不同提取溫度對蛤蔞葉粗多糖抗氧化作用的影響研究

陳丹丹，郭源鑫，陳建平，諶素華，鐘賽意，王維民，秦小明（廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江　524088）

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不同提取溫度對蛤蔞葉粗多糖抗氧化作用的影響研究

陳丹丹，郭源鑫，陳建平，諶素華，*鐘賽意，王維民，秦小明
（廣東海洋大學食品科技學院，廣東湛江524088）

摘要：采用熱水浸提法分別在不同提取溫度（40，60，80，100℃）下提取得到4種蛤蔞葉粗多糖，并測定其總多酚和蛋白質的含量。然后測定4種粗多糖對羥基自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力，以及粗多糖的還原能力來評價提取溫度對其抗氧化活性的影響。結果顯示，蛤蔞葉粗多糖中總多酚和蛋白質的含量隨著提取溫度的升高而下降。提取溫度在40～100℃內，隨著提取溫度的升高，蛤蔞葉粗多糖對羥基自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力均呈下降趨勢，而提取溫度對其還原能力的影響沒有明顯差別。結果表明，提取溫度對于蛤簍葉粗多糖的抗氧化活性有顯著影響，主要是通過影響粗多糖中的總多酚和蛋白質含量來影響其抗氧化活性。

關鍵詞：蛤蔞葉；多糖；抗氧化活性；提取溫度

蛤蔞（Piper sarmentosum Roxb）又名蒟醬、青蒟、蘆子、檳榔蒟，屬胡椒科胡椒屬植物，具有祛風散寒、行氣化痰、消腫止癢等功能，用于治療感冒咳嗽、哮喘、風濕痛、胃寒痛、妊娠水腫等疾患。蛤蔞廣泛分布在我國東南沿海地區(qū)和東南亞國家，是廣為使用的調味品和民間藥用植物。細胞內自由基產生的損傷可以導致癌癥、心血管疾病和免疫系統衰退等多種退變性疾病[1]，攝入外源性的抗氧化劑能有效地預防或抑制這些疾病的發(fā)生。因此，天然抗氧化劑受到越來越多的關注[2]。近年來，天然植物活性多糖的抗氧化研究成為熱點，如夏枯草多糖[3]、刺五加多糖[4]、黃瓜多糖[5]等。然而，目前國內外對蛤蔞葉多糖的研究未見相關報道。本文以蛤蔞葉為原料，采用熱水浸提法提取蛤蔞葉粗多糖，通過清除羥基自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基和還原能力的測定來探討不同提取溫度對蛤蔞葉粗多糖抗氧化作用的影響，為功能性蛤蔞葉多糖的提取和開發(fā)這一豐富的植物資源奠定基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

新鮮蛤蔞葉，采自湛江湖光巖；無水乙醇、三氯乙酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、六氰合鐵酸鉀、三氯化鐵，以及VC，DPPH，鄰苯三酚，K2HPO4，KH2PO4，均為分析純，購于國藥集團上海化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

BLF-500型打漿機，永康市江南歐川電機廠產品；GZX-92 MBE型數顯鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠產品；TDL-40B型離心機，上海安亭科學儀器廠產品；AY120型島津托盤電子天平，島津公司產品；LGJ-10C型冷凍干燥機，北京四環(huán)科學儀器廠有限公司產品；YLE-2000型數顯式電熱恒溫水浴鍋，上海躍進醫(yī)療器械廠產品；UV-3200PC型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司產品；美國丹佛UB-7/10型精密pH儀，南京承正科學儀器有限公司產品。

1.3原料的預處理

將新鮮的蛤蔞葉采摘后，用蒸餾水洗凈，放入干燥箱干燥至易碎，簡單破碎后放入打漿機中打碎成粉末狀，將粉末過60目篩，對粉末樣品進行恒溫干燥，至恒質量，裝入密封袋在干燥器中常溫保存。

1.4蛤蔞葉粗提液的提取和組分測定

將試驗設為4組，每組稱取50g蛤蔞葉粉末于燒杯中，在料液比為1∶15的前提下，采用熱水浸提法分別在溫度為40，60，80，100℃下提取2 h。經抽濾后，將粗提液于轉速4 000 r/min條件下離心10min得到上清液，此上清液即為蛤蔞葉的粗提液。然后，采用苯酚-硫酸比色法[6]、3,5-二硝基水楊酸法[7]分別測定粗提液中的總糖含量、還原性糖含量。

