蒼耳葉提取物對獼猴桃潰瘍菌的抑制作用研究

崔國庭，王緞，2，郭金英，徐寶成，向進樂（.河南科技大學(xué)，河南洛陽47023；2.永成職業(yè)學(xué)院，河南永城476600）

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蒼耳葉提取物對獼猴桃潰瘍菌的抑制作用研究

崔國庭1，王緞1，2，郭金英1，徐寶成1，向進樂1
（1.河南科技大學(xué)，河南洛陽471023；2.永成職業(yè)學(xué)院，河南永城476600）

摘要：以獼猴桃潰瘍菌為研究對象，考察了蒼耳葉提取物對該菌的抑制作用及抑菌機理。試驗結(jié)果表明，蒼耳葉的乙醇提取物對獼猴桃潰瘍菌的抑菌活性最強，其最低抑菌濃度（MIC）為50 μg/mL；濃度高于100 μg/mL時，對潰瘍菌細胞壁的完整性造成破壞，引起獼猴桃潰瘍菌菌內(nèi)分子如糖、蛋白質(zhì)、核酸外泄，從而達到抑菌、殺菌的作用。

關(guān)鍵詞：蒼耳；獼猴桃潰瘍菌；抑制作用

獼猴桃潰菌（Pseudomonas syringae pv·Actinidiae），是引起獼猴桃潰瘍病的主要病原菌。獼猴桃潰瘍病（Kiwifruit bacterial canker）是獼猴桃栽培過程中最具毀滅性的病害之一。該病于1980年在日本首次報道，隨后在美國、韓國[1]、新西蘭、法國[2]、西班牙[3]、意大利[4]、伊朗[5]等地陸續(xù)有該病的相關(guān)報道。獼猴桃潰瘍菌引發(fā)的潰瘍病成為獼猴桃的主要病害之一，病害發(fā)生時，獼猴桃樹整株枯死，造成果園毀滅，顆粒無收，產(chǎn)量與品質(zhì)嚴重受損[6-7]。含銅殺菌劑、鏈霉素等最初作為抑制獼猴桃潰瘍菌有效的藥物，隨著抗銅離子、抗鏈霉素菌株的出現(xiàn)，這些殺菌劑抗菌效果不斷的減弱[8]。尋找到新的有效抑制獼猴桃潰瘍菌的殺菌劑成為目前獼猴桃產(chǎn)業(yè)的迫切需求。

蒼耳（Xanthium sibiricum Patr ex Widder）屬菊科、蒼耳屬，亦稱呆耳、老場子、常思、卷耳、爵耳、豬耳、耳、地葵、羊負來、芨芨。分布全國各地，全草有毒，尤其以幼苗、嫩芽、種子的毒性最大，苷類、毒蛋白、氫醌為毒性主要成分，倍半萜內(nèi)酯和水溶性苷類是主要的兩類活性成分。蒼耳提取物具有殺蟲、抑菌、抑制植物生長的功能[9-10]，肖家軍研究發(fā)現(xiàn)蒼耳葉揮發(fā)油具有抑菌及抗氧化功能[11]。目前，有關(guān)蒼耳葉提取物對于獼猴潰瘍菌的抑制作用與機理的研究鮮見報道，本文就這方面的進行了初步的研究。

1.1材料與試劑

供試菌種為獼猴桃潰菌（Pseudomonas syringae pv·Actinidiae）：西北農(nóng)林科技大學(xué)理學(xué)院提供。

蒼耳葉：來自西北農(nóng)林科技大學(xué)。

無水乙醇、乙酸乙酯、石油醚：分析純，上海滬試實驗室器材股份有限公司。

1.2主要儀器

RE-3000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FD-1A冷凍干燥機：北京亞泰科隆實驗科技開發(fā)中心；DGX-9053B-1恒溫干燥箱、DPX-9052B-2恒溫培養(yǎng)箱：上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；YQ-020A超聲波清洗器：上海易凈超聲波儀器有限公司；TQZ-312恒溫搖床：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺：上海尚道儀器制造有限公司；BCD-216SDN海爾冰箱：青島海爾股份有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1蒼耳葉提取物的制備

