溶菌酶分子印跡材料的制備及吸附性能研究

李培緒（濰坊科技學院綜合教育學院，山東壽光262700）

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溶菌酶分子印跡材料的制備及吸附性能研究

李培緒
（濰坊科技學院綜合教育學院，山東壽光262700）

摘要：采用γ-氨丙基三甲氧基硅烷（AMPS）對硅膠進行改性，然后將聚甲基丙烯酸聚合接枝到AMPS-SiO2表面上，再以乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑進行交聯(lián)聚合，溶菌酶（LYZ）為模板分子，得到表面具有溶菌酶分子印跡聚合物的硅膠材料（LYZ-MIP-PMAA/SiO2）。采用紅外、掃描電鏡和粒徑測定等方法對LYZ-MIP-PMAA/SiO2進行了表征。通過靜態(tài)和動態(tài)吸附試驗研究LYZ-MIP-PMAA/SiO2對溶菌酶的吸附性能，并以牛血清蛋白等為競爭底物，研究其選擇吸附性能。結(jié)果顯示，LYZ-MIP-PMAA/SiO2對溶菌酶的吸附能力明顯大于空白分子印跡硅膠（NIP-PMAA/SiO2），其對溶菌酶和牛血清蛋白的分離因子為1.20，說明其對溶菌酶具有較好的選擇吸附性能。

關鍵詞：硅膠；溶菌酶；表面分子印跡；吸附性能

溶菌酶（Lysozyme），化學名稱為N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶，是一種堿性酶，廣泛存在于哺乳動物的體液、禽類的蛋白以及某些植物中。溶菌酶能夠使很多細菌的細胞膜中糖蛋白類多糖發(fā)生水解，從而使細胞膜溶解而溶解細菌，起到殺死細菌的作用，因此溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。由于溶菌酶具有較好的抑菌作用，且無毒、安全，因此在食品行業(yè)受到重視，例如可用于食品的儲存[1-2]。溶菌酶在實際樣品中的含量很低，直接分析測量比較困難，一般都需要對樣品進行預處理，而傳統(tǒng)的分離富集方法沒有特異選擇性，富集倍數(shù)不高[3-5]。

分子印跡聚合物（MIP）是一種對模板分子具有特異識別選擇性的高分子材料，已經(jīng)在色譜分離、固相萃取、手性分離、傳感器以及膜分離等領域得到應用[6-9]。將MIP應用于溶菌酶的分離富集，有助于克服目前傳統(tǒng)材料對LYZ沒有選擇性、富集倍數(shù)不高的缺陷。

2000年以來有關LYZ-MIP的研究報道不多[10-12]。本文以硅膠為載體，溶菌酶作為分子模板，甲基丙烯酸（MAA）作為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）作為交聯(lián)劑，通過接枝聚合，制備了硅膠表面分子印跡聚合物，考察了其對溶菌酶的選擇性吸附性能，為其作為分離富集材料應用于溶菌酶的檢測提供試驗參考。

1　材料與方法

1.1材料

溶菌酶（≥95 %，≥20 kU/mg）：上海伊卡生物技術有限公司；牛血清白蛋白（≥98 %）：北京博爾西科技有限公司；硅膠（200目～300目）：青島世紀海洋干燥劑有限公司；γ-氨丙基三甲氧基硅烷（AMPS）：南京創(chuàng)世化工助劑有限公司；甲基丙烯酸（MAA）：上海和發(fā)實業(yè)有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）：天津科密歐化學試劑開發(fā)中心；過硫酸銨、醋酸、甲醇等均為分析純試劑。

1.2儀器

IR Prestige-21傅里葉紅外光譜儀：日本島津公司；Mastersizer2000激光粒度分析儀：英國馬爾文公司；Quanta200E環(huán)境掃描電子顯微鏡：荷蘭FEI公司；T6-1650E紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3方法

1.3.1硅膠的活化

將硅膠加入體積分數(shù)為50 %的硝酸溶液中，室溫下充分攪拌后靜置24 h，過濾，用蒸餾水洗滌至中性，真空干燥得活化硅膠SiO2。

1.3.2硅膠的表面改性

將0.3 g SiO2-NPs和5 mL γ-氨丙基三甲氧基硅烷（APTES）加入50 mL無水甲苯中，在氮氣保護下加熱回流反應24 h，無水甲苯洗滌，真空干燥得氨基修飾的SiO2。

1.3.3甲基丙烯酸在硅膠表面的接枝聚合

將1.5 g AMPS-SiO2和5 mL單體甲基丙烯酸（MAA）加入100 mL水中，通氮氣30 min。然后加入0.055 g過硫酸銨，在40℃、N2保護下反應10 h。聚合結(jié)束后，抽濾，用索式提取器以乙醇抽提得到的聚甲基丙烯酸（PMAA）接枝硅膠（PMAA/SiO2）24 h，真空干燥。