1.5蛤蔞葉粗多糖的分離提取和組分測定

通過1.4中方法得到不同提取溫度下的粗提液，然后分別緩慢加入3倍體積的95％乙醇溶液（邊加邊攪拌），靜置24 h，以轉速4 000 r/min離心10min，得到粗多糖沉淀；少量蒸餾水溶解沉淀，過濾后得到水溶性多糖和水不溶性多糖，冷凍干燥，得到蛤蔞葉的粗多糖。然后，通過Folin-Ciocalteu比色[8]、Folin-酚試劑法測定粗多糖中總多酚和蛋白質的含量。

1.6蛤蔞葉粗多糖的抗氧化活性測定

1.6.1蛤蔞葉粗多糖對羥基自由基的清除能力測定

參考許海順等人[9]的方法進行測定，取4支10 mL試管，分別加入9.0 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL、10.0 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1.0 mL，然后分別加入1.0 mL質量濃度為0.1，0.4，0.7，1.0 mg/mL的蛤蔞葉粗多糖溶液，加蒸餾水定容至5.0 mL，再加入6.0 mmol/L H2O2各1.0 mL，置于37℃水浴中反應10min，于波長510 nm處測定吸光度。空白對照組用相同體積的蒸餾水代替粗多糖樣品。以VC作為陽性對照，質量濃度分別為0.1，0.4，0.7，1.0 mg/mL。將試驗重復3次，按照下列公式計算羥基自由基清除率。

羥基自由基清除率

式中：A0——空白對照液吸光度，只加入水楊酸-乙醇、FeSO4和H2O2，不加入蛤蔞葉粗多糖溶液的吸光度；

As——加入水楊酸-乙醇、蛤蔞葉粗多糖溶液、

FeSO4和H2O2的吸光度；

Ac——加入水楊酸-乙醇、蛤蔞葉粗多糖溶

液、FeSO4，不加H2O2的吸光度。

1.6.2蛤蔞葉粗多糖對DPPH自由基的清除能力測定

參考許海順等人[9]的方法進行測定，取0.1，0.4，0.7，1.0 mg/mL的粗多糖溶液各2.0 mL，置于10 mL試管中，加入0.08％的DPPH溶液3.0 mL，于室溫避光反應30min后，以蒸餾水作為空白，于波長517 nm處測定其吸光度。以VC作為陽性對照，質量濃度分別為0.02，0.08，0.14，0.2，0.4，0.7，1.0 mg/mL。按照下列公式計算DPPH自由基清除率，將試驗重復3次，取其平均值。

式中：A0——2.0 mL蒸餾水+ 3.0 mL DPPH溶液的吸光度；

As——2.0 mL樣品溶液+ 3.0 mL DPPH溶液的吸光度；

Ac——2.0 mL樣品溶液+ 3.0 mL蒸餾水的吸光度。

1.6.3蛤簍葉粗多糖對超氧陰離子自由基的清除能力

鄰苯三酚自氧化曲線的測定，參考王宗君[10]的方法進行。取pH值為8.2，50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液4.5 mL，加入4.2 mL去離子水，混勻后置于25℃的水浴中保溫20min，取出后立刻加入已在25℃水浴中預熱過的3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL（用10 mmol/L的HCl溶液代替鄰苯三酚作為空白），混勻后馬上將反應液倒入比色皿中，于波長325 nm處測定吸光度，每30 s記錄數值，總共5min。得到隨著時間變化的曲線即鄰苯三酚自氧化曲線，做直線回歸方程后得到的斜率，即為鄰苯三酚自氧化的速率。

鄰苯三酚自氧化曲線見圖1。

圖1　鄰苯三酚自氧化曲線

樣品清除超氧陰離子速率V1的測定：將鄰苯三酚自氧化曲線的制作方法里添加的4.2 mL去離子水替換成3.2 mL去離子水和1 mL樣品溶液，其他步驟同上。VC做為陽性對照，質量濃度為0.1，0.2，0.3，1.4，0.5，0.6 mg/mL。以時間為橫坐標、吸光度為縱坐標，做直線回歸得到的斜率即為樣品清除超氧陰離子的速率。每個質量濃度重復3次，取平均值。超氧陰離子清除率計算公式為：

