青海漢、藏、蒙古族人群ACE基因插入/缺失(I/D)多態(tài)性與原發(fā)性高血壓關(guān)系※

任 明，楊永鑫，劉維軍，許 欣，趙瓊瓊，沈有錄

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院；2.青海省人民醫(yī)院 )

青海漢、藏、蒙古族人群ACE基因插入/缺失(I/D)多態(tài)性與原發(fā)性高血壓關(guān)系※

任 明1，楊永鑫2，劉維軍1，許 欣1，趙瓊瓊1，沈有錄1

(1.青海大學(xué)附屬醫(yī)院；2.青海省人民醫(yī)院 )

目的 討論青海地區(qū)漢、藏、蒙古族人群基因插入/缺失(I/D)多態(tài)性與原發(fā)性高血壓關(guān)系。方法 用聚合酶鏈反應(yīng)法(PCR)分別檢測(cè)漢、藏、蒙古族原發(fā)性高血壓(EH)患者及正常人群ACE基因的I/D多態(tài)性，分析計(jì)算DD、ID、II各基因型及等位基因的頻率、相關(guān)基因的OR值，并比較不同基因型間血壓水平，推斷各基因型與不同民族原發(fā)性高血壓的關(guān)系。結(jié)果 漢族、藏族、蒙古族高血壓患者DD、ID、II的三種基因型的頻率分別為52.4%、42.9%、4.8%；55.6%、35.4%、9.1%；17.2%、64.6%、18.2%，D、I兩種等位基因的頻率分別為73.8%、26.2%；73.5%、26.5%；49.5%、50.5%。漢族、藏族、蒙古族正常人群 DD、ID、II的三種基因型的頻率分別為46.9%、44.8%、8.3%；42.1%、36.8%、21.1%；15.6%、62.5%、21.9%；D、I兩種等位基因的頻率分別為69.2%、30.8%；60.3%、39.7%；47.2%、52.8%。對(duì)于藏族病例組和正常組，以II基因型為參照基因，DD、ID兩種基因型的OR值分別為3.237(95%CI=1.364～7.681)、2.359(95%CI=0.965～5.767)，以I等位基因?yàn)閷?duì)照，D等位基因的OR值為1.830(95%CI=1.209～2.770)。漢族及蒙古族人群中，三種不同基因型之間其收縮壓、舒張壓及平均血壓比較均無顯著性差異；而藏族人群卻有顯著性差異，且收縮壓、舒張壓及平均血壓水平均表現(xiàn)為II

漢族 藏族 蒙古族 原發(fā)性高血壓 ACE基因 多態(tài)性

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme，ACE)是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(rennin-angiotension system，RAS)的重要組成部分。ACE基因的表達(dá)決定ACE的濃度及活性，有研究表明，ACE基因16內(nèi)含子存在插入(I)或缺失(D)的基因多態(tài)性[1]，但其相關(guān)基因與高血壓是否相關(guān)，研究結(jié)果各異[2-5]。不同地區(qū)、不同人群ACE基因的變異不同，可能導(dǎo)致地區(qū)及種族差異。本研究運(yùn)用PCR技術(shù)，對(duì)青海漢、藏、蒙古族人群ACE基因插入/缺失(I/D)多態(tài)性與原發(fā)性高血壓關(guān)系進(jìn)行相關(guān)研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2013年10月至2014年10月海北剛察地區(qū)(海拔3260m)世居漢族高血壓患者105例、血壓正常者112例；藏族高血壓患者102例、血壓正常者107例；蒙古族高血壓患者104例，血壓正常者106例。漢族、藏族、蒙古族病例組及對(duì)照組間年齡、性別均無顯著性差異(P>0.05)。

入選依據(jù)《中國(guó)高血壓防治指南》(2010版)診斷標(biāo)準(zhǔn)，高血壓組的入選標(biāo)準(zhǔn)為靜息時(shí)收縮壓≥140 mmHg和/或舒張壓≥90 mmHg者，既往確診為高血壓的患者亦歸入研究組。

1.2 研究方法

清晨抽取符合條件者空腹肘靜脈血1.5 mL，加入真空采血管(內(nèi)含乙二胺四乙酸二鉀抗凝劑)標(biāo)記其民族，置于-80 ℃冰柜中保存。

1.2.1 DNA提取

(1)將真空抗凝管中全血DNA由-80 ℃冰柜轉(zhuǎn)移至-20 ℃冰柜(存放1h)，然后轉(zhuǎn)移至4 ℃冰柜(存放1h)，取出加入5 mL裂解液，用移液吸管、移液槍等反復(fù)吹打搖勻(加速血液融化及紅細(xì)胞裂解)，待其完全溶解混勻后轉(zhuǎn)移至15 mL EP管中。

