脂肪酶水解麥糟中脂肪的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究

許彬，李慧星，肖連冬，郝同飛（南陽(yáng)理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南南陽(yáng)473004）

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脂肪酶水解麥糟中脂肪的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究

許彬，李慧星，肖連冬，郝同飛
（南陽(yáng)理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，河南南陽(yáng)473004）

摘要：脫脂是制備麥糟膳食纖維的重要工序。實(shí)驗(yàn)利用脂肪酶水解麥糟中脂肪，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)曲面法考察并優(yōu)化影響反應(yīng)速率的因素。在優(yōu)化的條件下，依據(jù)中間復(fù)合物學(xué)說(shuō)，建立酶促動(dòng)力學(xué)方程。結(jié)果表明：在pH 7.0，溫度40℃，加酶量0.32 g，C(Mg)2+為0.108 mol/L條件下，反應(yīng)速率達(dá)0.67 mg/mL·h，酶促動(dòng)力學(xué)方程為。結(jié)果可為應(yīng)用脂肪酶水解麥糟中脂肪的生產(chǎn)強(qiáng)化和工程設(shè)計(jì)提供技術(shù)參考。

關(guān)鍵詞：麥糟；脂肪酶；動(dòng)力學(xué)；膳食纖維

麥糟是啤酒工業(yè)的主要副產(chǎn)物，富含非淀粉多糖[1-3]。利用它來(lái)生產(chǎn)“第七大營(yíng)養(yǎng)素”膳食纖維，具有良好的環(huán)境和經(jīng)濟(jì)效益。目前，酶堿法是制備麥糟膳食纖維的主要方法，采用脫脂、酶解、堿解工序脫除脂肪，淀粉和蛋白等[4-9]。前期研究中已指出利用脂肪酶脫脂具有可行性，取得了良好效果，且相比較于傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑法脫脂具有反應(yīng)條件溫和、無(wú)污染、無(wú)有機(jī)溶劑殘留等優(yōu)勢(shì)[10]。

反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究催化反應(yīng)速率的科學(xué)，考察各因素對(duì)反應(yīng)速率的影響，建立可靠而適用的動(dòng)力學(xué)方程，以期用數(shù)學(xué)原理和質(zhì)量作用定律來(lái)解釋反應(yīng)的進(jìn)程。反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究對(duì)于強(qiáng)化生產(chǎn)，工程設(shè)計(jì)和催化性能改進(jìn)具有重要的指導(dǎo)意義。酶催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的研究多采用Michealis和Menten提出的中間復(fù)合物學(xué)說(shuō)，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為酶催化反應(yīng)包括兩步，酶（E）與底物（S）首先結(jié)合形成中間復(fù)合物（ES），然后該復(fù)合物分解成產(chǎn)物（P）。此外，在中間復(fù)合物學(xué)說(shuō)基礎(chǔ)上建立的米氏方程已被廣泛應(yīng)用于描述各種酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)[11-13]。

試驗(yàn)研究脂肪酶水解麥糟中脂肪的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法考察影響反應(yīng)速率的因素，優(yōu)化條件。根據(jù)Michealis-Menten提出的學(xué)說(shuō)，建立描述酶促動(dòng)力學(xué)的米氏方程，并利用Wilkinson統(tǒng)計(jì)法[14]精確求解動(dòng)力學(xué)參數(shù)米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vm，以期為實(shí)現(xiàn)工程上應(yīng)用脂肪酶制備麥糟膳食纖維提供技術(shù)參考。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

麥糟（膳食纖維60.8 %，粗蛋白21.8 %，粗脂肪7.8 %，淀粉3.0 %，灰分3.0 %）：南陽(yáng)天冠啤酒有限公司；脂肪酶（pH6.5～10.5，溫度15℃～40℃，酶活力10 000 u/g）：南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；乙醚、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸鉀、硫酸亞鐵、氯化鈣、硫酸銅等試劑均為分析純。

TDL-4013臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；AR1140/C電子天平：上海奧豪斯公司；HHS21-4電熱恒溫水浴鍋：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；FW-100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1脂肪酶水解的單因素試驗(yàn)

酶促反應(yīng)體系是在250 mL三角瓶中進(jìn)行，加入麥糟5 g，添加一定量脂肪酶和金屬離子，反應(yīng)體系體積為100 mL，在一定的溫度、pH下振蕩反應(yīng)0.5 h后取出，迅速在沸水浴中加熱10 min鈍化酶，使反應(yīng)終止，離心后干燥至恒重。反應(yīng)速率定義為式1：

