烏司他丁對缺血再灌注大鼠腦保護及其機制研究

羅江輝，李文瑤，陶國才

(1.四川省腫瘤醫(yī)院 手術麻醉科，四川 成都　610041； 2.第三軍醫(yī)大學附屬西南醫(yī)院

手術麻醉科，重慶　400038)

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烏司他丁對缺血再灌注大鼠腦保護及其機制研究

羅江輝1，李文瑤1，陶國才2

(1.四川省腫瘤醫(yī)院 手術麻醉科，四川 成都610041； 2.第三軍醫(yī)大學附屬西南醫(yī)院

手術麻醉科，重慶400038)

[摘要]目的：探討烏司他丁對成年SD大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用及其機制。方法:將成年雄性SD大鼠隨機分為空白對照組、假手術對照組、腦缺血再灌注損傷組、烏司他丁組，每組12只。空白對照組不做手術處理；假手術對照組麻醉后僅分離頸總動脈，20 min后縫合切口；腦缺血再灌注組麻醉后建立腦缺血再灌注損傷模型；烏司他丁組在腦缺血再灌注組的基礎上于再灌注時靜脈注射烏司他丁50μg·kg(-1)。4組大鼠在手術后6、24、72 h取靜脈血測Sl00β蛋白、神經烯醇化酶(NSE)含量。所有大鼠在術后72 h取血后斷頭處死，取腦組織測IL- 1β、TNF- α含量。結果:與空白對照組比較，假手術對照組、腦缺血再灌注組、烏司他丁組術后6、24、72 h靜脈血Sl00β蛋白、NSE表達均上升(P<0.01)，術后72 h腦組織IL- 1β、TNF- α表達均上升(P<0.01)。與假手術對照組比較，腦缺血再灌注組術后6、24、72 h Sl00β蛋白、NSE表達明顯上升(P<0.01),術后72 h腦組織IL- 1β、TNF- α表達均明顯上升(P<0.01)。與腦缺血再灌注組比較，烏司他丁組術后6、24、72 h Sl00β蛋白、NSE表達明顯下降(P<0.01)；術后72 h腦組織 IL- 1β、TNF- α表達均明顯下降(P<0.01)。結論:手術中腦缺血再灌注可導致大鼠神經細胞損傷，引發(fā)大腦炎癥反應；烏司他丁可抑制這種損傷，降低大腦炎癥反應。

[關鍵詞]烏司他丁； 神經； 缺血再灌注； 炎癥； 大鼠

腦缺血再灌注損傷在臨床手術中較為常見，對患者預后及后期生活影響較大，因此降低手術中腦缺血再灌注損傷是臨床重要課題。在腦缺血再灌注損傷中，主要是炎癥反應對神經細胞的損傷。目前研究發(fā)現，烏司他丁具有抗炎和保護中樞系統(tǒng)作用[1- 2]。本實驗觀察了成年大鼠手術中缺血再灌注損傷后中樞神經損傷及腦炎癥反應情況，旨在發(fā)現烏司他丁是否可降低缺血再灌注損傷中炎癥反應對神經細胞的損傷。

1材料和方法

1.1實驗分組

實驗動物選用3～4月齡雄性SD大鼠(成都達碩生物科技有限公司動物實驗中心提供)，隨機分為空白對照組、假手術對照組、腦缺血再灌注損傷組、烏司他丁組，每組12只。

1.2模型制備

空白對照組大鼠不做手術處理，其余3組大鼠使用5%水合氯醛(4～6 ml·kg-1)麻醉，取頸部正中切口，暴露雙側頸總動脈。假手術對照組20 min后直接縫合；腦缺血再灌注組、烏司他丁組分別用兩只無創(chuàng)微血管夾同時夾閉雙側頸總動脈，20 min后同時松開血

管夾，觀察到雙側頸總動脈復流后縫合[3]。烏司他丁組于復流后立即靜脈注射鹽酸烏司他丁50μg·kg-1。有呼吸困難、提前死亡及處死時發(fā)現蛛網膜下腔出血的動物均棄之不用。

1.3觀察指標

1.3.1血漿SlOOβ蛋白、神經烯醇化酶(NSE)含量檢測各組大鼠于術后6、24、72 h采用尾靜脈采靜脈血漿，使用Sl00β蛋白、NSE試劑盒檢測，嚴格按說明書進行操作。

1.3.2腦組織 IL- 1β、TNF-α含量檢測各組大鼠于72 h取血后斷頭處死取腦，將全腦勻漿，使用ELISA試劑盒檢測腦組織IL- 1β、TNF-α含量。

1.4統(tǒng)計學處理

2結果

2.1各組術后不同時間點S100β、NSE檢測見表1。

ng·L-1

與空白對照組比較，aP<0.01；與假手術對照組比較，bP<0.01；與腦缺血再灌注組比較，cP<0.01

術后6、24、72 h，假手術對照組、缺血再灌注組、烏司他丁組血漿S100β蛋白、NSE表達均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。腦缺血再灌注組血漿S100β蛋白、NSE表達均高于假手術對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。烏司他丁組血漿S100β蛋白、NSE表達均低于腦缺血再灌注組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