(2)用天平配平，將EP管置于離心機(jī)離心(20℃，4000r/min)10 min，隨即取出倒掉上清液，并將EP管倒置于吸水紙上(2min)，吸干其內(nèi)部殘余液體。

(3)用移液槍向其內(nèi)加入GS緩沖液200 μL，反復(fù)混勻后轉(zhuǎn)移至1.5 mLEP管中。

(4)加入proteinase K 20 μL，并混勻。

(5)加入GB緩沖液200 μL，充分顛倒混勻，然后放置于56 ℃恒溫箱內(nèi)(10 min)，其間可反復(fù)吹打混勻和/或延長(zhǎng)保溫時(shí)間，直至其完全溶解、溶液變清亮為止(有可能溶液始終為褐色而不變清亮，此時(shí)只需將其溶解至無絮狀物即可)。

(6)加入無水乙醇200 μL，充分混勻(此時(shí)允許有絮狀沉淀物出現(xiàn))。

(7)將吸附柱CB3置于收集管中，并將溶液(和沉淀)對(duì)準(zhǔn)吸附柱CB3中心注入，放置于離心機(jī)中再離心(12000r/min)30 s，倒掉廢液后將吸附柱CB3重新置入收集管。

(8)對(duì)準(zhǔn)吸附柱中心注入GD緩沖液(用前必須按說明加入適量無水乙醇并充分混勻)500 μL，放置于離心機(jī)中再離心(12000r/min)30 s，倒掉廢液后將吸附柱CB3再次置入收集管。

(9)對(duì)準(zhǔn)吸附柱中心注入PW緩沖液(用前必須按說明加入無水乙醇并充分混勻)600 μL， 放置于離心機(jī)中再離心(12000r/min)30 s，倒掉廢液后仍將吸附柱CB3重新置入收集管。

(10)重復(fù)步驟9。

(11)將吸附柱及收集管放置于離心機(jī)中離心(12000r/min)120 s，倒掉廢液，去掉收集管，將吸附柱CB3置于吸水紙上常溫下放置5 min(便于漂洗液充分揮發(fā)干燥)。

(12)將吸附柱轉(zhuǎn)移至另外一只新的1.5 mL EP管中，對(duì)準(zhǔn)吸附膜中心懸空滴加TB緩沖液100 μL，于室溫下靜置5 min(以便于DNA充分被洗脫)后離心(12000r/min)120 s，并收集洗脫液。

(13)重復(fù)步驟12。

(14)將收集的洗脫液(洗脫液即為DNA溶液)置于-20 ℃冰柜保存(如若近期即用，也可置于4℃條件下保存，但需避免DNA反復(fù)凍融)。

1.2.2 DNA提取成功與否檢測(cè)

(1)取一支三角燒瓶，洗凈并向其內(nèi)注入電解液100 mL，加入膠粉1 g并充分混勻，入微波爐加熱直至清亮無絮狀物存在(其間可充分震蕩以加速膠粉溶解)，置于操作臺(tái)上加入EB液5 μL并充分混勻，溫度降至約70 ℃將溶液倒至膠板模子中(注意厚度)，充分冷卻直至膠板成型后置于電解槽，加電解液直至淹沒膠板。

(2)取10 μL marker置于膠板孔。

(3)取10 μL的DNA溶液，與2 μL的loadingbuffer充分混勻后，對(duì)準(zhǔn)膠板孔加樣。

(4)將電泳儀電壓調(diào)至120 V，一段時(shí)間(具體根據(jù)跑膠的位置決定)后將膠板置于紫外成像分析系統(tǒng)下觀察。

1.2.3 第一次PCR擴(kuò)增(本實(shí)驗(yàn)所用引物均由上海捷瑞公司合成)

(1) 取0.5 mL EP管一枚，加入ddH2O 8.5 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL、ACE-ID-F 1 μL、ACE-ID-R 1 μL、DNA 2 μL置于DNA擴(kuò)增儀中。

