慢阻肺大鼠肺泡灌洗液和外周血中樹突狀細胞趨化因子受體水平變化及意義

孫得勝，劉虹延,令狐陽,顧延會,歐陽瑤

(1遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院，貴州遵義563003；2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院)

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·基礎研究·

慢阻肺大鼠肺泡灌洗液和外周血中樹突狀細胞趨化因子受體水平變化及意義

孫得勝，劉虹延1,令狐陽1,顧延會,歐陽瑤1

(1遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院，貴州遵義563003；2華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院)

摘要：目的觀察慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)大鼠肺泡灌洗液(BALF)和外周血中樹突狀細胞趨化因子受體(CCR)6、CCR7水平變化，并探討其臨床意義。方法 將30只Wistar大鼠隨機分為對照組、慢阻肺模型組、CCL20單抗組各10只，后兩組用氣道內注入脂多糖聯(lián)合煙霧刺激的方法誘導慢阻肺模型，CCL20單抗組在造模前腹腔注射CCL20單克隆抗體。造模第29天觀察大鼠肺組織病理變化，用ELISA法檢測BALF及外周血中CCR6、CCR7水平。結果慢阻肺模型組肺組織HE染色符合慢阻肺的典型病理表現(xiàn)，CCL20單抗組肺部病理變化比慢阻肺模型組減輕。慢阻肺模型組BALF中CCR6水平高于對照組、CCL20單抗組(P均<0.05)，BALF中CCR7水平低于對照組(P<0.05)；而CCL20單抗組BALF中CCR7水平與慢阻肺模型組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。各組外周血中CCR6、CCR7水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。結論 慢阻肺大鼠BALF中CCR6水平升高、CCR7水平降低，而外周血中CCR6、CCR7水平變化不明顯，CCL20單抗可抑制CCR6水平升高以減輕病情。

關鍵詞：慢性阻塞性肺疾??；樹突狀細胞；趨化因子受體6；趨化因子受體7；大鼠

慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)全球倡議認為氣道和肺組織對有害氣體或顆粒的異常炎癥反應是其重要特征[1]。在慢阻肺的炎癥反應過程中有免疫細胞被募集到肺[2]。慢阻肺中的免疫應答是在特定的抗原驅使下完成的[2]，同時受樹突狀細胞(DC)的嚴密調控[3]。在外來抗原侵襲機體時，DC從完好的上皮組織移行到受侵襲的部位并攝取這些抗原[4]。DC繼續(xù)遷移到局部引流淋巴結，提呈所攝取的抗原給相關的T細胞。DC的遷移在其趨化因子受體(CCR)與相關的趨化因子間的相互作用下完成[5]。我們于2011年5月~2014年12月，檢測慢阻肺大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)及外周血中DC的CCR6、CCR7水平，探討其臨床意義。

1材料與方法

1.1實驗材料標準實驗用清潔級雄性Wistar大鼠30只(由第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供)，出生56 d，體質量200~220 g。Monoclonal Anti-rat CCL20 Antibody(R&D Systems公司)，大鼠CCR6、CCR7 ELISA試劑盒(上海西唐生物科技公司)，LPS(Sigma公司)，香煙(煙氣煙堿量1.2 mg、焦油13 mg、煙氣一氧化碳14 mg，遵義牌，貴州中煙工業(yè)有限責任公司)。

1.2模型建立將大鼠隨機分為對照組、慢阻肺模型組和CCL20單抗干預組，各10只。根據(jù)參考文獻[6]制備慢阻肺模型。分別于第1、15天大鼠氣道內注入細菌內毒素脂多糖(LPS)溶液內被動吸煙(每天2次，每次間隔2 h，每次燃12支香煙)。對照組不予上述處理，CCL20單抗組大鼠第1天注入LPS前腹腔注射CCL20單克隆抗體100 μg。