蒼耳葉經(jīng)50℃干燥后粉碎，過60目篩，取蒼耳葉粉100 g，用70 %乙醇以料液比為1∶10（g/mL）在50℃條件下水浴浸提8 h，浸提2次，合并提取液、用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮至膏狀、真空凍干機中干燥、粉碎即得蒼耳葉乙醇粗提取物，取4mg溶于1mL70%乙醇中，4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2培養(yǎng)基及獼猴桃潰瘍菌懸液的制備

培養(yǎng)基的制備：KB培養(yǎng)基。1 L水中加入20 g蛋白胨、1.5 g硫酸鎂、1.5 g磷酸氫二鉀、17 g瓊脂，加熱溶解，121℃高壓滅菌30 min，趁熱在超凈工作臺上倒入無菌平皿，備用。

菌懸液的制備：挑選長勢較好的獼猴桃潰瘍菌接入不含瓊脂的KB液體培養(yǎng)基中，恒溫搖床培養(yǎng)16 h～24 h，使菌活化繁殖，當菌液由透明變黃色混濁時停止培養(yǎng)，置冰箱中備用。

1.3.3蒼耳葉提取物中不同極性部分的抑菌活性

抑菌濾紙片的制備：將定量的普通濾紙用打孔器打成直徑為6 mm圓片，置于潔凈干燥試管內(nèi)120℃干熱滅菌2h后，分別浸于6種不同濃度的藥液中24h，晾干備用。

抑菌實驗（瓊脂平板擴散法）：取倒入培養(yǎng)基的平皿，均勻涂布一層稀釋的試驗菌，試驗菌用量以對照平皿表面菌生長能呈半密集菌落為定。將均勻涂菌后的瓊脂平板置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中5 min，使表面干燥，用無菌鑷子將抑菌濾紙片按標號依次均勻貼在培養(yǎng)基表面，輕壓紙片使接觸良好。30℃倒置培養(yǎng)12 h，取出平板，觀察抑菌圈大小并測定其直徑。

取一定量的蒼耳葉提取物，分別用石油醚、乙酸乙酯、無水乙醇、水配制成濃度為10 mg/mL的懸濁液，3 500 r/min離心15 min，取上清液測定抑菌活性，對比不同極性溶劑抑菌活性的大小。

1.3.4最低抑菌濃度（MIC）[12]

最低抑菌濃度是指在體外能夠抑制細菌生長的最低濃度。取一定量的蒼耳葉提取物，配制成濃度為（4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.1、0.05、0.025 mg/mL）的溶液。取10 μL不同濃度的樣液，點于無菌濾紙片上，待溶劑揮發(fā)干，將載有藥的濾紙片放入表面涂過菌液的培養(yǎng)基，壓緊。放入28℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，觀察不同濃度樣液的抑菌圈直徑大小，確定最低抑菌濃度，重復(fù)3次。

1.3.5蒼耳葉提取物對獼猴桃潰瘍菌致死曲線的測定[13-14]

活化獼猴桃潰瘍菌，將其接種于肉湯培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)12 h，加入蒼耳葉提取物28℃條件下，過一段時間取培養(yǎng)液進行平板活菌計數(shù)，與未加蒼耳葉提取物的菌液對比，觀察蒼耳葉提取物對獼猴桃潰瘍菌的致死曲線。

1.3.6蒼耳葉提取物的熱穩(wěn)定性[15]

蒼耳葉提取物置于不同加熱條件（50、60、70、80、90、100℃）下處理分別30、25、20、15、10、5 min，以各供試菌的2倍MIC的量，在滅菌培養(yǎng)基中加入蒼耳葉提取物，分別測定抑菌圈直徑，重復(fù)3次。

1.3.7獼猴桃潰瘍菌培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)濃度的測定[16-17]

活化獼猴桃潰瘍菌，28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)12h，加入蒼耳葉提取物，使其最終濃度達到150 μg/mL，分別于0、1、2、3、4、5、6 h采用Bradford法[18]測定菌液中蛋白質(zhì)含量，用蒸餾水代替蒼耳葉提取物作為對照組，試驗重復(fù)3次。