(2)反應(yīng)體系：預(yù)變性94 ℃ 180 s，變性93 ℃ 45 s，58 ℃下退火45 s，72 ℃下延伸60 s，最后延伸300 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)。

(3)將反應(yīng)產(chǎn)物充分冷卻，基因型檢測(cè)各步驟與1.2.2檢測(cè)DNA提取方法類似，注意對(duì)各樣品仔細(xì)編號(hào)，待走完一半以上時(shí)將膠板移至紫外成像系統(tǒng)下觀察。第一次擴(kuò)增條帶如圖1。

圖1 ACE基因第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Figure 1 Eletrophoregram of ACE gene PCR product at first time

1.2.4 基因型的判定

(1)電泳后將條帶所處的位置與DNA MARK進(jìn)行對(duì)照，即可直接判定基因型：只有一條190 bp片段的為缺失型純合子(即DD型)，只有一條490 bp片段的為插入型純合子(即II型)，有190 bp和490 bp兩條片段的為插入缺失型雜合子(即ID型)。

(2)由于在擴(kuò)增過程中D等位基因有被優(yōu)先擴(kuò)增的可能(D擴(kuò)增片段比I短287bp所致)，故ID型可能被誤判為DD型，故對(duì)于第一次判定為DD型的需再次進(jìn)行第二次擴(kuò)增。第二次擴(kuò)增時(shí)基因型的判定原則：有一條335 bp片段的為ID型，無擴(kuò)增產(chǎn)物的為DD型。

1.2.5 第二次PCR擴(kuò)增

(1)挑選出第一次擴(kuò)增顯示為DD型的DNA。

(2)取0.5 mL EP管一枚，加入ddH2O 8.5 μL、2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL、ACE-D-F 1 μL、ACE-D-R 1 μL、DNA 2 μL 置于DNA擴(kuò)增儀中。

(3)反應(yīng)體系：預(yù)變性94 ℃ 180 s，變性94 ℃ 45 s，78 ℃下退火 60 s，72 ℃下延伸 60 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)。

(4)將反應(yīng)產(chǎn)物充分冷卻，基因型檢測(cè)各步驟與1.2.2檢測(cè)DNA提取成功與否的方法類似，注意對(duì)各樣品仔細(xì)編號(hào)，待走完一半以上時(shí)將膠板移至紫外成像系統(tǒng)下觀察。

(5)第二次擴(kuò)增條帶如圖2。

圖2 ACE基因第二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

Figure 2 Eletrophoregram of ACE gene PCR product at second time

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)管理和分析采用SPSS 13. 0統(tǒng)計(jì)軟件。由各基因型頻率計(jì)算出各等位基因頻率、計(jì)算出各基因型的期望數(shù)，驗(yàn)證其是否符合Hardy-weinberg(哈迪-溫伯格)遺傳平衡。病例組與對(duì)照組之間ACE基因等位基因和基因型的頻數(shù)分布差異比較采用卡方檢驗(yàn)，并計(jì)算相關(guān)基因OR值。各組血壓水平的比較用方差分析，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 遺傳平衡檢驗(yàn)

漢族、藏族、蒙古族病例組、對(duì)照組DD、DI、II各基因型實(shí)際數(shù)與期望數(shù)比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，符合Hardy-weinberg遺傳平衡定律，說明本實(shí)驗(yàn)樣本具有群體代表性。見表1。

表1 漢、藏、蒙古族ACE基因適合性檢驗(yàn)表

Table 1 Suitability test of ACE gene in Han，Tibetan and Mongolian nationalities

2.2 各基因型、等位基因頻率分布及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

漢族、藏族、蒙古族正常人群 DD、ID、II的三種基因型的頻率之間有顯著性差異(χ2=32.820，P=0.000)。漢族、藏族、蒙古族HP人群DD、ID、II的三種基因型的頻率有顯著性差異(χ2=41.944，P=0.000)。漢族、蒙古族病例組與對(duì)照組之間DD、ID、II基因型頻率分布對(duì)比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.810，0.398；P=0.405，0.820)，其病例組與對(duì)照組D、I兩種等位基因頻率分布也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.927，0.232；P=0.336，0.630)。藏族病例組與對(duì)照組DD、ID、II三種基因型頻率分布對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.541，P=0.023)，其病例組與對(duì)照組D、I兩種等位基因頻率分布對(duì)比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.260，P=0.004)。見表2。

表2 漢、藏、蒙古族基因頻數(shù)及等位基因頻數(shù)比較表(%)

※：與藏族病例組比較，P<0.05；Δ：與藏族對(duì)照組比較，P<0.05.

