膜片鉗技術簡述

管一世

(成都體育學院 四川 成都 610041)

膜片鉗技術簡述

管一世

(成都體育學院 四川 成都 610041)

80年代初發(fā)展起來的膜片鉗技術(patchclamptechnique)為了解生物膜離子單通道的門控動力學特征及通透性、選擇性膜信息提供了最直接的手段。該技術的興起與應用，使人們不僅對生物體的電現象和其他生命現象更進一步的了解，而且對于疾病和藥物作用的認識也不斷的更新，同時還形成了許多病因學與藥理學方面的新觀點。

膜片鉗;細胞;膜電位;膜片構型;通道

一、 膜片鉗技術的基本原理

用一個尖端直徑在1.5～3.0μm的玻璃微電極接觸細胞膜表面，通過負壓吸引使電極尖端與細胞膜之間形成千兆歐姆以上的阻抗封接，此時電極尖端下的細胞膜小區(qū)域(膜片，patch)與其周圍在電學上分隔，在此基礎上固定(鉗制，Clamp)電位，對此膜片上的離子通道的離子電流進行監(jiān)測及記錄。

基本的儀器設備有膜片鉗放大器、計算機、倒置顯微鏡、示波器、雙步電極拉制器、三軸液壓顯微操縱器、屏蔽防震實驗臺、恒溫標本灌流槽、玻璃電極研磨器、膜片鉗放大器是離子單通道測定和全細胞記錄的關鍵設備，具有高靈敏度、高增益、低噪音及高輸入阻抗。膜片鉗放大器是通過單根電極對細胞或膜片進行鉗制的同時記錄離子流經通道所產生的電流。膜片鉗放大器的核心部分是以運算放大器和反饋電阻構成的電流-電壓(I-V)轉換器，運算放大器作為電壓控制器自動控制，使鉗制電位穩(wěn)定在一定的水平上。

二、 膜片鉗技術的幾種記錄形式

細胞吸附膜片(cell-attachedpatch) 將兩次拉制后經加熱拋光的微管電極置于清潔的細胞膜表面上，形成高阻封接，在細胞膜表面隔離出一小片膜，既而通過微管電極對膜片進行電壓鉗制，高分辨測量膜電流，稱為細胞貼附膜片。由于不破壞細胞的完整性，這種方式又稱為細胞膜上的膜片記錄。此時跨膜電位由玻管固定電位和細胞電位決定。因此，為測定膜片兩側的電位，需測定細胞膜電位并從該電位減去玻管電位。從膜片的通道活動看，這種形式的膜片是極穩(wěn)定的，因細胞骨架及有關代謝過程是完整的，所受的干擾小。

內面向外膜片(inside-outpatch) 高阻封接形成后，在將微管電極輕輕提起，使其與細胞分離，電極端形成密封小泡，在空氣中短暫暴露幾秒鐘后，小泡破裂再回到溶液中就得到“內面向外”膜片。此時膜片兩側的膜電位由固定電位和電壓脈沖控制。浴槽電位是地電位，膜電位等于玻管電位的負值。如放大器的電流監(jiān)視器輸出是非反向的，則輸出將與膜電流(Im)的負值相等。

外面向外膜片(out-sidepatch) 高阻封接形成后，繼續(xù)以負壓抽吸，膜片破裂再將玻管慢慢地從細胞表面垂直地提起，斷端游離部分自行融合成脂質雙層，此時高阻封接仍然存在。而膜外側面接觸浴槽液。這種膜片形式應測膜片電阻，并消除漏電流和電容電流。整個過程要當心是否形成囊泡。如果浴槽保持地電位水平，膜電位即與玻管電位相等。如放大器是非反向的，放大器的輸出將與Im值相等。

