龍眼殼粗黃酮提取物體內(nèi)外抗腫瘤研究

宋佳玉，張清偉，劉金寶，郭秋蘭（河南漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南漯河462002）

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龍眼殼粗黃酮提取物體內(nèi)外抗腫瘤研究

宋佳玉，張清偉，劉金寶，郭秋蘭
（河南漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南漯河462002）

摘要：研究龍眼殼粗黃酮提取物體內(nèi)外抗腫瘤作用。體外試驗(yàn)以MTT法檢測(cè)龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)食管癌細(xì)胞EC109、肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用。體內(nèi)試驗(yàn)建立S180荷瘤小鼠模型，觀察龍眼殼粗黃酮提取物（100、200、300 mg/kg）組和龍眼殼粗黃酮提取物+CTX（20mg/kg）組的抑瘤率，計(jì)算提取物+CTX組小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)、吞噬率，并采用ELISA法檢測(cè)提取物組小鼠血清TNF-α的水平。體外試驗(yàn)顯示龍眼殼粗黃酮提取物可顯著抑制EC109、HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。體內(nèi)試驗(yàn)顯示龍眼殼粗黃酮提取物（低）、（中）、（高）組均可抑制S180肉瘤生長(zhǎng)，抑瘤率分別為28.24 %、44.91 %、60.65 %；提取物（低）+CTX組、提取物（中）+CTX組、提取物（高）+CTX組抑瘤率分別為53.7 %、65.74 %、70.37 %，均高于CTX組47.69 %，且與CTX組比較，提取物+CTX組可不同程度地升高荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、巨噬細(xì)胞的吞噬率、吞噬指數(shù)；和模型組比較，提取物（低）、（中）、（高）組不增加小鼠血清TNF-α水平。龍眼殼粗黃酮提取物可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，具有抗腫瘤作用，且對(duì)CTX化療藥物具有增效減毒作用。

關(guān)鍵詞：龍眼殼粗黃酮提取物；食管癌細(xì)胞EC109；肝癌細(xì)胞HepG2；S180荷瘤小鼠；增效減毒

龍眼為無(wú)患子科龍眼屬常綠果樹(shù)，喬木。龍眼的果實(shí)俗名桂圓，又名木彈、驪珠、益智、亞荔枝、秀木團(tuán)、龍目、蜜脾、比目、圓眼、川彈子、荔枝奴、燕卵、鮫淚等，為我國(guó)著名的亞熱帶水果。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，龍眼肉能安神、補(bǔ)氣血、益心脾，可用于治療失眠、健忘、驚悸、怔忡、虛勞羸弱[1-2]，龍眼殼無(wú)毒、味甘、性溫，其散邪祛風(fēng)、聰耳明目，可治心虛頭暈，研細(xì)治湯火傷亦佳，已確定龍眼殼中含有核苷類、香豆素、多酚、萜類、糖類等[3-5]，而目前對(duì)龍眼殼中黃酮的提取研究報(bào)道較少。本研究從龍眼殼中提取了粗黃酮，并對(duì)其抗腫瘤作用進(jìn)行了初步研究。

1　材料與方法

1.1藥品與試劑

龍眼：采自福建泉州，取其殼洗凈、烘干、粉碎；亞硝酸鈉、氫氧化鈉、乙醇、硝酸鋁：均為分析純；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國(guó)藥品生物制品檢定所；環(huán)磷酰胺注射液：江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司。

1.2儀器

ALPHA1-2LD plus冷凍干燥儀：德國(guó)MARTIN CHRIST公司；RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器公司；AL104電子天平：上海速展機(jī)電有限公司；101C-2B電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海市實(shí)驗(yàn)儀器總廠；WFJ-中草藥粉碎機(jī)：江陰市輝煌機(jī)械制造有限公司；HH-1恒溫水浴鍋：陜西太康生物科技有限公司。

1.3瘤株及動(dòng)物

食管癌細(xì)胞EC109、肝癌細(xì)胞HepG2、S180肉瘤瘤株：均購(gòu)于河南省醫(yī)科所；昆明小鼠（雄鼠），體重（26±3）g：購(gòu)于河南省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.4龍眼殼粗黃酮提取物的制備