反應(yīng)速率/（mg/mL·h）＝

以反應(yīng)速率為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)考察溫度、加酶量、金屬離子、pH 4個(gè)因素的影響，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。

1.2.2響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)方案[15]進(jìn)一步研究溫度、加酶量和CMg2+對(duì)反應(yīng)速率的影響，考察因素的交互作用及顯著性，優(yōu)化條件。設(shè)變量X1、X2、X3分別代表溫度、加酶量和CMg2+，因素水平及編碼見(jiàn)表1。

表1試驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Code and level of factors chosen for the trials

1.2.3反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究

分別取4、6、8、10、12、14、16 g麥糟作為底物，在優(yōu)化得到的條件下，考察不同底物濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響，依據(jù)Michealis-Menten提出的中間復(fù)合物學(xué)說(shuō)，建立酶促動(dòng)力學(xué)方程，并通過(guò)Wilkinson統(tǒng)計(jì)法求解酶促反應(yīng)的2個(gè)重要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)，米氏常數(shù)Km（mg/mL）和最大反應(yīng)速率Vm（mg/mL·h）。

1.2.4脂肪的測(cè)定參考文獻(xiàn)[10]。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1溫度對(duì)反應(yīng)速率的影響

圖1為在加酶量0.25 g，pH6.5，溫度對(duì)反應(yīng)速率的影響。

圖1溫度對(duì)反應(yīng)速率的影響Fig.1 Effect of temperature on reaction velocity

反應(yīng)速率曲線為鐘罩形曲線，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與酶促反應(yīng)規(guī)律吻合，即溫度對(duì)反應(yīng)速率影響是溫度加速酶催化速率和溫度加速酶變性失活兩個(gè)方面的綜合。在25℃～40℃范圍內(nèi)，溫度未超過(guò)脂肪酶耐受的溫度，酶活性隨著溫度的升高而升高，反應(yīng)速率不斷增加。當(dāng)溫度超過(guò)40℃時(shí)，高溫使酶變性失活，隨著溫度的升高，酶的活性下降，反應(yīng)速率顯著降低。

2.1.2加酶量對(duì)反應(yīng)速率的影響

當(dāng)溫度為35℃，pH6.5時(shí)，加酶量對(duì)反應(yīng)速率的影響見(jiàn)圖2。

圖2加酶量對(duì)反應(yīng)速率的影響Fig.2 Effect of additional lipase amount on reaction velocity

根據(jù)中間復(fù)合物學(xué)說(shuō)，酶促反應(yīng)在底物過(guò)量情況下，加酶量的增加，可以提供更多的酶活性位點(diǎn)催化底物生成產(chǎn)物，理論上，反應(yīng)速率應(yīng)與加酶量呈正比例關(guān)系。由圖2可以看出，反應(yīng)速率隨著加酶量的增加而提高，但當(dāng)加酶量為0.30 g時(shí)，繼續(xù)提高加酶量，酶與底物的接觸位點(diǎn)逐漸趨于飽和，反應(yīng)速率的增加幅度較小。

2.1.3金屬離子對(duì)反應(yīng)速率的影響

溫度35℃，pH6.5，加酶量0.25 g條件下，Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+和Cu2+5種金屬離子對(duì)反應(yīng)速率的影響見(jiàn)圖3。

圖3金屬離子對(duì)反應(yīng)速率的影響Fig.3 Effect of metal ion on reaction velocity

金屬離子可以是酶的激活劑，也可以是酶的抑制劑，大多情況下，金屬離子是酶的激活劑，即能提高酶活性，加速酶促反應(yīng)的進(jìn)行。此外，不同金屬離子對(duì)酶的激活作用具有一定選擇性。由圖3可知，Ca2+、Mg2+、Fe2+、Zn2+4種金屬離子是脂肪酶的激活劑，并且隨著金屬離子濃度的增加，反應(yīng)速率不斷提高，其中Mg2+的激活作用較明顯，而Ca2+、Fe2+和Zn2+3種金屬離子的激活作用不明顯。添加Cu2+，酶活性被抑制，且提高Cu2+濃度，反應(yīng)速率降低，可知Cu2+是脂肪酶的抑制劑。

2.1.4 pH對(duì)反應(yīng)速率的影響

在溫度35℃，加酶量0.25 g的條件下，pH對(duì)反應(yīng)速率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 pH對(duì)反應(yīng)速率的影響Fig.4 Effect of pH on reaction velocity