全細胞記錄構型(whole-cellrecording) 高阻封接形成后，繼續(xù)以負壓抽吸使電極管內細胞膜破裂，電極胞內液直接相通，而與浴槽液絕緣，這種形式稱為“全細胞”記錄。它既可記錄膜電位又可記錄膜電流。其中膜電位可在電流鉗情況下記錄，或將玻管連到標準高阻微電極放大器上記錄。在電壓鉗條件下記錄到的大細胞全細胞電流可達nA級，全細胞鉗的串聯電阻(玻管和細胞內部之間的電阻)應當補償。任何流經膜的電流均流經這一電阻，所引起的電壓降將使玻管電壓不同于細胞內的真正電位。電流愈大，愈需對串聯電阻進行補償。全細胞鉗應注意細胞必需合理的小到其電流能被放大器測到的范圍(25～50nA)。減少串聯電阻的方法是玻管尖要比單通道記錄大。

三、 膜片鉗技術的應用

1、膜片鉗在通道研究中的作用

用膜片鉗技術可以直接觀察和分辨單離子通道電流及其開閉時程、區(qū)分離子通道的離子選擇性、同時可發(fā)現新的離子通道及亞型，并能在記錄單細胞電流和全細胞電流的基礎上進一步計算出細胞膜上的通道數和開放概率，還可以用以研究某些胞內或胞外物質對離子通道開閉及通道電流的影響等。同時用于研究細胞信號的跨膜轉導和細胞分泌機制。結合分子克隆和定點突變技術，膜片鉗技術可用于離子通道分子結構與生物學功能關系的研究。

2、與藥物有關的心肌離子通道

心肌細胞通過各種離子通道對膜電位和動作電位穩(wěn)態(tài)的維持而保持正常的功能。近年來，國外學者在人類心肌細胞離子通道特性的研究中取得了許多進展，使得心肌藥理學實驗由動物細胞模型向人心肌細胞成為可能。

3、對離子通道生理與病理情況下作用機制的研究

通過對各種生理或病理情況下細胞膜某種離子通道特性的研究，了解該離子的生理意義及其在疾病過程中的作用機制。如對鈣離子在腦缺血神經細胞損害中作用機制的研究表明，缺血性腦損害過程中，Ca2+ 介導現象起非常重要的作用，缺血缺氧使Ca2+通道開放，過多的Ca2+進入細胞內就出現Ca2+超載，導致神經元及細胞膜損害，膜轉運功能障礙，嚴重的可使神經元壞死。

4、對單細胞形態(tài)與功能關系的研究

將膜片鉗技術與單細胞逆轉錄多聚酶鏈是反應技術結合，在全細胞膜片鉗記錄下，將單細胞內容物或整個細胞(包括細胞膜)吸入電極中，將細胞內存在的各種mRNA全部快速逆轉錄成cDNA，再經常規(guī)PCR擴增及待檢的特異mRNA的檢測，借此可對形態(tài)相似而電活動不同的結果做出分子水平的解釋或為單細胞逆轉錄多聚酶鏈式反應提供標本，為同一結構中形態(tài)非常相似但功能不同的事實提供分子水平的解釋。目前國際上掌握此技術的實驗室較少，我國北京大學神經科學研究所于1994年在國內率先開展。

[1]馬二寶 楊占成 龔團蓮 高原 唐忠有 李樹光 《內蒙古民族大學學報：自然科學版》 2006 第6期

[2]李鵬云 曾曉榮 楊艷 蔡芳 《四川生理科學雜志》 2006 第2期

[3]劉振偉 李立君 劉傳繢 ：海馬腦片盲法膜片鉗全細胞記錄技術

[4]康華光 《中國醫(yī)療器械雜志》 2000 第3期：細胞電生理與膜片鉗技術

[5]尹曉明 賈莉君 范曉榮 沈其榮： 離子選擇微電極技術及其在植物營養(yǎng)學中的應用

管一世(1992.03-)，男，漢族，吉林，碩士研究生在讀，成都體育學院，研究方向：運動訓練足球。