circRNA的研究進(jìn)展及其法醫(yī)學(xué)意義

張雅琪，邵誠(chéng)臣，李成濤，2，趙子琴，謝建輝（.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系，上海200032；2.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200063）

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circRNA的研究進(jìn)展及其法醫(yī)學(xué)意義

張雅琪1，邵誠(chéng)臣1，李成濤1，2，趙子琴1，謝建輝1
（1.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)系，上海200032；2.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200063）

摘要：RNA在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中越來(lái)越受到重視，發(fā)展以RNA為基礎(chǔ)的新生物標(biāo)記在復(fù)雜案例分析中具有重要的意義。環(huán)形RNA（circular RNA，circRNA）是最近被廣泛報(bào)道的一類(lèi)非編碼RNA，雖然其生成和表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚未完全清楚，但現(xiàn)有的研究表明circRNA具有重要的生物學(xué)功能。circRNA具有細(xì)胞表達(dá)特異性，穩(wěn)定性好且表達(dá)豐富等特點(diǎn)，使其在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有潛在意義。本文對(duì)circRNA的研究歷程及生成調(diào)節(jié)機(jī)制、生物學(xué)屬性及其生物學(xué)功能進(jìn)行總結(jié)，希望能為相關(guān)研究和法醫(yī)學(xué)應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：法醫(yī)遺傳學(xué)；環(huán)形RNA；綜述［文獻(xiàn)類(lèi)型］

組織細(xì)胞中含多種結(jié)構(gòu)功能不同的RNA，如轉(zhuǎn)移RNA（transfer RNA，tRNA）、信使RNA（messenger RNA，mRNA）、核糖體RNA（ribosomal RNA，rRNA）等。隨著人們對(duì)RNA認(rèn)識(shí)的深入，更多種類(lèi)的RNA被發(fā)現(xiàn)，如微小RNA（microRNA，miRNA）、長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non－coding RNA，lncRNA）等。最近，環(huán)形RNA（circular RNA，circRNA）被廣泛地報(bào)道［1］。在真核細(xì)胞中，根據(jù)circRNA的序列構(gòu)成主要可分為外顯子來(lái)源的circRNA、內(nèi)含子來(lái)源的circRNA以及由外顯子和內(nèi)含子共同組成的circRNA三類(lèi)，其中后兩類(lèi)circRNA目前研究較少［2］。本文對(duì)circRNA的研究現(xiàn)狀進(jìn)行總結(jié)，希望能為相關(guān)研究和應(yīng)用提供參考。

1　概　述

1.1circRNA的發(fā)現(xiàn)和鑒定

circRNA是在mRNA前體（pre－mRNA）剪切過(guò)程中，外顯子的5′端與3′端以反向剪切（backsplicing）形式形成3′，5′磷脂鍵連接的circRNA［3］。早在1991年，Nigro等［4］報(bào)道了一個(gè)腫瘤抑制候選基因DCC的轉(zhuǎn)錄子中含有亂序轉(zhuǎn)錄子（scrambled transcript）。隨后，其他基因，如ETS－1、SRY等，也被發(fā)現(xiàn)存在類(lèi)似的現(xiàn)象［5－6］。由于檢測(cè)技術(shù)的限制，只有少量基因的circRNA被報(bào)道。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，特別是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA－seq）及其分析技術(shù)的發(fā)展，細(xì)胞內(nèi)大量的circRNA被發(fā)現(xiàn)。

由于circRNA缺少polyA尾，基于polyA的反轉(zhuǎn)錄策略能夠?qū)е耤ircRNA轉(zhuǎn)錄子的丟失，因此對(duì)circRNA的檢測(cè)通常采用隨機(jī)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，circRNA的5′端與3′端形成融合片段，因此可以利用這一特點(diǎn)進(jìn)行分析。目前，對(duì)circRNA的檢測(cè)主要有三種策略：（1）對(duì)全轉(zhuǎn)錄子測(cè)序后通過(guò)生物學(xué)信息分析circRNA；（2）去除含polyA的轉(zhuǎn)錄子后，進(jìn)行測(cè)序并通過(guò)生物學(xué)信息分析circRNA；（3）RNase R酶去除線(xiàn)性RNA后進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)生物學(xué)信息分析circRNA，這主要依賴(lài)于circRNA對(duì)RNase R酶不敏感。