隨著pH的變化，酶、底物可處在不同的解離狀態(tài)，會(huì)影響酶和底物的結(jié)合，從而影響酶促反應(yīng)速率。由圖4可以看出，pH和反應(yīng)速率的變化曲線為鐘罩形，在pH6.0～9.0范圍內(nèi)，反應(yīng)速率隨著pH的增加而提高，但當(dāng)pH7.0時(shí)，繼續(xù)提高pH，反應(yīng)速率提高幅度較小。當(dāng)pH10.0時(shí)，反應(yīng)速率突然下降，可能是超出了酶生理pH范圍，改變了酶活性構(gòu)象，使酶活性降低?？紤]到實(shí)際應(yīng)用生產(chǎn)過(guò)程，中性pH對(duì)操作和設(shè)備的要求低，因此在試驗(yàn)選擇的水平范圍內(nèi)，選擇pH 7.0。2.2響應(yīng)曲面法優(yōu)化條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法的Box-Behnken試驗(yàn)方案優(yōu)化條件，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，因素的方差分析見(jiàn)表4。

表3試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 3 Experimental designs and results

表4因素方差分析Table 4 Analysis of mean square deviation of factors

由表4可知，F(xiàn)X1×X1、FX2×X2>F0.01（1，5）=16.25，表明溫度二次項(xiàng)和加酶量二次項(xiàng)的影響高度顯著；F0.01（1，5）=16.25> FX2、FX3、FX3×X3>F0.05（1，5）=6.61，表明加酶量、CMg2+及CMg2+二次項(xiàng)的影響顯著。

通過(guò)SAS8.0軟件優(yōu)化得到的條件為：X1=0、X2=0.2、X3=0.4，即溫度40℃，加酶量0.32 g，CMg2+為0.108 mol/L，該條件下，模型預(yù)測(cè)反應(yīng)速率0.68 mg/mL·h。在該條件下，重復(fù)試驗(yàn)3組，結(jié)果見(jiàn)表5，反應(yīng)速率為0.67 mg/mL·h，變異系數(shù)1.59 %，結(jié)果穩(wěn)定，可靠。

表5重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of repeated experiment

2.3酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

pH7.0，溫度40℃，加酶量0.32 g，CMg2+為0.108 mol/L條件下，底物濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響見(jiàn)圖5。

圖5底物濃度對(duì)反應(yīng)速率的影響Fig.5 Effect of substance concentration on reaction velocity

隨著底物濃度的增加，反應(yīng)速率不斷提高，在底物濃度較低時(shí)，反應(yīng)速率隨底物濃度增加而急劇增加。隨著底物濃度的增加，反應(yīng)速率的提高幅度逐漸減小，反應(yīng)速率趨于恒定。試驗(yàn)根據(jù)Michealis-Menten提出的中間復(fù)合物學(xué)說(shuō)，酶（E）與底物（S）首先結(jié)合成二元中間復(fù)合物（ES），ES分解為產(chǎn)物（P）和釋放酶，其反應(yīng)方程為式2：

用米氏方程（式3）擬合圖5中試驗(yàn)數(shù)據(jù)，建立酶促動(dòng)力學(xué)方程[16]。

式中：CS為底物濃度，（mg/mL）；Vm為最大反應(yīng)速率，（mg/mL·h）；Km為米氏常數(shù)，（mg/mL）。

米氏方程中兩個(gè)重要?jiǎng)恿W(xué)參數(shù)米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vm的求解常用Lineweaver-Burk法[d]，但要求底物濃度在0.33 Km～2.0 Km范圍內(nèi)才比較準(zhǔn)確，否則求解的誤差較大。Wilkinson統(tǒng)計(jì)法是包括非線性求估算解和泰勒展開(kāi)式求精校解，可以克服底物濃度過(guò)大或過(guò)小造成的計(jì)算誤差，其求解結(jié)果較為可靠[11]。采用Wilkinson統(tǒng)計(jì)法求解Km和Vm，計(jì)算過(guò)程如表6和表7。

表6 Wilkinson法求估算解Table 6 Calculate the provisional value by Wilkinson method

表7 Wilkinson法求精校解Table 7 Fine adjustment of value by Wilkinson method

式4中：Km0是米氏常數(shù)的估算解；式5中Vm0是最大反應(yīng)速率的估算解；式6、式7中b1和b2為計(jì)算過(guò)程中的修正常數(shù)。式8和式9為米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率Vm的精確解。建立的酶促動(dòng)力學(xué)方程如式（10）所示：

3　結(jié)論

1）脂肪酶水解麥糟中脂肪的過(guò)程中，溫度二次項(xiàng)和加酶量二次項(xiàng)對(duì)反應(yīng)速率的影響高度顯著，而加酶量、CMg2+及CMg2+二次項(xiàng)的影響顯著。在選擇的水平范圍內(nèi)，優(yōu)化得到的條件是：pH 7.0，溫度40℃，加酶量0.32 g，CMg2+為0.108 mol/L，該條件下反應(yīng)速率達(dá)0.67 mg/mL·h。