1.3.8獼猴桃潰瘍菌培養(yǎng)液中可溶性總糖的測定[19]

活化獼猴桃潰瘍菌，28℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，取適量菌液，加入蒼耳葉提取物，使其最終濃度達到100 μg/mL，分別于28℃、100 r/min培養(yǎng)0、1、2、4、6、8 h后取出，4 000 r/min離心20 min，取上清液200 μL，加水稀釋至1.0 mL，加入蒽酮試劑4.0 mL，冷卻5 min，沸水浴10 min，室溫冷卻10 min，在620 nm處測定吸光值，以葡萄糖標準溶液作標準曲線，以無菌水代替蒼耳葉提取物作為空白對照，試驗重復(fù)3次。1.3.9獼猴桃潰瘍菌培養(yǎng)液中核酸含量的測定[20]

取活化后的獼猴桃潰瘍菌轉(zhuǎn)接到金氏KB肉湯培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)12 h、離心（4 000 r/min，10 min），棄上清，用pH7.4磷酸緩沖液（0.1 mol/L）稀釋菌體，獲得大約106CFU/mL的菌液；加入蒼耳葉提取物，在260 nm測定吸光度，以pH7.4磷酸緩沖液調(diào)零，以pH7.4磷酸緩沖液替代蒼耳葉作為對照。試驗重復(fù)3次。

2　結(jié)果與分析

2.1不同萃取相提取物對獼猴桃潰瘍菌的抑制作用蒼耳葉物經(jīng)不同極性溶劑萃取后獲得相應(yīng)的萃

取相。在供試濃度為10 mg/mL時，不同萃取相對獼猴桃潰瘍菌的抑制效果見表1。

表1不同萃取相的抑菌圈直徑Table 1 Bacteriostatical diameter of different concentration extract phase extract to germ

由表1可看出，各萃取相對供試病原菌都具有抑制作用，其抑制作用由大到小依次為：乙醇相>乙酸乙酯相>石油醚相>水相。乙醇對細菌的抑制效果優(yōu)于其他萃取相，說明蒼耳葉中的抑菌物質(zhì)主要集中在高極性部位，對此部分提取物的進一步追蹤分離將有望發(fā)現(xiàn)具開發(fā)價值的抗菌活性物質(zhì)。

2.2最低抑菌濃度（MIC）

蒼耳葉乙醇提取物抑菌作用與濃度的關(guān)系，結(jié)果見表2。

表2最小抑菌濃度Table 2 The results of the lowest concentration of suppression medicaments

由表2可以看出，隨著提取物濃度的降低，抑菌效果隨之下降，當提取物濃度低于0.05 mg/mL時，抑菌圈直徑為0，該提取物的最低抑菌濃度為0.05 mg/mL。2.3獼猴桃潰瘍菌的死亡曲線

蒼耳葉提取物對獼猴桃潰瘍菌的致死作用見圖1。

圖1致死曲線Fig.1 The death curve of the bacteria

從圖1可以看出，蒼耳葉提取物對獼猴桃潰瘍菌的殺死作用與其濃度有關(guān)。當蒼耳葉提取物濃度高于100 μg/mL時，在4 h內(nèi)能夠殺死獼猴桃潰瘍菌；當加入的濃度為25 μg/mL時，雖然可以再一定時間內(nèi)抑制獼猴桃潰瘍菌的生長，但不能滅菌，而且隨著時間的延長，細菌呈上升趨勢。

2.4蒼耳葉提取物物熱穩(wěn)定性

蒼耳葉提取物熱穩(wěn)定性，見表3。

表3蒼耳葉提取物的熱穩(wěn)定性Table 3 The thermostability on extractive of Xanthium sibiricum Patr.leaf

由表3可以看到，不同熱處理條件對蒼耳葉提取物的抑菌作用有不同程度的影響。在溫度低于50℃，30 min以內(nèi)的熱處理對提取物抑菌作用沒有影響。隨著熱處理的溫度的升高，蒼耳葉提取物的抑菌作用減弱，但減弱的程度還與熱處理的時間相關(guān)，高溫短時間處理抑菌作用強于較低溫度長時間處理。