由于circRNA的5′端與3′端形成融合片段，能夠利用向外型引物檢測(cè)circRNA，向外型引物只能擴(kuò)增circRNA的cDNA，不能擴(kuò)增線(xiàn)性mRNA的cDNA。同時(shí)，RNase R酶能夠降解線(xiàn)性mRNA，而不能降解環(huán)狀結(jié)構(gòu)的circRNA，因此也能夠使用RNase R酶消化線(xiàn)性mRNA后，使用向內(nèi)型引物檢測(cè)circRNA。

1.2circRNA的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)機(jī)制

circRNA是一類(lèi)非編碼RNA，廣泛存在于哺乳動(dòng)物的各種不同類(lèi)型的細(xì)胞中，但circRNA的生成機(jī)制和表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不完全清楚［3］。很長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)，circRNA被認(rèn)為是pre－mRNA加工過(guò)程中選擇性剪接產(chǎn)生的副產(chǎn)物。然而，僅很少的circRNA外顯子被發(fā)現(xiàn)是選擇性剪接過(guò)程中產(chǎn)生的外顯子［2］。最近研究［7］發(fā)現(xiàn)，circRNA不是mRNA成熟過(guò)程中的副產(chǎn)物，而與mRNA一樣，是pre－mRNA加工后的一個(gè)重要產(chǎn)物，并且生成circRNA的加工機(jī)制能與生成mRNA的加工機(jī)制形成競(jìng)爭(zhēng)。同時(shí)，經(jīng)典的剪切信號(hào)和剪切機(jī)制對(duì)于反向剪切來(lái)說(shuō)也是必需的［8］。

在circRNA的生成過(guò)程中，外顯子兩側(cè)的內(nèi)含子內(nèi)的反向互補(bǔ)序列可以促進(jìn)外顯子環(huán)化，如外顯子兩側(cè)的反向互補(bǔ)的Alu元件［9－10］。一些蛋白質(zhì)分子也在circRNA的產(chǎn)生過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。盲肌基因（muscleblind－like，MBNL）能夠與內(nèi)含子上的muscleblind結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，當(dāng)MBNL的表達(dá)水平升高時(shí)，能夠促進(jìn)circRNA的生成［7］。另外一個(gè)RNA編輯酶ADAR1也被表明參與circRNA的生成，沉默ADAR1的表達(dá)能夠上調(diào)circRNA的表達(dá)［11］。最近，Conn等［12］發(fā)現(xiàn)顫抖基因（quaking，QKI）也能夠調(diào)節(jié)circRNA的表達(dá)，QKI可結(jié)合外顯子的側(cè)翼序列，促進(jìn)circRNA的生成；同時(shí)，外顯子的側(cè)翼序列插入QKI結(jié)合位點(diǎn)可導(dǎo)致外顯子的環(huán)化。這些蛋白質(zhì)分子都具有與內(nèi)含子內(nèi)特異序列結(jié)合的特性，其他能與內(nèi)含子內(nèi)序列特異結(jié)合的蛋白質(zhì)分子是否參與circRNA的生成仍有待進(jìn)一步研究。

1.3circRNA的功能

目前，對(duì)circRNA功能的研究較少，現(xiàn)有的研究表明，circRNA具有miRNA分子海綿、調(diào)控基因表達(dá)等功能，并與細(xì)胞功能和疾病具有密切作用。

