二甲雙胍對宮頸癌Hela細胞Twist及E-cadherin表達的影響及機制

湯軼，孫曉紅

(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，湖南衡陽421000)

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二甲雙胍對宮頸癌Hela細胞Twist及E-cadherin表達的影響及機制

湯軼，孫曉紅

(南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，湖南衡陽421000)

摘要：目的觀察二甲雙胍處理后宮頸癌Hela細胞JAK/STAT3信號通路調(diào)節(jié)靶基因Twist及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標志物E-cadherin的表達變化，并探討其機制。方法 宮頸癌Hela細胞培養(yǎng)后分別經(jīng)IL-6(IL-6組)、二甲雙胍(二甲雙胍組)及IL-6+二甲雙胍(IL-6+二甲雙胍組)處理48 h，未處理細胞作對照組，觀察各組細胞形態(tài)學(xué)變化，檢測細胞壞死情況，Western blotting法檢測p-STAT3、Twist及E-cadherin蛋白表達，RT-PCR法檢測Twist、E-cadherin mRNA表達。結(jié)果IL-6組Hela細胞向間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變，而IL-6+二甲雙胍組Hela細胞未向間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變且細胞壞死。IL-6組、IL-6+二甲雙胍組p-STAT3、Twist、E-cadherin蛋白表達及Twist、E-cadherin mRNA表達與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)，而二甲雙胍組以上指標與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 二甲雙胍可通過阻斷JAK/STAT3信號通路降低宮頸癌Hela細胞Twist及E-cadherin的表達。

關(guān)鍵詞：宮頸腫瘤；二甲雙胍；白細胞介素6；JAK/STAT3信號通路；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

在腫瘤細胞中，多種因素可持續(xù)激活JAK/STAT3信號通路，促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。細胞因子如IL-6，通過激活STAT3，促進腫瘤細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，增強腫瘤細胞對免疫系統(tǒng)的侵襲作用[1~3]。腫瘤細胞EMT特征性表現(xiàn)是E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達缺失，最終使細胞黏附能力下降，侵襲和遷移能力增強。近年來研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍具有抗腫瘤作用及降低腫瘤發(fā)病風(fēng)險，并能提高腫瘤患者的存活率[4~8]。但是，二甲雙胍的抗腫瘤機制尚不完全清楚。2014年1~10月，本研究觀察二甲雙胍對宮頸癌Hela細胞Twist及E-cadherin表達的影響，并探討其機制。

1材料與方法

1.1材料RPMI1640(Hyclone)，胎牛血清(四季青公司)，胰蛋白酶、RIPA裂解液(碧云天公司)，人IL-6(Peprotech)，二甲雙胍(Sigma)，死活細胞染色試劑盒(凱基)；單克隆抗體Twist、E-cadherin、p-stat3(Abcam)，RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒(Qiagen)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma)；倒置顯微鏡 IX71、熒光顯微鏡(Olympus)；生物安全柜(Thermo Scientific)；逆轉(zhuǎn)錄及PCR儀(Bio-Rad)。

1.2Hela細胞培養(yǎng)Hela細胞由南華大學(xué)腫瘤研究所提供，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，待細胞長滿6孔板后，分別采用含50 ng/mL IL-6(IL-6組)、10 mmol/L二甲雙胍(二甲雙胍組)培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，先用含50 ng/mL IL-6的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，再用含10 mmol/L二甲雙胍(IL-6+二甲雙胍組)的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，對照組則采用單純培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，于倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。

1.3細胞染色各組細胞處理48 h，按死活細胞染色試劑盒要求進行染色，活細胞呈現(xiàn)綠色熒光，壞死細胞呈現(xiàn)橙色熒光，熒光顯微鏡下觀察各組細胞染色情況。

1.4細胞p-STAT3、Twist及E-cadherin蛋白表達檢測采用Western blotting法。各組細胞處理48 h，提取總蛋白，測定蛋白濃度，上樣，跑膠，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，洗膜，二抗孵育，顯色，成像。用Image Lab軟件測量目標蛋白條帶的灰度值，與內(nèi)參的灰度值進行比較，取對比值作為目標蛋白相對表達量。以上實驗重復(fù)3次取均值。