將龍眼殼洗凈、烘干、粉碎，過(guò)60目篩，稱取約100 g，加8倍量95 %乙醇，浸泡過(guò)夜，60℃加熱回流提取，每次4 h，重復(fù)提取3次，合并3次提取液抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥，即得龍眼殼粗黃酮提取物。1.5龍眼殼粗黃酮提取物定性鑒別

1）鹽酸-鎂粉反應(yīng)：在試管中加入1 mL提取物的乙醇溶液，再加鎂粉，再加濃鹽酸2滴，進(jìn)行黃酮類化合物的顯色反應(yīng)；2）濃氨水反應(yīng)：滴1滴提取物的乙醇溶液于濾紙上，之后將其用氨水熏30 s，在紫外燈下立即觀察；3）三氯化鋁反應(yīng)：取1滴提取物的乙醇溶液，點(diǎn)在濾紙上，然后再滴加1滴1 %的三氯化鋁乙醇溶液，分別在可見(jiàn)光及紫外光下觀察顏色變化。

1.6龍眼殼提取物粗黃酮含量的測(cè)定

采用聚酰胺吸附-硝酸鋁顯色法，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程A=1.842 9 C-0.000 4，A為510 nm處吸光度值，C為質(zhì)量濃度（mg/mL），線性范圍為0～0.5 mg，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 9。

1.7 MTT測(cè)定龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)食管癌細(xì)胞EC109、肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用

調(diào)整EC109、HepG2細(xì)胞濃度為2×103個(gè)/mL分別接種于96孔板中，每孔100 μL。試驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、提取物組、5-Fu組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔并設(shè)空白調(diào)零孔。24 h后，陰性對(duì)照組加200 μL培養(yǎng)液，提取物組分別加入200 μL終濃度為0.1、0.3、0.6、0.9、1.2 mg/mL粗黃酮提取物，5-Fu組加200 μL終濃度為0.38 mg/mL 5-Fu，分別培養(yǎng)48 h后，加入MTT溶液20 μL，培養(yǎng)4 h后加入150 μL二甲基亞砜，用酶聯(lián)檢測(cè)儀測(cè)定各孔的光密度值（OD）。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率（IR）。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)S180肉瘤抑制作用

建立實(shí)體瘤模型，將80只昆明小鼠右腋部皮下接種濃度為1×107個(gè)/mL的S180細(xì)胞懸液，0.2 mL/只。接種后隨機(jī)分為8組，每組10只。模型組給生理鹽水；CTX組僅第1天腹腔注射CTX 20 mg/kg；提取物低、中、高劑量組分別給提取物100、200、300 mg/kg，灌胃，1 d，連續(xù)14 d；CTX+提取物低、中、高劑量組第1天腹腔注射CTX 20 mg/kg，然后分別給提取物100、200、300 mg/kg，灌胃，1 d，連續(xù)14 d。14天后將小鼠處死，稱重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率/%＝（模型組瘤重-給藥組瘤重）/模型組瘤重×100。

1.9龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)S180荷瘤小鼠免疫功能的影響

觀察巨噬細(xì)胞吞噬功能，按1.8方法觀察14天后，將CTX+龍眼殼粗黃酮提取物組、CTX組、模型組小鼠腹腔注射1 mL體積分?jǐn)?shù)為20 %的新鮮雞紅細(xì)胞，30 min后將小鼠脫臼處死，將2 mL生理鹽水注入其腹腔，并擠壓腹部?jī)蓚?cè)，使腹腔液與生理鹽水混合均勻。將1 mL腹腔洗液滴于載玻片上，37℃孵育30 min，然后漂洗、晾干、固定、染色，再漂洗晾干。油鏡下數(shù)200個(gè)巨噬細(xì)胞，計(jì)算吞噬指數(shù)和吞噬率。吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞數(shù)（200個(gè)），吞噬百分率=吞噬雞紅細(xì)胞的巨噬細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)的巨噬細(xì)胞（200個(gè)）。稱取脾臟、胸腺重量，按照下列公式分別計(jì)算脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)：脾臟指數(shù)=脾臟重/體重，胸腺指數(shù)=胸腺重/體重。