少數(shù)circRNA富含miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，能夠發(fā)揮miRNA分子海綿的作用，從而阻斷或降低miRNA對(duì)靶基因的抑制作用［13－14］。CDR1as長(zhǎng)約1.5 kb，含有74個(gè)miR－7的結(jié)合位點(diǎn)，其中超過(guò)60個(gè)位點(diǎn)是保守的，因而CDR1as也被稱(chēng)為ciRS－7。SRY基因的circRNA長(zhǎng)約1.2kb，含有16個(gè)miRNA－138的結(jié)合位點(diǎn)，能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA－138，從而抑制miRNA－138的功能。然而，其他具有miRNA分子海綿的circRNA仍有待進(jìn)一步研究。

部分circRNA的生成能夠降低基因的mRNA表達(dá)水平。FMN基因在表達(dá)時(shí)能夠生成一個(gè)含有翻譯起始位點(diǎn)（ATG）的circRNA，當(dāng)改變FMN基因序列抑制circRNA生成時(shí)，小鼠表現(xiàn)出腎發(fā)育不全的表型［15］。這類(lèi)circRNA在生成時(shí)產(chǎn)生一個(gè)翻譯起始位點(diǎn)缺失的線(xiàn)性mRNA，導(dǎo)致mRNA翻譯失敗，從而降低了蛋白質(zhì)水平。當(dāng)抑制這類(lèi)circRNA形成時(shí)，能夠升高基因的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，從而可能導(dǎo)致表型的異常。事實(shí)上，線(xiàn)性mRNA缺失circRNA含有的外顯子也可能導(dǎo)致編碼序列移位或蛋白質(zhì)缺少重要的結(jié)構(gòu)，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平或功能。

circRNA表達(dá)與細(xì)胞功能和疾病發(fā)展進(jìn)程存在密切關(guān)系，如神經(jīng)元活動(dòng)、動(dòng)脈粥樣硬化等［16－19］。神經(jīng)元內(nèi)的circRNA主要位于突觸中，在突觸形成過(guò)程中，大量circRNA的表達(dá)水平在不斷改變［16］。同時(shí)，在神經(jīng)元活動(dòng)時(shí)，circRNA的表達(dá)水平也在不斷地調(diào)整。然而，circRNA在神經(jīng)元功能調(diào)節(jié)中的功能和機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。有研究［17］報(bào)道，ciRS－7在阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）中表達(dá)水平降低，可能導(dǎo)致miRNA－7表達(dá)水平升高而降低miRNA－7靶基因的表達(dá)。此外，位于染色體區(qū)域9p21.3內(nèi)的rs10757278位點(diǎn)與INK4/ARF表達(dá)和動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)具有明顯的相關(guān)性，同時(shí)也與長(zhǎng)鏈非編碼ANRIL基因的circRNA（cANRIL）表達(dá)水平相關(guān)［18］。G/G基因型一般具有高cANRIL表達(dá)和低INK4/ARF表達(dá)，同時(shí)具有增高的動(dòng)脈粥樣硬化風(fēng)險(xiǎn)。最近，Li等［19］發(fā)現(xiàn)胃癌中Has_circ_002059表達(dá)明顯下調(diào)，低表達(dá)的Has_circ_002059與胃癌的轉(zhuǎn)移、TNM分期等明顯相關(guān)，可能是胃癌診斷的一個(gè)潛在生物標(biāo)記。

2　circRNA的屬性及法醫(yī)學(xué)意義

circRNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)非常豐富，含一個(gè)外顯子或多個(gè)外顯子，長(zhǎng)度可以從100nt到4 kb［3］。circRNA主要定位于胞質(zhì)中，這也與mRNA的定位類(lèi)似，而不同于內(nèi)含子來(lái)源的circRNA主要定位于細(xì)胞核內(nèi)［10］。人類(lèi)各種不同類(lèi)型的細(xì)胞中都含有大量的circRNA，大部分基因的circRNA表達(dá)水平超過(guò)mRNA的10%，部分基因的circRNA表達(dá)水平甚至比mRNA高10倍以上［2］。circRNA的表達(dá)具有組織細(xì)胞特異性，不同類(lèi)型細(xì)胞的circRNA表達(dá)譜不同［20］。由于circRNA具有組織細(xì)胞表達(dá)特異性，被認(rèn)為是一種重要的調(diào)節(jié)分子。部分circRNA在物種間也有相對(duì)的保守性，如小鼠睪丸中的69種circRNA在人細(xì)胞中也存在［10］。同時(shí)，由于circRNA具有封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)，能夠耐受核酸外切酶的水解，因此具有良好的穩(wěn)定性，在細(xì)胞內(nèi)比mRNA具有更長(zhǎng)的半衰期［13］。