式中：V0——鄰苯三酚自氧化的速率；

V1——樣品清除超氧陰離子的速率。

1.6.4蛤蔞葉粗多糖的還原能力測定[9，11]

量取2.5 mL不同質量濃度的粗多糖樣品，質量濃度分別為0.1，0.4，0.7，1.0 mg/mL（空白對照用1 mL蒸餾水代替，其他試劑依次同下），各加入0.2 mol/L pH值為6.6的磷酸鹽緩沖液2.5 mL和1％的K3Fe(CN)6溶液2.5 mL，混勻，置于50℃水浴中反應20min，然后迅速冷卻，再加入2.5 mL的10％三氯乙酸溶液，量取反應的溶液5 mL，加入蒸餾水5 mL和0.1％的FeCl3溶液1 mL，混合均勻，反應10min后于波長700 nm處測定其吸光度。VC做為陽性對照，質量濃度分別為0.02，0.08，0.14，0.2 mg/mL。將試驗重復3次，測吸光度，求平均值。

2　結果與討論

2.1蛤蔞葉粗提液和粗多糖中組分的測定

不同提取溫度對蛤蔞葉粗提液中的總糖、還原性糖及粗多糖中總多酚和蛋白質的影響。

不同提取溫度下提取得到的蛤蔞葉粗提液和粗多糖的組成成分分析（±S）見表1。

表1　不同提取溫度下提取得到的蛤蔞葉粗提液和粗多糖的組成成分分析（±S）

表1　不同提取溫度下提取得到的蛤蔞葉粗提液和粗多糖的組成成分分析（±S）

提取溫度θ/℃粗提液組分/％　粗多糖組分/％總糖　還原性糖　總多酚　蛋白質40 60 80 100 35.05±0.69 38.76±0.21 45.72±0.32 47.20±0.81 19.86±0.20 21.06±2.05 21.86±0.24 22.26±1.20 23.91±0.20 20.85±0.27 20.01±0.10 1.31±0.18 17.75±0.89 16.01±0.28 15.61±0.46 3.21±0.14

由表1可知，在試驗提取溫度內，隨著提取溫度的升高，粗提液中總糖和還原性糖的含量呈上升趨勢，說明在一定溫度范圍內，提取溫度越高，提取的總糖和還原性糖就越多。然而，提取溫度越高，得到的粗多糖中總多酚和蛋白質的含量卻逐漸降低，這可能是由于提取溫度升高，粗多糖中的一些酚類物質發(fā)生了氧化，從而導致總多酚含量的下降；而蛋白質在高溫下容易失活，從而導致蛋白質含量下降。

2.2蛤蔞葉粗多糖對羥基自由基的清除能力

不同提取溫度對不同質量濃度的蛤蔞葉粗多糖清除羥基自由基的影響見圖2，不同提取溫度對不同質量濃度的蛤蔞葉粗多糖清除羥基自由基的影響（±S）見表2。

圖2　不同提取溫度對不同質量濃度的蛤蔞葉粗多糖清除羥基自由基的影響

提取溫度θ/℃粗多糖質量濃度/mg·mL-10.1清除率/％0.4清除率/％0.7清除率/％1.0清除率/％40 60 80 100 8.71±0.69 7.60±0.59 8.82±0.55 8.91±0.84 19.79±0.78 13.25±0.62 18.12±0.93 10.28±0.37 30.58±1.04 26.15±1.35 29.64±0.78 12.31±1.02 37.46±1.11 27.36±0.95 34.79±0.56 13.38±1.25

由圖2和表2可知，當蛤蔞葉粗多糖質量濃度為0.1～1.0 mg/mL，4種提取溫度下提取得到的蛤蔞葉粗多糖對羥基自由基的清除率，均隨著其質量濃度的增加而逐漸加強，呈現量效關系。而且，不同提取溫度下提取的蛤蔞葉粗多糖對羥基自由基的清除能力有顯著不同，升高提取溫度會降低蛤蔞葉多糖對羥基自由基的清除能力，這可能是由于提取溫度升高，粗多糖中總多酚和蛋白質的含量下降導致的。相比其他提取溫度，當蛤蔞葉在40℃提取的粗多糖質量濃度為1.0 mg/mL時，表現出對羥基自由基最強的清除效果，其清除率達37.46％，表明蛤蔞葉粗多糖具有一定的清除羥基自由基能力，但是相比陽性對照VC，蛤蔞葉粗多糖對羥基自由基的清除能力要低于陽性對照VC對羥基自由基的清除率（60.10％）。