2.5蒼耳葉提取物對獼猴桃潰瘍菌菌液中蛋白質(zhì)濃度的影響

蒼耳葉提取物對獼猴桃潰瘍菌菌液中蛋白質(zhì)濃度的影響結(jié)果見圖2。

圖2蒼耳葉提取物對菌液中蛋白質(zhì)濃度的影響Fig.2 The effect of the extraction from Xanthium sibiricum Patr. leaf on protein content of bacteria

細菌細胞膜是細菌的保護屏障，具有流動性和半透性等功能，但當細菌細胞膜遭到破壞后，細胞膜所固有的功能將會喪失，導(dǎo)致細菌細胞膜的流動性降低和通透性增大，從而對菌體的保護作用被打破，細胞內(nèi)部物質(zhì)蛋白質(zhì)外泄至液體培養(yǎng)基中，導(dǎo)致培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)含量上升，因此，細菌細胞膜通透性的變化可由菌液中蛋白質(zhì)含量的變化情況來反映[21]。由圖2可以看到，蒼耳葉提取物對獼猴桃潰瘍菌細胞膜滲漏具有顯著的影響，并隨著作用時間的增加而愈加明顯。實驗結(jié)果顯示，添加蒼耳葉提取物后6 h的獼猴桃潰瘍菌培養(yǎng)液中蛋白濃度為未加蒼耳葉提取物處理的對照培養(yǎng)液中蛋白濃度的5.9倍。由此可見，添加蒼耳葉提取物的培養(yǎng)菌液其蛋白濃度遠高于對照組，這主要是由于蒼耳葉提取物可改變細菌細胞的膜透性，致使細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)滲漏到體外的培養(yǎng)液中。

2.6菌液中的可溶性總糖

糖類是微生物首要的碳源和能源儲備物質(zhì)。當細菌處于正常生理狀態(tài)時，會吸收利用外源的營養(yǎng)成分，而當膜結(jié)構(gòu)遭到破壞時，細胞內(nèi)容物包括糖類發(fā)生外泄，通過測定細菌培養(yǎng)液中糖濃度的變化，可以了解細菌膜結(jié)構(gòu)的完整性[22-23]。蒼耳葉提取物對獼猴桃潰瘍菌菌液中可溶性總糖含量的影響見圖3。

圖3蒼耳葉提取物對菌液中糖含量的影響Fig.3 The effect of the extraction from Xanthium sibiricum Patr. leaf on sugar content of bacteria

如圖3所示，當獼猴桃潰瘍菌與100 μg/mL的蒼耳葉提取物作用后，培養(yǎng)液中總糖的濃度隨著作用時間的延長逐漸上升，表明它們的細胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，胞內(nèi)的糖類物質(zhì)逐漸滲漏到胞外；然而，對照組均顯示了培養(yǎng)液中總糖濃度的沒有太多變化。這個試驗結(jié)果與上個試驗結(jié)果相接近，說明蒼耳葉提取物對獼猴桃潰瘍菌菌膜有破壞作用。

2.7菌液中的核酸

核酸是細菌的遺傳物質(zhì)，在細菌菌膜完整的情況下，只存在于細菌內(nèi)。細菌的菌膜破裂，細菌死亡，核酸就可以泄露出來，通過測定菌液260 nm處的吸光度，就能夠了解DNA、RNA在菌液中的變化[24]。蒼耳葉提取物對獼猴桃潰瘍菌菌液中核酸含量的影響結(jié)果見圖4。

圖4蒼耳葉提取物對菌液中核酸含量的影響Fig.4 The effect of the extraction from Xanthium sibiricum Patr. leaf on nucleinic acid content of bacteria

由圖4可以看到，加入蒼耳葉提取物250 μg/mL之后，菌液中核酸含量迅速升高并且達到平衡，表明在此濃度下，獼猴桃潰瘍菌菌膜在短時間內(nèi)遭到破壞，其DNA、RNA等大分子物質(zhì)迅速釋放出來，造成獼猴桃潰瘍菌死亡，從而達到抑菌、滅菌的作用。