1.3.4溶菌酶表面分子印跡硅膠材料（LYZ-MIPPMAA/SiO2）的制備

稱取1.0 g PMAA/SiO2加入100 mL、1.0 g/L的LYZ-甲醇溶液中，常溫震蕩4 h，然后過濾，真空干燥。將1.0 g飽和吸附溶菌酶的接枝硅膠，加入50 mL LYZ-乙醇/水混合溶液（1∶1，體積比ROX濃度為1.0 g/L）中，將pH調(diào)節(jié)為9，然后于45℃下加入0.2 mL EDMA攪拌反應8 h。抽濾，用甲醇/冰醋酸溶液（9∶1，體積比）、蒸餾水反復洗滌固體微粒，直至中性為止，以除去溶菌酶，真空干燥。

在不加模板分子的情況下，采用與LYZ-MIPPMAA/SiO2相同的步驟制備空白表面分子印跡（NIP）硅膠（NIP-PMAA/SiO2）。

1.3.5表征

采用溴化鉀壓片法，用日本島津公司的IR Prestige-21傅里葉紅外光譜儀對AMPS-SiO2和PMAA/ SiO2進行紅外色譜分析。將硅膠、AMPS-SiO2和LYZ -MIP-PMAA/SiO2進行表面噴金后，用荷蘭FEI公司的Quanta200E環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察形貌。用英國馬爾文公司的Mastersizer2000激光粒度分析儀進行粒徑和分布測定。

1.3.6建立標準曲線

溶菌酶在290 nm波長處有最大紫外吸收，利用這一特性可以使用紫外分光光度法對溶菌酶進行測定。準確稱取125 mg溶菌酶，然后溶解于濃度為0.85 %的氯化鈉溶液中，配制為500 μg/mL的溶菌酶標準溶液。準確量取溶菌酶標準溶液1、2、3、4、5 mL，分別加入10 mL容量瓶中，然后用濃度為0.85 %的氯化鈉溶液稀釋至刻度。在290 nm波長下，分別測定上述溶液的紫外吸光度，以濃度對吸光度制作標準曲線并進行線性回歸。

1.3.7 LYZ-MIP-PMAA/SiO2的靜態(tài)吸附性能研究

準確量取LYZ-MIP-PMAA/SiO2各16份，分別放置在5 mL的離心管中，編號1號～16號，在1號中加入3mL甲醇作為對照組，另外2號～16號，分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、6.0、8.0 g/L的溶菌酶溶液各3 mL。將1號～16號樣品放入振蕩器中震蕩24 h，離心后取上清液測定溶菌酶的濃度。

1.3.8 LYZ-MIP-PMAA/SiO2的動態(tài)吸附性能研究

準確稱取10 mg LYZ-MIP-PMAA/SiO2各9份，分別加入5 mL小試管中，然后在每一個小試管內(nèi)加入相同濃度的溶菌酶溶液3 mL，在振蕩器中充分混合均勻。分別于10、30、60、90、120、150、180、240、300 min收取上清液，測定溶菌酶的濃度。

1.3.9選擇性吸附試驗

為了表征LYZ-MIP-PMAA/SiO2的選擇吸附性能，選擇與溶菌酶結(jié)構類似的牛血清白蛋白作為競爭底物進行選擇性吸附試驗。分別量取1 mmol/L的溶菌酶和牛血清白蛋白各3 mL，分別加入10 mg LYZMIP-PMAA/SiO2和NIP-PMAA/SiO2，振蕩器震蕩24 h，收取上清液，測定溶菌酶和牛血清白蛋白的濃度。通過靜態(tài)分配系數(shù)KD以及分離因子α來表示其選擇性吸附性能。靜態(tài)分配系數(shù)KD和分離因子α的表示式分別為：

式中：CP是溶質(zhì)被吸附的濃度，μmol/g；CS是溶質(zhì)在溶液中的濃度，μmol/mL；KD′是模板分子的靜態(tài)分配系數(shù)；KD″是競爭底物的靜態(tài)分配系數(shù)。一般情況下，分離因子α越大，表示對模板分子的選擇性越高。

2　結(jié)果與分析

2.1紅外光譜分析

SiO2、AMPS-SiO2和PMAA/SiO2的紅外光譜圖見圖1。

圖1 SiO2（A）、AMPS-SiO2（B）和PMAA/SiO2（C）的紅外光譜圖Fig.1 FTIR spectra of SiO2（A），AMPS-SiO2（B）and PMAA/SiO2（C）