1.5細胞Twist、E-cadherin mRNA表達檢測采用RT-PCR法。各組細胞處理48 h，按照試劑盒要求提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并按以下條件進行PCR：95℃ 5 min, 95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，擴增40個循環(huán)。其中GAPDH為內(nèi)參基因， Twist引物序列F：5′-CGTTTCCAGGAGGCCTGGCG-3、R：5′-GCGAGA-CTGGCGAGCTGGAC-3；E-cadherin引物序列F：5′-GGGTTATTCCTCCCATCAGC-3、R：5′- ATTCGGGCTTGTTGTCATTC-3；GAPDH引物序列F：5′-CTTCTA-CAATGAGCTGCGTG-3,R：5′-TCATGAGGTAGTCAGT-CAGG-3。以2-ΔΔCt公式計算Twist、E-cadherin mRNA相對表達量。

2結(jié)果

2.1各組細胞形態(tài)學(xué)變化Hela細胞經(jīng)處理48 h，對照組細胞橢圓形，緊密排列；IL-6組細胞間隙明顯增寬，細胞呈紡錘狀和長梭形，排列散亂，可見Hela細胞向間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變；二甲雙胍組細胞形態(tài)圓形，細胞成團堆積，較多凋亡細胞漂??；IL-6+二甲雙胍組細胞形態(tài)圓形、長梭形，細胞核疏松，細胞成團漂浮。

2.2各組細胞染色結(jié)果Hela細胞經(jīng)處理48 h，對照組、IL-6組只有少量細胞壞死，二甲雙胍組有較多細胞壞死，而IL-6+二甲雙胍組全為壞死細胞(細胞成片漂浮)。

2.3各組細胞p-STAT3、Twist及E-cadherin蛋白表達比較見表1。

表1　各組細胞p-STAT3、Twist及E-cadherin蛋白

注：與對照組比較，*P<0.05。

2.4各組細胞Twist、E-cadherin mRNA表達比較見表2。

表2　各組細胞Twist、E-cadherin mRNA

注：與對照組比較，*P<0.05。

3討論

在腫瘤細胞中，細胞因子、生長因子、炎癥因子等通過改變腫瘤微環(huán)境，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化。腫瘤微環(huán)境中重要的炎癥因子，能通過與相應(yīng)受體特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過持續(xù)激活JAK/STAT3信號通路調(diào)節(jié)靶基因Twist及EMT相關(guān)標志物蛋白如E-cadherin表達，導(dǎo)致細胞向間質(zhì)表型改變，促進腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移[1~3]。本研究發(fā)現(xiàn)，用重組人IL-6處理宮頸癌Hela細胞，出現(xiàn)細胞間隙增寬，呈紡錘狀或長梭形，細胞核顏色變深，誘導(dǎo)Hela細胞向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)變。在蛋白及基因表達水平，我們發(fā)現(xiàn)，用IL-6處理Hela細胞后，STAT3磷酸化水平升高，并使相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Twist蛋白及基因表達上調(diào)，EMT相關(guān)標志蛋白E-cadherin蛋白及基因表達下調(diào)，與相關(guān)研究[9]結(jié)果一致。

二甲雙胍是臨床廣泛應(yīng)用的抗2型糖尿病藥物。有研究報道，二甲雙胍能通過阻斷JAK/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細胞凋亡及自噬相關(guān)基因的表達，調(diào)節(jié)與肝腫瘤細胞、乳腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因及蛋白的表達而逆轉(zhuǎn)EMT，抑制腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移，最終抑制腫瘤進展[3，10]。在肝癌細胞中，二甲雙胍和蛋白激酶(AMPK)激活劑都能抑制IL-6誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并且能通過腺苷-磷酸激活A(yù)MPK途徑調(diào)節(jié)IL-6/gp130/JAK/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)促炎癥因子的表達[11~13]。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-6+二甲雙胍組宮頸癌Hela細胞形態(tài)由狹長變圓，細胞核松散，出現(xiàn)核碎裂，壞死細胞大量漂浮，比單獨使用二甲雙胍對Hela細胞凋亡的促進作用更顯著?？梢?，單獨使用二甲雙胍處理Hela細胞，不能明顯降低STAT3磷酸化水平、Twist蛋白及Twist mRNA表達、上調(diào)E-cadherin蛋白及mRNA表達。IL-6處理Hela細胞后加入二甲雙胍，使STAT3磷酸化水平降低、Twist蛋白及mRNA表達降低，逆轉(zhuǎn)Hela細胞EMT，與文獻報道一致；但是E-cadherin蛋白及mRNA表達較對照組不升反降，與文獻研究結(jié)果相反。我們分析，用IL-6、二甲雙胍聯(lián)合處理宮頸癌Hela細胞，通過抑制JAK/STAT3信號通路，誘導(dǎo)細胞壞死，導(dǎo)致總體細胞量減少，使細胞總蛋白及總mRNA減少，最終導(dǎo)致E-cadherin蛋白及mRNA表達降低。以上研究結(jié)果證明，二甲雙胍以JAK/STAT3信號通路為靶點，阻斷JAK/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制宮頸癌細胞EMT。

