的平均總量為0.267mg/g。工藝驗(yàn)證結(jié)果表明，通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)得到的葎草中木犀草苷和蘆丁的提取率較高、工藝穩(wěn)定、科學(xué)合理。

綜上可知，供試液的制備方法為：取葎草粉末（過三號篩）約1.6g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入75%乙醇25ml，加熱回流提取三次，每次1h，濾過，合并三次濾液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮近干，將濃縮液轉(zhuǎn)移至10ml容量瓶中，加75%乙醇至刻度，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾，即得。

3 討論

3.1 木犀草苷和蘆丁是葎草的有效成分，實(shí)驗(yàn)通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定了葎草中木犀草苷和蘆丁的顯著性影響因素，其中四因素中乙醇濃度是影響最大的因素，其次是提取次數(shù)、提取時(shí)間，乙醇用量對實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有影響，本實(shí)驗(yàn)為以后葎草木犀草苷和蘆丁的含量測定提供了最佳提取制備方法。

3.2 在葎草指標(biāo)性成分選擇中，先后選擇了木犀草素、大波斯菊苷、木犀草苷、蘆丁等，結(jié)果木犀草素和大波斯菊苷的含量都很低，測定木犀草素在提取過程中需要水解，時(shí)間相對較長，通過比較最后選擇以木犀草苷和蘆丁為指標(biāo)性成分。

3.3 本文通過UPLC法對葎草的提取工藝進(jìn)行研究，UPLC與HPLC相比，具有分析效率更高、分析時(shí)間更短、分離能力更強(qiáng)、靈敏度更高的優(yōu)點(diǎn)，為今后UPLC法測定葎草的含量提供了依據(jù)。

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（收稿日期：2015.12.30）