1.10 ELISA法檢測(cè)荷瘤鼠血清中TNF-α蛋白的表達(dá)

按1.8方法觀察14天后，眼眶采血，收集提取物組、CTX組、模型組小鼠血液0.5 mL～1.0 mL，3 000 r/min，4℃，離心10 min，然后取上清。按照小鼠TNF-αELISA試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，測(cè)定荷瘤鼠血清中TNF-α蛋白含量。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件分析，計(jì)量資料結(jié)果以x±s表示，行t檢驗(yàn)及方差分析，P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1龍眼殼粗黃酮提取物定性檢驗(yàn)結(jié)果

1）鹽酸-鎂粉反應(yīng)：在泡沫處呈紫紅色；2）濃氨水反應(yīng)：在紫外燈下觀察，濾紙上呈現(xiàn)出極明顯的灰褐色斑點(diǎn)；3）三氧化鋁反應(yīng)：在可見(jiàn)光下濾紙上呈現(xiàn)出灰黃色斑點(diǎn)，在紫外光下濾紙上呈現(xiàn)出黃褐色熒光斑點(diǎn)，以上3個(gè)檢驗(yàn)結(jié)果均表明提取物中含有黃酮類化合物。

2.2龍眼殼提取物中粗黃酮含量

經(jīng)聚酰胺吸附-硝酸鋁顯色法檢測(cè)龍眼殼提取物中粗黃酮含量約為61.98 %。

2.3龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)食管癌細(xì)胞EC109和肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用（48 h）

龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)食管癌細(xì)胞EC109和肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用（48 h），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)食管癌細(xì)胞EC109和肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用（±s，n=5）Table 1 Inhibitory effect of coarse flavones extract from longan shell on EC109 and HepG2（x±s，n=5）

表1龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)食管癌細(xì)胞EC109和肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制作用（±s，n=5）Table 1 Inhibitory effect of coarse flavones extract from longan shell on EC109 and HepG2（x±s，n=5）

注：*：與陰性對(duì)照組比較，P<0.05；-：不加任何藥物。

EC109　HepG2 OD　 IR/%　 OD　 IR/%陰性對(duì)照　-　 0.30±0.023　 -　0.30　-5-Fu　 0.38　 0.16±0.009*46.67　 0.14±0.014*53.33提取物　0.10　 0.25±0.017　 16.67　 0.26±0.021　 13.33 0.30　 0.18±0.021*　38.45　 0.20±0.032*　33.33 0.60　 0.16±0.015*40.00　 0.19±0.014*36.67 0.90　 0.14±0.025*　53.33　 0.15±0.017*　50.00 1.20　 0.12±0.030*　60.00　 0.14±0.026*　53.33分組　　濃度/ （mg/mL）

由表1可見(jiàn)，藥物作用48 h后，龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)食管癌細(xì)胞EC109和肝癌細(xì)胞HepG2有增殖抑制作用，且呈一定的濃度依賴性。

2.4龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)S180肉瘤的生長(zhǎng)抑制作用及對(duì)CTX的增效作用

眼殼粗黃酮提取物對(duì)S180肉瘤的生長(zhǎng)抑制作用及對(duì)CTX的增效作用見(jiàn)表2。

表2龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)S180肉瘤的抑制作用（x±s，n=10）Table 2 Inhibitory effect of coarse flavones extract from longan shell on S180 Sarcoma（±s，n=10）

表2龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)S180肉瘤的抑制作用（x±s，n=10）Table 2 Inhibitory effect of coarse flavones extract from longan shell on S180 Sarcoma（±s，n=10）

注：*：與模型組比較，P<0.05；#：與CTX組比較，P<0.05；-：用生理鹽水灌胃，不用藥物。

體重/g　　瘤重/g　抑瘤率/%模型組　-　 26.11±2.79 29.05±3.34　 2.16±0.90　 -CTX組　20　 26.74±2.43 27.84±2.98　 1.13±0.73　 47.69提取物（低）　100　 26.52±1.85 29.36±2.11　 1.55±0.86*　28.24提取物（中）　200　 27.01±2.44 29.76±1.94　 1.19±0.77*　44.91提取物（高）　300　 26.21±2.78 29.97±3.01　 0.85±0.45*　60.65提取物（低）+CTX 100+20　 27.48±2.59 29.17±2.35　 1.00±0.52　 53.70提取物（中）+CTX 200+20　 27.93±2.48 28.64±3.07 0.74±0.34#65.74提取物（高）+CTX 300+20　 28.58±2.69 28.94±2.87 0.64±0.36#70.37組別　　劑量/ （mg/kg）試驗(yàn)前體重/g試驗(yàn)后