綜上所述， IL-6能促進Hela細胞向間質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變，而二甲雙胍可通過JAK/STAT3信號通路逆轉(zhuǎn)宮頸癌Hela細胞EMT，為臨床二甲雙胍治療宮頸癌提供了新思路，但其具體機制及可行性還有待進一步研究證明。

參考文獻：

[1] See Alfred P, Han James E, Phallen Jillian, et al. The role of STAT3 activation in modulating the immune microenvironment of GBM[J]. J Neurooncol, 2012,110(3):359-368.

[2] Kida H, Ihara S, Kumanogoh A. Involvement of STAT3 in immune evasion during lung tumorigenesis[J].Oncoimmunology, 2013,2(1):e22653.

[3] Kourelis TV, Siegel RD. Metformin and cancer: new applications for an old drug[J]. Med Oncol, 2012,29(2):1314-1327.

[4] Belpomme D, Irigaray P, Hardell L, et al. The multitude and diversity of environmental carcinogens[J]. Environ Res, 2007,105(3):414-429.

[5] Agrawal S, Patel P, Agrawal A, et al. Metformin use and the risk of esophageal cancer in Barrett esophagus[J].South Med J, 2014,107(12):774-779.

[6] Schmedt N, Azoulay L, Hense S. Re.: "Reduced risk of lung cancer with metformin therapy in diabetic patients: a systematic review and meta-analysis"[J]. Am J Epidemiol, 2014,180(12):1216-1217.

[7] El-Benhawy SA, El-Sheredy HG. Metformin and survival in diabetic patients with breast cancer[J]. J Egypt Public Health Assoc, 2014,89(3):148-153.

[8] Lin JJ, Gallagher EJ, Sigel K, et al. Survival of patients with stage IV lung cancer with diabetes treated with metformin[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2015,191(4):448-454.

[9] Wen L, Sun L, Xi Y, et al. Expression of calcium sensing receptor and E-cadherin correlated with survival of lung adenocarcinoma[J]. Thorac Cancer, 2015,6(6):754-760.

[10] Cufi S, Vazquez-Martin A, Oliveras-Ferraros C, et al. Metformin against TGFbeta-induced epithelial-to-mesenchymal transition (EMT): from cancer stem cells to aging-associated fibrosis[J]. Cell cycle, 2010,9(22):4461-4468.

[11] Nerstedt A, Cansby E, Amrutkar M, et al. Pharmacological activation of AMPK suppresses inflammatory response evoked by IL-6 signalling in mouse liver and in human hepatocytes[J]. Mol Cell Endocrinol, 2013,375(1-2):68-78.

[12] Nerstedt A, Johansson A, Andersson CX, et al. AMP-activated protein kinase inhibits IL-6-stimulated inflammatory response in human liver cells by suppressing phosphorylation of signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3)[J]. Diabetologia, 2010,53(11):2406-2416.

[13] Cansby E, Nerstedt A, Amrutkar M, et al. Partial hepatic resistance to IL-6-induced inflammation develops in type 2 diabetic mice, while the anti-inflammatory effect of AMPK is maintained[J]. Mol Cell Endocrinol, 2014,393(1-2):143-151.

(收稿日期：2015-10-11)

中圖分類號：R737.33

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)09-0031-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.09.011

通信作者：孫曉紅(E-mail:csxtt@sina.com)