1.3支氣管肺泡灌洗液(BALF)及外周血中CCR6、CCR7檢測造模第29天選取各組大鼠用直徑約1 mm的毛細管從大鼠內毗球后靜脈采集1 mL血，離心后取上清。大鼠麻醉后開胸，結扎右肺，剪取右肺下葉予多聚甲醛固定，制作石蠟標本及病理切片，并行HE染色，鏡下觀察肺組織病理變化。取右肺上葉放入低溫冷凍管，并保存?zhèn)溆?。在大鼠氣管下段作一倒“T”形切口，插入內徑約1 mm的塑料管，用注射器緩慢注入4 ℃生理鹽水5 mL，并輕柔按摩大鼠肺臟行支氣管肺泡灌洗3次，將回抽的灌洗液保存，采用ELISA法檢測各組BALF及外周血中CCR6、CCR7。實驗重復4次，取平均值。

2結果

2.1各組肺組織病理變化對照組肺泡結構完整連續(xù)，肺泡壁完好，小支氣管未見炎性細胞浸潤及腺體。慢阻肺模型組部分肺泡間隔增寬，在增寬的肺泡間隔內可看到毛細血管擴張充血，并伴有淋巴細胞、中性粒細胞及單核細胞浸潤；部分肺泡間隔出現(xiàn)變窄、斷裂甚至融合，符合慢阻肺的特征性病理表現(xiàn)特點。CCL20單抗組肺泡腔稍增大，伴有肺泡間隔增寬，可見炎性細胞的浸潤，但與慢阻肺模型組相比其病理改變的程度顯著減輕。

2.2各組BALF及外周血中CCR6、CCR7水平比較見表1。

表1　各組BALF及外周血中CCR6、

注：與對照組比較，*P<0.05；與慢阻肺模型組比較，#P<0.05。

3討論

慢阻肺是以不完全可逆、呈進行性發(fā)展的氣流受限為特征的氣道慢性炎癥性疾病，吸煙和感染被公認是引起慢阻肺發(fā)病的最主要的環(huán)境因素。我們對大鼠進行煙霧刺激并注射LPS誘發(fā)感染以模擬這種病理生理過程，28 d后慢阻肺模型組病理改變結果與文獻[6]報道一致，符合慢阻肺病理的特征性表現(xiàn)；而CCL20單抗組大鼠肺部病理表現(xiàn)比慢阻肺模型組明顯減輕。

本研究結果表明，慢阻肺大鼠BALF中CCR6的水平均較對照組增多。CCR6是未成熟DC(iDC)的CCR[7]，作為與iDC緊密相連的CCR6可看作iDC自身結構的一部分，當氣道發(fā)生炎癥反應時，在炎癥介質的刺激下，部分CCR6帶動iDC從其“儲備庫”向肺部遷移[8]，故而可引起肺部iDC和CCR6的增多。CCL20是CCR6的配體[9]，二者相互作用被認為是iDC被募集的一個可能的重要機制。本研究結果顯示，CCL20單抗組BALF中CCR6水平低于慢阻肺模型組(P<0.05)。這很可能由于CCL20抗體結合了大量的CCL20，從而使能與CCR6相互作用的CCL20顯著減少，致使被趨化到肺部的CCR6減少，同時也使慢阻肺病情減輕。BALF中CCR7水平比較，慢阻肺模型組低于對照組，CCL20單抗組與慢阻肺模型組無統(tǒng)計學差異。這是因為CCR7是成熟DC的受體[10]，其配體是CCL19和CCL21[11]，而不是CCL20，所以注射該單抗后對體內的CCR7并沒有發(fā)生直接的作用。本研究中各組外周血中CCR6、CCR7水平比較差異均無統(tǒng)計學意義，原因可能為趨化活動中發(fā)生遷移的CCR的數(shù)量與外周血內的總量比太少，所以對外周血中CCR6、CCR7的水平沒有產生明顯的影響。

總之，慢阻肺的發(fā)病可能與肺部CCR6水平升高及CCR7水平降低有關，使用CCL20單抗能部分抑制這一效應，使病情減輕。然而，在慢阻肺的炎癥反應中多種CCR起著調控作用，需要同時抑制多種CCR才能達到理想的治療效果，有待于以后的研究中進一步探索。

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(收稿日期：2015-12-11)

中圖分類號：R563

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)09-0024-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.09.008

通信作者：歐陽瑤(E-mail：ouyangyao116@sohu.com)

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81460008)。