2.3蛤蔞葉粗多糖對DPPH自由基的清除能力

不同提取溫度對不同質量濃度的蛤蔞葉粗多糖清除DPPH自由基的影響見圖3，不同提取溫度對不同質量濃度的蛤蔞葉粗多糖清除DPPH自由基的影響（±S）見表3。

由圖3和表3可知，在試驗質量濃度范圍內，4種不同提取溫度下提取得到的蛤蔞葉粗多糖對DPPH自由基的清除率均隨著粗多糖質量濃度的提高而增大。而且，隨著提取溫度的升高，提取得到的蛤蔞葉粗多糖對DPPH自由基的清除能力呈逐漸下降趨勢，這可能是由于提取溫度升高，粗多糖中總多酚和蛋白質的含量下降導致其對DPPH自由基的清除能力下降。當粗多糖質量濃度在1.0 mg/mL時，所有樣品對DPPH自由基的清除率都能達到40％以上。然而，其清除率仍要遠低于陽性對照VC。

2.4蛤蔞葉粗多糖對超氧陰離子自由基的清除能力

不同提取溫度對不同質量濃度的蛤蔞葉粗多糖清除超氧陰離子自由基的影響見圖4，不同提取溫度對不同質量濃度的蛤蔞葉粗多糖清除超氧陰離子自由基的影響（±S）見表4。

圖3　不同提取溫度對不同質量濃度的蛤蔞葉粗多糖清除DPPH自由基的影響

表3　不同提取溫度對不同質量濃度的蛤蔞葉粗多糖清除DPPH自由基的影響（±S）

表3　不同提取溫度對不同質量濃度的蛤蔞葉粗多糖清除DPPH自由基的影響（±S）

提取溫度θ/℃粗多糖質量濃度/mg·mL-10.1清除率/％0.4清除率/％0.7清除率/％1.0清除率/％40 60 80 100 15.57±0.59 14.25±1.21 12.47±1.15 10.28±0.16 47.41±0.89 41.74±0.96 36.20±1.18 34.87±0.94 53.30±2.32 49.29±0.64 41.18±0.44 40.13±0.90 54.95±0.85 50.38±0.28 43.75±0.79 41.91±0.99

圖4　不同提取溫度對不同質量濃度的蛤蔞葉粗多糖清除超氧陰離子自由基的影響

由圖4和表4可知，在試驗質量濃度范圍內，4種不同提取溫度下提取得到的蛤蔞葉粗多糖對超氧陰離子自由基的清除率均隨著粗多糖質量濃度的增加而增大。而且，相對其他提取溫度提取的粗多糖，40℃提取的粗多糖對超氧陰離子自由基的清除率較高，100℃提取的粗多糖其清除率最低，表明隨著提取溫度的升高，提取得到的蛤蔞葉粗多糖對超氧陰離子自由基的清除能力呈逐漸下降趨勢，這可能是由于提取溫度升高，粗多糖中總多酚和蛋白質的含量下降導致其對超氧陰離子自由基的清除能力下降。而且，蛤蔞葉粗多糖對超氧陰離子自由基的清除率也要低于陽性對照VC。

2.5蛤蔞葉粗多糖的還原能力

不同提取溫度對不同質量濃度的蛤蔞葉粗多糖還原能力的影響見圖5，不同提取溫度對不同質量濃度的蛤蔞葉粗多糖還原能力的影響（±S）見表5。

表4　不同提取溫度對不同質量濃度的蛤蔞葉粗多糖清除超氧陰離子自由基的影響（±S）

表4　不同提取溫度對不同質量濃度的蛤蔞葉粗多糖清除超氧陰離子自由基的影響（±S）

提取溫度θ/℃粗多糖質量濃度/mg·mL-10.1清除率/％0.2清除率/％0.3清除率/％0.4清除率/％0.5清除率/％0.6清除率/％40 60 80 100 14.27±0.72 15.34±0.61 12.48±0.38 10.23±0.93 20.49±0.92 20.28±1.02 17.85±0.81 14.64±0.22 29.36±0.96 26.83±0.33 24.14±1.58 21.43±0.87 33.79±2.15 32.39±0.48 30.84±0.82 26.56±0.66 44.37±0.92 43.23±0.40 41.29±0.80 35.26±0.61 52.28±1.38 50.56±0.89 45.53±0.41 43.64±0.61