由表2可見(jiàn)，提取物低、中、高劑量組抑瘤率分別為28.24 %、44.91 %、60.65 %，可見(jiàn)龍眼殼粗黃酮提取物可顯著抑制S180肉瘤生長(zhǎng)并呈現(xiàn)一定量效關(guān)系；提取物（低）+CTX組、提取物（中）+CTX組、提取物（高）+ CTX組抑瘤率分別為53.7 %、65.74 %、70.37 %，高于CTX組47.69 %，可見(jiàn)龍眼殼粗黃酮提取物能增強(qiáng)CTX作用效果。

2.5龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)S180荷瘤小鼠免疫功能的影響

龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)S180荷瘤小鼠免疫功能的影響見(jiàn)表3。

由表3可見(jiàn)，與模型組相比，CTX組脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)、吞噬率均降低；與CTX組相比，提取物+CTX組以上各指標(biāo)均增高，且差異顯著（P<0.05）。

表3龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of coarse flavones extract from longan shell on the immune function of tumor bearing mice（±s，n=10）

表3龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of coarse flavones extract from longan shell on the immune function of tumor bearing mice（±s，n=10）

注：#：與CTX組比較，P<0.05；-：用生理鹽水灌胃，不用藥物。

組別　　量/（g/kg）胸腺指數(shù)/ 10－3脾臟指數(shù)/ 10－3吞噬百分率　　吞噬指數(shù)模型組　-　 2.04±0.32 6.56±0.87 0.31±0.08 0.54±0.12 CTX組　20　 1.65±0.18 5.17±0.74 0.15±0.06 0.18±0.07提取物（低）+CTX　 100+20　 2.48±0.65#7.68±0.89#0.29±0.07 0.65±0.17#提取物（中）+CTX　 200+20　 2.39±0.52#7.98±1.46#0.38±0.05#0.70±0.15#提取物（高）+CTX　 300+20　 2.77±0.64#8.15±1.94#0.36±0.09#0.68±0.18#

2.6龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)S180荷瘤小鼠血清TNF-α含量的影響

龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)S180荷瘤小鼠血清TNF-α含量的影響見(jiàn)表4。

表4龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)S180荷瘤小鼠血清中TNF-α含量的影響（±s，n=10）Table 4 Effects of coarse flavones extract from longan shell on TNF in serum of tumor bearing mice（±s，n=10）

表4龍眼殼粗黃酮提取物對(duì)S180荷瘤小鼠血清中TNF-α含量的影響（±s，n=10）Table 4 Effects of coarse flavones extract from longan shell on TNF in serum of tumor bearing mice（±s，n=10）

注：-：用生理鹽水灌胃，不用藥物。

組別　　劑量/（g/kg）　TNF－α含量/（pg/mL）模型組　-　23.39±4.83 CTX組　20　22.87±3.22提取物（低）　100　24.34±3.98提取物（中）　200　23.67±4.45提取物（高）　300　25.11±4.89

由表4可見(jiàn)，提取物（低）組、提取物（中）組、提取物（高）組小鼠血清TNF-α水平和模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3　討論

黃酮類化合物是一類重要的天然有機(jī)化合物，是植物在長(zhǎng)期自然選擇過(guò)程中產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物。它廣泛存在于高等植物及羊齒植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等中，不僅數(shù)量種類繁多，而且結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜多樣。黃酮類化合物因其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)而對(duì)哺乳動(dòng)物和其它類型的細(xì)胞具有許多重要的生理、生化作用，如具有抗心腦血管疾病、抗輻射、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化、抗衰老、抑菌抗病毒、抗腫瘤、治療骨質(zhì)疏松等作用[6-10]。