抗菌藥物對于細菌的抑制、殺死的主要靶標有3個方面：一是對于細胞膜的破壞，干擾細胞膜的合成；二是對于蛋白質(zhì)合成的干擾；三是對于遺傳物質(zhì)的復(fù)制和修復(fù)的干擾破壞[25]。從本次的試驗研究表明，蒼耳葉提取物能夠抑制、殺死獼猴桃潰瘍菌，其抑菌、殺菌的效果與蒼耳葉提取物的劑量有直接的關(guān)系。

3　結(jié)論

研究結(jié)果表明，蒼耳葉提取物對獼猴桃潰瘍菌具有抑制、致死作用，且隨著濃度的增加，抑菌、殺菌效果也增加。這預(yù)示蒼耳葉不僅在食品保藏方面有應(yīng)用價值，而且在獼猴桃潰瘍病的防治方面也具有開發(fā)利用價值。蒼耳葉提取物的抑菌、殺菌效果還與所用的提取溶劑有關(guān)，對于獼猴桃潰瘍菌的抑制作用以乙醇為提取劑的抑菌效果最好，MIC為0.05 mg/mL，該抑菌物質(zhì)對熱具有一定的穩(wěn)定性。乙醇對細菌的抑制效果優(yōu)于其他萃取相，說明蒼耳葉中的抑菌物質(zhì)主要集中在高極性部位，對此部分提取物的進一步追蹤分離將有望發(fā)現(xiàn)具開發(fā)價值的抗菌活性物質(zhì)。研究結(jié)果還表明，蒼耳葉提取物濃度高于100 μg/mL，對獼猴桃潰瘍菌的細胞壁完整性造成破壞，引起潰瘍菌內(nèi)部物質(zhì)如糖類、蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)外泄，造成細菌死亡，從而達到抑菌、殺菌目的。提取物的具體作用靶點及作用機制，需要進一步研究和探討。

在長期使用化學(xué)農(nóng)藥產(chǎn)生一系列公害問題的情況下，尋找“綠色農(nóng)藥”成為了時下非常緊迫的任務(wù)。植物源農(nóng)藥具有取之自然，用之自然，具有低毒、低殘留、對非靶標生物及環(huán)境安全，不易產(chǎn)生抗藥性，可降低或避免化學(xué)農(nóng)藥帶來的“農(nóng)藥公害”等優(yōu)點。植物源殺菌劑的研究這正符合現(xiàn)代人們對農(nóng)藥的要求及其未來農(nóng)藥的發(fā)展方向。蒼耳葉為開發(fā)天然植物源殺菌劑增加了新的選擇。

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Study on Inhibition of Extraction of Xanthium sibiricum Patr.leaf to Pseudomonas syringae pv·Actinidiae

CUI Guo-ting1，WANG Duan1，2，GUO Jin-ying1，XU Bao-cheng1，XIANG Jin-le1
（1. Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，Henan，China；2. Yongcheng Vocational College，Yongcheng 476600，Henan，China）

Abstract：Action mechanism and antimicrobial effect of extraction of Xanthium sibiricum Patr.leaf against the Pseudomonas syringae pv·Actinidiae were studied. The results showed that ethanol extraction of Xanthium sibiricum Patr.leaf showed the strongest antibacterial activity，the minimum inhibitory concentration of it against the Pseudomonas syringae pv·Actinidiae was 50 μg/mL，the completeness of cytoderm was destroyed and the permeability of bacterial cell membrane was increased in the presence of extraction of Xanthium sibiricum Patr. leaf when its concentration exceed 100 μg/mL，which caused transudation of sugar，protein and nucleic acid，that was the antimicrobial mechanism of extraction of Xanthium sibiricum Patr.leaf.

Key words：Xanthium sibiricum；Pseudomonas syringae pv·Actinidiae；inhibition

收稿日期：2014-10-12

作者簡介：崔國庭（1978—），男（漢），講師，博士研究生，研究方向：植物功能性成分提取與活性研究。

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.008