在圖1的SiO2紅外光譜圖中，1 100 cm-1是Si-OSi和Si-O-H的伸縮振動峰，966 cm-1和803 cm-1是Si-O-H的伸縮振動峰，3 445 cm-1和1 637cm-1是-OH的伸縮振動峰。在AMPS-SiO2的紅外光譜圖中，3445cm-1的-OH伸縮振動峰明顯變小，966 cm-1的Si-O-H的伸縮振動峰基本消失，新出現(xiàn)了3 750 cm-1、1 583 cm-1和1 482 cm-1的-NH伸縮振動峰，以及2 940 cm-1的-CH伸縮振動峰，說明硅膠表面大部分羥基已經(jīng)反應，AMPS已經(jīng)接枝到SiO2表面。在PMAA/SiO2的紅外光譜圖中，新出現(xiàn)了700 cm-1的游離-COOH的特征吸收峰，且3 445 cm-1的-OH特征峰明顯增強，說明MAA已成功接枝到改性SiO2上。

2.2掃描電鏡和粒徑分析

硅膠、AMPS-SiO2和LYZ-MIP-PMAA/SiO2的掃描電鏡照片見圖2。

圖2硅膠（A）、AMPS-SiO2（B）和LYZ-MIP-PMAA/SiO2（C）的SEM照片F(xiàn)ig.2 SEM images of SiO2（A），AMPS-SiO2（B）and LYZ-MIPPMAA/SiO2（C）

由圖2可知，活化硅膠顆粒表面比較光滑、干凈，而接枝AMPS和MIP后，硅膠表面明顯有附作物，表面變得粗糙，這是因為AMPS和MIP聚合物接枝在硅膠表面造成的。經(jīng)用粒度測定儀測定，未經(jīng)修飾的硅膠顆粒平均粒徑（d50）為56.4 μm，ROX-MIP-PMAA/ SiO2的平均粒徑（d50）為62.8 μm。在表面接枝和聚合之后，硅膠顆粒表面形成了聚合物的薄膜層，而且表面聚合物層也會造成顆粒黏連，從而使得粒徑增大。2.3標準曲線

溶菌酶標準曲線見圖3。

圖3溶菌酶標準曲線Fig.3 The standard curve of lysozyme

按照1.2.6的方法，以吸光度（A）對濃度（C）進行線性回歸，得回歸方程為y = 0.021 0 x - 0.035 98（y= A，x =C），R2= 0.999 6（n=5）。

2.4 LYZ-MIP-PMAA/SiO2的靜態(tài)吸附性能

LYZ-MIP-PMAA/SiO2和NIP-PMAA/SiO2的吸附等溫線見圖4。

圖4 LYZ-MIP-PMAA/SiO2（A）和NIP-PMAA/SiO2（B）的吸附等溫線Fig.4 The adsorption isotherm curve of LYZ-MIP-PMAA/SiO2（A）andNIP-PMAA/SiO2（B）

從圖4中的吸附等溫曲線可以看出，隨著溶菌酶溶液濃度的增加，LYZ -MIP -PMAA/SiO2和NIP -PMAA/SiO2對溶菌酶的吸附量呈現(xiàn)快速增大趨勢，隨后逐漸達到平衡。由圖4可知，LYZ-MIP-PMAA/SiO2和NIP-PMAA/SiO2對溶菌酶的吸附平衡濃度分別為2.6g/L和2.0g/L，飽和吸附量分別為93 mg/g和61 mg/g，LYZ-MIP-PMAA/SiO2的飽和吸附量明顯大于NIPPMAA/SiO2。在LYZ-MIPPMAA/SiO2和NIP-PMAA/ SiO2的制備中都加入功能單體甲基丙烯酸以及交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯等物質(zhì)，均含有羥基、羧基等功能基團，對模板分子具有一定的物理作用，可形成非印跡的結(jié)合作用位點，因此NIP-PMAA/SiO2對溶菌酶也具有一定的非印跡物理吸附作用，但是這種吸附作用是非特異性的。對于LYZ-MIPPMAA/SiO2，除了存在非特異性的物理吸附，還存在因模板分子洗脫后留下的印跡空穴產(chǎn)生的特異性吸附，因此其對溶菌酶的吸附量明顯增大，明顯大于NIP-PMAA/SiO2。

2.5 LYZ-MIP-PMAA/SiO2的動態(tài)吸附性能

LYZ-MIP-PMAA/SiO2的動態(tài)吸附曲線見圖5。

圖5 LYZ-MIP-PMAA/SiO2的動態(tài)吸附曲線Fig.5 The absorption kinetic curve of LYZ-MIP-PMAA/SiO2