2.3 各組間血壓水平比較

漢族、蒙古族人群DD、ID、II三種基因型間收縮壓、舒張壓及平均血壓沒有顯著性差異。藏族人群DD、ID、II三種基因型間比較其收縮壓、舒張壓及平均血壓均有顯著性差異。對(duì)藏族人群DD組、ID組、II組之間進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，不論對(duì)于收縮壓、舒張壓還是平均血壓，DD組與ID組及II組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且ID組與II組比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

Table 3 Comparison of the systolic blood pressure，diastolic blood pressure and mean blood pressure in Han，Tibetan and Mongolian nationalities

※：與同民族DD型基因比較，P<0.05；◇：與同民族ID型基因比較，P<0.05.

3 討論

本研究顯示，青海地區(qū)漢、藏、蒙古族間DD、ID、II三種基因型分布具有明顯的種族差異(P<0.05)，I、D兩種等位基因頻率分布也存在種族差異(P<0.05)。分別對(duì)漢、藏、蒙古三族病例組與對(duì)照組進(jìn)行比較，僅藏族病例組與對(duì)照組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.541，P=0.023)，表明ACE基因I/D多態(tài)性可能為藏族原發(fā)性高血壓患者的致病基因，而不是漢、蒙古兩族原發(fā)性高血壓患者的致病基因。藏族病例組和對(duì)照組 DD、ID、II的三種基因型的頻率分別為55.6%、35.4%、9.1%；42.1%、36.8%、21.1%，病例組和對(duì)照組 D、I兩種等位基因的頻率分別為73.5%、26.5%；60.3%、39.7%，以II基因型為參照基因，DD、ID兩種基因型的OR值為3.237(95%CI=1.364～7.681)、2.359(95%CI=0.965～5.767)，以I等位基因?yàn)閷?duì)照，D等位基因的OR值為1.830(95%CI=1.209～2.770)，表明攜帶D等位基因可能增加青海藏族人群患高血壓的危險(xiǎn)。對(duì)不同基因型間的血壓水平進(jìn)行比較，對(duì)于漢族人群和蒙古族人群其PSBP、PDBP、PMBP均大于0.05，這說明對(duì)于漢族和蒙古族DD、ID、II三種基因型間比較，收縮壓、舒張壓及平均血壓沒有顯著性差異。而對(duì)于藏族人群，F(xiàn)SBP=17.721、FDBP=20.099、FMBP=35.898，PSBP=0.000、PDBP=0.000、PMBP=0.000，這說明藏族人群DD、ID、II三種基因型間比較其收縮壓、舒張壓及平均血壓均有顯著性差異，提示ACE基因三種基因型與藏族人群收縮壓、舒張壓及平均血壓升高有關(guān)。對(duì)藏族人群DD組、ID組、II組之間血壓進(jìn)行兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，不論對(duì)于收縮壓、舒張壓還是平均血壓，DD組與ID組及II組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且ID組與II組比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，收縮壓、舒張壓及平均血壓水平呈II

綜上所述，ACE基因I/D多態(tài)性可能與青海藏族原發(fā)性高血壓發(fā)病有關(guān)，而與漢族、蒙古族無關(guān)，對(duì)于藏族人群，隨著D等位基因頻率的增加，其血壓水平也逐步增高，易患高血壓。

本研究?jī)H從基因頻率及血壓水平的角度討論ACE基因與原發(fā)性高血壓的關(guān)系，未考慮性別、環(huán)境交互作用及基因連鎖反應(yīng)等，結(jié)果與某些已有的結(jié)論不符[8]，尚需加大樣本量，并充分考慮以上因素，進(jìn)一步探討青海地區(qū)ACE基因與少數(shù)民族原發(fā)性高血壓之間的關(guān)系。

[1]Rigat B，Hubert C，Alhenc-Gelas F，et a1．An insertion/deletion Polymorphism in the angiotension I-converting enzyme gene accounting for half the variance of serum enzyme levels[J].Clin Invest，1990，86：1343-6.

[2]Randhawa NK，Kumar A，Matharaoo K，et a1．Association studies of angiotensin converting enzyme gene insertion/deletion polymorphism with hypertension in Punjabi population[J].Int Hum J Genet，2006，6：317-21.