上述屬性使得circRNA在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域成為一類(lèi)非常理想的候選生物標(biāo)記分子。由于circRNA的穩(wěn)定性和組織表達(dá)特異性，可以用于不同體液的鑒定，特別是對(duì)于陳舊的或降解的生物檢材檢測(cè)可能更具有優(yōu)越性。在死亡時(shí)間推斷中，circRNA的穩(wěn)定性可能使其成為一種良好的分子內(nèi)標(biāo)，也可以通過(guò)circRNA的降解研究circRNA水平與死亡時(shí)間的關(guān)系。

3　研究展望

隨著新一代高通量測(cè)序技術(shù)和生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，circRNA在不同組織細(xì)胞中的表達(dá)譜及組織特異性表達(dá)將進(jìn)一步被揭示。隨著研究的深入，circRNA的功能也將進(jìn)一步被闡明。circRNA生成和表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制將是circRNA研究的一個(gè)重點(diǎn)，以circRNA為基礎(chǔ)的診斷和靶向治療也將成為可能。重要的是，對(duì)于circRNA目前仍缺少統(tǒng)一命名的規(guī)則，新的命名規(guī)則，如使用circ加上基因名命名該基因的circRNA（如circDCC、circEST－1等），可以促進(jìn)對(duì)circRNA的理解和更好地分類(lèi)。circRNA的穩(wěn)定性和組織（細(xì)胞）表達(dá)特異性等屬性，在法醫(yī)學(xué)上具有重要意義，將進(jìn)一步促進(jìn)法醫(yī)學(xué)應(yīng)用的發(fā)展。目前，對(duì)circRNA的研究還處于初始階段，隨著對(duì)circRNA研究的深入，circRNA將作為新的一類(lèi)非編碼RNA進(jìn)一步揭開(kāi)生命的奧秘。

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（本文編輯：李成濤）

·經(jīng)驗(yàn)交流·

Research Progress of circRNA and Its Significance in Forensic Science

ZHANG Ya－qi1，SHAO Cheng－chen1，LI Cheng－tao1，2，ZHAO Zi－qin1，XIE Jian－h(huán)ui1
（1.Department of Forensic Medicine，School of Basic Medical Sciences，F(xiàn)udan University，Shanghai 200032，China；2.Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine，Institute of Forensic Science，Ministry of Justice，P.R.China，Shanghai 200063，China）

Abstract：RNA has received more attention in the field of forensic medicine and the development of the new biological markers based on RNA shows great significance in the analysis of complex cases. circular RNA（circRNA）is a kind of non－coding RNA which is w idely reported recently.Although the regulatory mechanisms of generation and expression are not fully clear，the existing research indicates that circRNA has important biological functions.CircRNA has a cell－type－specific expression w ith great stability and a high expression level，which makes it meaningful in forensic applications potentially.In this paper，the research progress，the generation and regulation of circRNA as well as its biological characteristics and functions are summarized，which w ill provide references for related studies and forensic applications.

Key words：forensic genetics；circRNA；review［publication type］

收稿日期：（2015－04－24）

通信作者：謝建輝，男，博士，副教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)研究；E－mail：jhxie＠fudan.edu.cn

作者簡(jiǎn)介：張雅琪（1989—），女，主要從事法醫(yī)遺傳學(xué)研究；E－mail：14211010071＠fudan.edu.cn

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81222041、81571853）

文章編號(hào)：1004－5619（2016）02－0131－03

中圖分類(lèi)號(hào)：DF795.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

doi：10.3969/j.issn.1004－5619.2016.02.013