從圖5知，在前60 min，LYZ-MIP-PMAA/SiO2的吸附量增加較快，60 min后吸附量增加速度減緩，直至達到吸附平衡。一般認為，在印跡聚合物對模板分子的吸附過程中，存在非特異性物理吸附和特異性吸附。在吸附初期，印跡聚合物對模板分子的吸附以非特異性物理吸附為主，吸附速度較快。當非特異性吸附部位逐漸被占據(jù)后，則以特異性吸附為主，此時溶菌酶分子需要克服一定的空間位阻效應向深孔的特異性吸附部位擴散傳質(zhì)，所以傳質(zhì)速度較慢，吸附速度較小，因此吸附量增加減慢，最后緩慢平衡。LYZMIP-PMAA/SiO2對溶菌酶分子的吸附在180 min左右達到飽和。

2.6選擇性吸附性能

MIP和NIP對溶菌酶和牛血清白蛋白的選擇性吸附數(shù)據(jù)見表1。

表1 MIP和NIP對溶菌酶和牛血清白蛋白的選擇吸附性能Tabel 1 The selective adsorption properties of MIP and NIP on roxithromycin and erythromycin

由表1可知，ROX-MIP-PMAA/SiO2對溶菌酶的分配系數(shù)明顯大于牛血清白蛋白素，其分離因子為1.20，這說明其對溶菌酶具有較好的選擇吸附性能。ROX-MIP-PMAA/SiO2對競爭底物的分配系數(shù)也大于NIP-PMAA/SiO2。而NIP-PMAA/SiO2對溶菌酶和牛血清白蛋白的分配系數(shù)基本相同，分離因子僅為1.01，基本沒有選擇吸附性能。ROX-MIPPMAA/SiO2對模板分子不僅存在非特異性物理吸附，還存在印跡空穴產(chǎn)生的特異性吸附，因此其對模板分子具有選擇性，具有一定的分子識別性能。而NIP-PMAA/SiO2對兩種底物僅具有物理吸附作用，沒有選擇性。

3　結(jié)論

1）采用γ-氨丙基三甲氧基硅烷（AMPS）對硅膠進行改性，然后將甲基丙烯酸接枝到AMPS-SiO2表面上，得到聚甲基丙烯酸接枝硅膠（PMAA/SiO2），再以乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）為交聯(lián)劑，在模板分子溶菌酶存在下在PMAA/SiO2表面進行交聯(lián)聚合，得到溶菌酶表面分子印跡硅膠材料（ROX-MIP-PMAA/ SiO2）。采用紅外、電鏡掃描和粒徑測定等方法初步表征了ROX-MIP-PMAA/SiO2的結(jié)構。

2）靜態(tài)和動態(tài)吸附試驗研究表明，LYZ-MIP-PMAA/ SiO2對溶菌酶的吸附性能明顯大于NIP-PMAA/SiO2。

3）選擇性吸附試驗結(jié)果表明，LYZ-MIP-PMAA/SiO2對溶菌酶和牛血清白蛋白的分離因子為1.20，說明其對溶菌酶具有較好的選擇吸附性能，而NIP-PMAA/ SiO2對溶菌酶和牛血清白蛋白基本沒有選擇性。

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Study on Preparation of Lysozyme Molecularly Imprinted Materials and Its Adsorption Properties

LI Pei-xu
（School of Comprehensive Education，Weifang University of Science and Technology，Shouguang 262700，Shandong，China）

Abstract：Silica was modified with AMPS，and then polymethacrylic acid was grafted onto AMPS -SiO2surface，forming polymethacrylic acid grafted silica gel（PMAA/SiO2）. With lysozyme as template molecule and ethylene glycol dimethacrylate as crosslinker，LYZ-imprinted polymeric layer was prepared and silica surface was coated with it（LYZ-MIP-PMAA/SiO2）. The material was characterized by scanning electron microscope （SEM）and particle size analysis. Infrared spectroscopy，scanning electron microscopy and particle size determination were used to characterize LYZ-MIP-PMAA/SiO2. The adsorption properties of LYZ-MIP-PMAA/ SiO2on lysozyme were studied by static binding test and dynamic binding test，and its selective adsorption properties was investigated by selective binding test with bovine serum albumin as competing substrate. Results showed that the adsorption capacity of LYZ-MIP-PMAA/SiO2on lysozyme was better than that of NIP-PMAA/ SiO2. The separation factor of LYZ-MIP-PMAA/SiO2on lysozyme and bovine serum albumin was 1.20，showing that LYZ-MIP-PMAA/SiO2displayed high recognition ability to the template molecule-LIN.

Key words：silicone；lysozyme；surface imprinted；adsorption property

收稿日期：2015-08-25

作者簡介：李培緒（1976—），男（漢），講師，碩士研究生，從事功能高分子材料研究。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.009