龍眼，俗稱桂圓，為著名的水果和重要的藥材，劉煥云[11]等采用微波輔助提取法，從龍眼殼中提取了黃酮，并證明其在體外具有一定的抗氧化作用，周瓊花[12]等從龍眼葉中提取了黃酮，并證明了其在體外也具有一定的抗氧化作用，本試驗(yàn)從龍眼殼中提取了粗黃酮，并初步研究了其體內(nèi)外抗腫瘤作用，體外研究結(jié)果顯示，龍眼殼粗黃酮提取物可顯著抑制食管癌細(xì)胞EC109和肝癌細(xì)胞HepG2的生長(zhǎng)，且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性；體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果顯示龍眼殼粗黃酮提取物低、中、高劑量組可明顯抑制S180腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，抑瘤率分別為28.24 %、44.91 %、60.65 %，提取物（低）+ CTX組、提取物（中）+CTX組、提取物（高）+CTX組抑瘤率均高于CTX組（47.69 %），其中提取物高劑量+ CTX組比CTX組的抑瘤率提高了22.68個(gè)百分點(diǎn)，且與CTX組比較，提取物+CTX組可不同程度地升高荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、巨噬細(xì)胞的吞噬指數(shù)、吞噬率，可見(jiàn)龍眼殼粗黃酮提取物可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增長(zhǎng)，提高化療藥物CTX療效，并且能增強(qiáng)小鼠機(jī)體免疫力，能夠?qū)够熕幬顲TX所致的免疫器官萎縮，免疫力的下降等不良反應(yīng)即降低CTX毒性。為了進(jìn)一步的了解龍眼殼粗黃酮提取物的抗腫瘤作用機(jī)制，本試驗(yàn)采用ELISA法檢測(cè)提取物組小鼠血清TNF-α的水平，試驗(yàn)結(jié)果顯示模型組和提取物組TNF-α的水平差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明龍眼殼粗黃酮提取物是通過(guò)其他機(jī)制來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用的，其具體抗腫瘤機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

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The Antitumor Effects of Coarse Flavones Extract from Longan Shell in Vitro and Vivo

SONG Jia-yu，ZHANG Qing-wei，LIU Jin-bao，GUO Qiu-lan
（Luohe Medical College，Luohe 462002，Henan，China）

Abstract：To investigate the antitumor effects of coarse flavones extract from longan shell in vitro and vivo. In vitro，MTT method was used to detect the inhibitory effect of coarse flavones extract from longan shell on EC109 and HepG2. In vivo，S180-bearing mice were given coarse flavones extract from longan shell and the tumor inhibitory rates of mice were detected in coarse flavones extract（100，200，300 mg/kg）groups and coarse flavones extract combined with CTX（20 mg/kg）groups. The thymus index，spleen index，macrophage phagocytic rate and phagocytic index were calculated in coarse flavones extract combined with CTX proups. ELISA method was used to detect the the levels of serum TNF-α in coarse flavones extract groups. In vitro，the results showed that the coarse flavones extract of longan shell significantly inhibited the growth of EC109 andbook=41,ebook=48HepG2 cells，and showed a certain concentration dependence.In vivo，the results showed that the coarse flavones extract of longan shell（low），（middle）and（high）group could inhibit the growth of S180 sarcoma，and the inhibition rate was 28.24 %，44.91 % and 60.65 % respectively. The tumor inhibitory rates of coarse flavones extract combined with CTX were 53.7 %，65.74 %，70.37 %，which were higher than that of CTX administration alone（47.69 %）. Compared with those in CTX group，the thymus index，spleen index，macrophage phagocytic rate and phagocytic index were significantly elevated in all coarse flavones extract combined with CTX groups. Compared with the model group，the extract（low），（middle）and（high）groups did not increase the level of serum TNF-αin mice. The coarse flavones extract from exocarp of longan had antitumor effect and could inhibit the growth of S180 tumor and and had synergistic attenuation effect of CTX.

Key words：coarse flavones extract from exocarp of longan；EC109；HepG2；S180-bearing mice；synergistic attenuation effect

收稿日期：2015-05-21

作者簡(jiǎn)介：宋佳玉（1981—），女（漢），講師，碩士，研究方向：腫瘤藥理。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.010