2）根據(jù)Michealis-Menten提出的中間復(fù)合物學(xué)說(shuō)，采用Wilkinson統(tǒng)計(jì)法精確求解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，在優(yōu)化的條件下，建立了脂肪酶水解麥糟脂肪的酶促動(dòng)

參考文獻(xiàn)：

[1] S I Mussatto, G Dragone, I C Roberto. Brewers’spent grain: generation, characteristics and potential applications[J]. Journal of Cereal Science, 2006, 43:1-14

[2] D Macheiner, B F Adamitsch, F Karner, et al. Pretreatment and hydrolysis of brewer’s spent grains[J]. Eng Life Sci, 2003, 3(10):401-405

[3] V Stojceska, P Ainsworth. The effect of different enzymes on the quality of high-fibre enriched brewer’s spent grain breads[J]. Food Chemistry, 2008, 110 :865-872

[4]邱雁臨.生物技術(shù)在啤酒糟綜合利用中的研究進(jìn)展與前景[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2002,28(1):72-73

[5]肖連冬,李慧星,臧晉,等.酶水解麥糟蛋白制備可溶性肽工藝研究[J].南陽(yáng)理工學(xué)院學(xué)報(bào),2009,6(1):56-59

[6]王金華,張聲華.啤酒糟中可溶性膳食纖維的提取及化學(xué)組成[J].食品科學(xué),2002,23(12):64-67

[7]馮翠萍,龐侯英,常明昌,等.酶法提取蘆筍中高活性膳食纖維的研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2004,20(3):188-191

[8]肖連冬,李慧星,臧晉,等. RSM法研究麥糟不溶性膳食纖維的淀粉酶水解工藝[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2010, 25(11):98-101

[9]李慧星,肖連冬,臧晉,等.麥糟不溶性膳食纖維的蛋白質(zhì)降解工藝研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào),2010, 25(10):108-111

[10]肖連冬,許彬,臧晉,等.基于BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和遺傳算法研究啤酒糟不溶性膳食纖維的酶法脫脂工藝[J].食品科學(xué),2010, 31(14):18-21

[11]戚以政,汪叔雄.生物反應(yīng)動(dòng)力學(xué)與反應(yīng)器[M].3版.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2007: 1-37

[12]肖連冬,張彩瑩,李慧星,等.酶工程[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2008: 9-27

[13]蘇榮欣,齊崴,何志敏,等.水溶性多糖酶解過(guò)程分子量變化與動(dòng)力學(xué)建模[J].高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào),2006,20(4):565-570

[14]張國(guó)權(quán),史一一,魏益民,等.蕎麥淀粉的真菌淀粉酶酶解動(dòng)力學(xué)研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2007,23(5):42-46

[15]李慧星,許彬,肖連冬,等.響應(yīng)曲面法優(yōu)化兒茶素的浸提條件[J].食品工業(yè)科技,2008,29(7):186-187,191

[16] G Wang, W M Post, M A Mayes, et al. Parameter estimation for models of ligninolytic and cellulolytic enzyme kinetics[J]. Soil Biology & Biochemistry, 2012, 48: 28-38

Reaction Dynamics of Liqid Hydrolysis from Brewer's Spent Grains with Lipase

XU Bin，LI Hui-xing，XIAO Lian-dong，HAO Tong-fei
（College of Biology and Chemical Engineering，Nanyang Institute of Technology，Nanyang 473004，Henan，China）

Abstract：Degrease is an important process in dietary fiber preparation from brewer's grain. Dynamics of lipid hydrolysis from brewer's grains with lipase was studied. The effects of pH，temperature，time and additional amount of enzyme were investigated by single-factor experiments and response surface methodology with Box-Behnken design. A model of lipid hydrolysis dynamics was built with Michaelis-Menten equation. The optimized conditions were pH 7.0，temperature 40℃，additional amount of enzyme 0.32 g and concentration of magnesium 0.108 mol/L. Under these conditions，maximum reaction velocity achieved 0.67 mg/mL·h. The model of lipid hydrolysis dynamics was. The results would provide references for preparation of brewer's grain dietary fiber.

Key words：brewer's grain；lipase；dynamics；dietary fiber

收稿日期：2014-06-15

作者簡(jiǎn)介：許彬（1980—），女（漢），講師，碩士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工貯藏。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.048