[3]Mondry A，Loh M，Lihu P，el a1．Polymorphism of the insertion/deletion ACE and M235T AGT genes and hypertension surprising new findings and meta analysis of data[J]．BMC Nephrology，2005，6：1.

[4]Camci L，Kilic Z，Dinleyici EC，et al．Angiotensin-converting enzyme gene insertion/deletion polymorphism frequency in or-motensive children with a positive family history of essential hypertension[J]．J Paediatr Child Health，2009，45(12)：742-6.

[5]Amachandran V，Ismail P，Stanslas J，et al．Asaoeiatlon of insertim/deletion Polymorphism of angiotensin-converting enzyme gene with essential hypertension and type2 diabetes mellitus in Malaysian subjects[J]．J Renin Angiotensin Aldosterone Syst，2008，9(4)：208-14.

[6]Harden P N．Geddes C，Rowe P A，et a1．Polymorphisms in angiotensin-converting enzyme gene and progression of lgA nephropothy[J]．Lancet，1995，345(8964)：1540-2．

[7]Hunley T E，Julian B A，Phillips J A，et a1．Angiotensin converting enzyme gene polymorphism：Potential slilencer motif and impact on progression in IgA nephropathy[J]．Kidney Int，1996，49(2)：571-7．

[8]Ji LD，zhang LN，Shen P，et a1．Association genene M235T and angiotension-converting enzyme gene I/D polymorphisms with essential hypertension in Han Chinese population：a meta-analysis[J]．J Hypertens，2010，28(3)：419-28.

Relationship between ACE gene insertion / deletion(I/D)polymorphism and essential hypertension in Han，Tibetan and Mongolian nationalities at Qing Hai region

Ren Ming1，Yang Yongxin2，Liu Weijun1，Xu Xin1，Zhao Qiongqiong1，Shen Youlu1

(1.Affiliated Hospital of Qinghai University；2.Qinghai Provincial People’s Hospital)

Objective To discuses the association between the insertion/deletion(I/ D)polymorphism of the angiotensin converting enzyme(ACE)gene and essential hypertension(EH)in Han，Tibetan and Mongol population of QingHai province.Method The variant of ACE gene I/D in both the EH and normotensive controls in different populations were detected by polymerase chain reaction(PCR).The genotypes frequency and allele frequency were determined and the odd ratios(OR) were calculated.Additionally，the levels of blood pressure among different genotypes were analyzed.Results In Han，Tibetan and Mongolian EH groups，the frequencies of DD，ID and II genotypes were52.4%，42.9%，4.8% vs 55.6%，35.4%，9.1%vs17.2%，64.6%，18.2%，respectively.The frequencies of I，D alleles were 73.8%，26.2%vs73.5%，26.5%vs49.5%，50.5%，respectively.In Han，Tibetan and Mongolian normotensive control groups，the frequencies of DD，ID and II genotypes were46.9%，44.8%，8.3% vs 42.1%，36.8%，21.1%vs15.6%，62.5%，21.9%，respectively. the frequencies of I，D alleles were69.2%，30.8% vs 60.3%，39.7%vs47.2%，52.8%，In Tibetan EH and control groups，when using II as reference，the OR for DD，ID were 3.237(95%CI=1.364～7.681)，2.359(95%CI=0.965～5.767)，respectively.While using I as reference，the OR of D was 1.830(95%CI=1.209～2.770).For the blood pressure of different genotypes of Han，Tibetan and Mongolian，there were no difference in Han and Mongolians，but a significant difference of SBP，DBP and MBP in II，ID and DD genotypes in Tibetans.the Tibetan with ID genotype showed a higher blood pressure than that with II genotype，but the DD ones were higher than both of them.Conclusion There are a significant difference in I/D polymorphism of ACE gene among Han，Tibetan and Mongolian；The I/D polymorphism of ACE gene may be a pathogenic gene in Tibetan patients with essential hypertension，perhaps D allele may increase the risk of hypertension in Tibetan.

Han Tibetan Mongolian Essential Hypertension Angiotensin converting enzyme(ACE) Gene polymorphism

※：2013年度青海大學(xué)中青年科研基金項(xiàng)目 (項(xiàng)目編號(hào)2013-QYY-6) 任明(1973～)，女，漢族，山東籍，主任醫(yī)師，教授，碩士研究生導(dǎo)師

R544.1

A

10.13452/j.cnki.jqmc.2016.02.009

2016-01-03