2.2各組大鼠術后72 h大腦炎癥因子表達見表2。

ng·L-1

與空白對照組比較，aP<0.01；與假手術對照組比較，bP<0.01；與腦缺血再灌注組比較，cP<0.01

術后72 h，假手術對照組、缺血再灌注組、烏司他丁組大鼠腦組織TNF-α和IL- 1β表達均高于空白對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。腦缺血再灌注組腦組織TNF-α和IL- 1β表達較假手術對照組更高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；烏司他丁組大鼠腦組織TNF-α和IL- 1β表達低于腦缺血再灌注組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

3討論

腦缺血再灌注損傷在臨床較為常見，一旦發(fā)生可引起神經細胞大量凋亡，對患者傷害較大[4]。S100β蛋白、NSE是目前常用的檢測腦損傷及腦功能損傷指標。本實驗發(fā)現，手術后6、24、72 h，假手術對照組與缺血再灌注組NSE和Sl00β蛋白表達均上升，而缺血再灌注組明顯高于假手術組，說明缺血再灌注較單純手術對神經細胞損傷更大。

腦缺血再灌注損傷機制復雜，炎癥反應在其中發(fā)揮了重要作用[5]。TNF-α和IL- 1β是兩個重要的炎癥細胞因子，在腦缺血再灌注損傷的炎癥反應中起重要作用[5]。本實驗發(fā)現，手術后72 h，沒有發(fā)生腦缺血再灌注損傷的大鼠腦組織炎癥反應較輕，而發(fā)生腦缺血再灌注損傷的大鼠腦組織炎癥反應較重，說明缺血再灌注較手術本身引發(fā)神經系統(tǒng)炎癥反應更強。目前研究認為，手術本身即可引起一定程度神經損傷，也是造成術后認知功能障礙的重要原因，而術中發(fā)生缺血再灌注則可引起嚴重神經損傷。本研究與文獻相符。

烏司他丁的中樞保護作用已有研究[1- 2]證實。研究[6- 7]發(fā)現，烏司他丁能抑制氧自由基的產生，阻抑內源性休克因子如心肌頓抑因子(myocardial depressant factor，MDF)生成，抑制多種炎癥介質如TNF-α、血小板活化因子(PAF)、白介素(IL- 6、IL- 8)等產生。推測烏司他丁的腦保護作用與其抗炎作用密切相關。本實驗也發(fā)現，使用烏司他丁可減少手術引起的中樞炎癥反應，同時降低缺血再灌注損傷引起的神經細胞損傷，故推測烏司他丁可在缺血再灌注損傷中通過減輕炎癥反應降低神經細胞損傷。

綜上所述，腦缺血再灌注損傷可大鼠引發(fā)大腦炎癥反應，導致大腦神經損傷。使用烏司他丁可抑制這種損傷，降低大腦神經細胞損傷。

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Protective effect and mechanism of ulinastatin on brain ischemic reperfusion injury in rats

LUO Jiang- hui1，LI Wen- yao1，TAO Guo- cai2

(1.DepartmentofSurgeryandAnesthesiology，SichuanCancerHospital，Chengdu610041，China； 2.DepartmentofSurgeryandAnesthesiology，SouthwestHospital，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400038，China)

[Abstract]Objective： To investigate the protective effect and the mechanism of ulinastatin on the brain ischemic- reperfusion injury in rats. Methods: Male Sprague- Dawley adult rats were randomly allocated to control group，surgery alone group，ischemic- reperfusion brain injury group，and ulinastatin group. Rats in surgery alone group received surgery without ischemic- reperfusion. Rats in ischemic- reperfusion brain surgery group received ischemic- reperfusion brain surgery. Rats in ulinastatin group received intravenous injection of ulinastatin(50μg·kg(-1))at the time after ischemic- reperfusion brain injury. The concentrations of S100β and NSE in plasma were measured by ELISA at 6，24，72 h after operation. Brain IL- 1β and TNF- α were measured by ELISA at 72 h after operation. Results: Compared with control group，the expression of S100β and NSE were enhanced in the surgery alone group，ischemic- reperfusion brain injury group and ulinastatin group at 6,24,72 h after operation (P<0.01)，and brain expression of IL- 1β and TNF- α were enhanced at 72 h after operation(P<0.01). Compared with injury alone group，the expression of S100β and NSE were enhanced in ischemic- reperfusion brain surgery group and ulinastatin group at 6,24,72 h after operation (P<0.01)and brain expression of IL- 1β，TNF- α were enhanced at 72 h after operation(P<0.01). Compared with ischemic- reperfusion brain injury group，the expression of S100β and NSE were diminished at 6,24,72 h after operation(P<0.01)and the expression of IL- 1β and TNF- α were diminished at 72 h after operation in ulinastatin group(P<0.01). Conclusion: Ulinastatin can restrain inflammation in central nervous system and diminish the nervous impairment after ischemic- reperfusion brain injury in rats．

[Key words]ulinastatin; nerve; ischemic- reperfusion; inflammation; rat

doi：10.3969/j.issn.1671- 6264.2016.02.010

[中圖分類號]R453.9

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671- 6264(2016)02- 0199- 03

[通信作者]陶國才E- mail:13908393339@vip.163.com

[作者簡介]羅江輝(1972-)，男，四川瀘州人，主治醫(yī)師。E- mail：temasek@qq.com

[基金項目]國家自然科學基金(81171034)

[收稿日期]2015- 06- 11[修回日期] 2015- 12- 23

[引文格式] 羅江輝，李文瑤，陶國才.烏司他丁對缺血再灌注大鼠腦保護及其機制研究[J].東南大學學報:醫(yī)學版，2016，35(2)：199- 201.

·論著·