圖5　不同提取溫度對不同質量濃度的蛤蔞葉粗多糖還原能力的影響

表5　不同提取溫度對不同質量濃度的蛤蔞葉粗多糖還原能力的影響（±S）

表5　不同提取溫度對不同質量濃度的蛤蔞葉粗多糖還原能力的影響（±S）

提取溫度θ/℃粗多糖質量濃度/mg·mL-10.1清除率/％0.4清除率/％0.7清除率/％1.0清除率/％40 60 80 100 0.176±0.006 0.184±0.012 0.248±0.002 0.175±0.003 0.526±0.008 0.573±0.004 0.621±0.004 0.548±0.005 1.017±0.012 1.176±0.006 1.195±0.010 1.045±0.016 1.262±0.011 1.386±0.002 1.407±0.003 1.326±0.010

由圖5和表5可知，在試驗質量濃度范圍內，4種不同提取溫度下提取得到的蛤蔞葉粗多糖的還原

能力均隨著粗多糖質量濃度的增加而增大。但是，不同提取溫度下提取得到的粗多糖之間的還原能力差異不顯著，這可能是因為提取溫度升高，粗多糖中還原性糖的含量相差不大導致的。

3　結論

通過測定不同提取溫度下得到的蛤蔞葉粗多糖對羥基自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力及其還原能力，并評價提取溫度對蛤蔞葉粗多糖抗氧化活性的影響。結果表明，提取溫度能夠顯著影響蛤蔞葉粗多糖的抗氧化活性，表現為提取溫度越高，蛤蔞葉粗多糖對羥基自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基的清除能力就越低；提取溫度對于蛤蔞葉粗多糖的還原能力影響不顯著。不同提取溫度下得到的蛤蔞葉粗多糖均表現出一定的抗氧化活性，但是均要弱于VC。蛤蔞葉粗多糖的抗氧化活性強弱與其中的總多酚和蛋白質含量呈正相關。

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Study on Effect of Different Extraction Temperatures on Antioxidant Activity of Crude Polysaccharides from Piper sarmentosum Roxb

CHEN Dandan，GUO Yuanxin，CHEN Jianping，CHEN Suhua，*ZHONG Saiyi，WANG Weiming，QIN Xiaoming
（Food Technology College，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong 524088，China）

Abstract：The crude polysaccharides is extracted by the methods of hot water extraction technology under four different temperatures（40，60，80，100℃）.Then，total polyphenol and protein content of crude polysaccharides are measured.Moreover，the antioxidant activity of crude polysaccharides extracted with different temperatures is measured by scavenging hydroxyl free radicals assay，scavenging DPPH free radicals assay，scavenging superoxide anion and its reduce power to evaluate the effect of temperature on the antioxidant activity of polysaccharides，and the antioxidant activities.The results show that with the temperature increased，the total polyphenol and protein content of crude polysaccharides are decreased.At the extraction temperature from 40 to 100℃，with the increasing of temperature，the scavenging ability of crude polysaccharides on hydroxyl free radicals，DPPH free radicals and superoxide anions are decreased.However，the effect of temperature on the reduce power of crude polysaccharides is no obvious difference.Our results demonstrate that the temperature has significant effect on the antioxidant activity of crude polysaccharides by affecting its total polyphenol and protein content.

Key words：Piper sarmentosum Roxb；polysaccharides；antioxidant activity；extraction temperature

文章編號：1671-9646（2016）02a-0001-04

*通訊作者：鐘賽意（1979—），男，博士，副教授，研究方向為食品功能因子及功效評價。

基金項目：廣東省公益研究與能力建設專項資金項目（2015A020209166）；廣東省大學生科技創(chuàng)新培育專項資金項目（PDJH2015B0254）。

作者簡介：陳丹丹（1995—），女，本科，研究方向為植物化學成分的分離提取。

收稿日期：2015-12-09

中圖分類號：S182

文獻標志碼：A

doi：10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.02.001