基于魯米諾修飾AuAg@MnO2納米復(fù)合材料構(gòu)建的β淀粉樣蛋白電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的研究

王靖茜，朱阿敏，袁 若，柴雅琴

（重慶市現(xiàn)代分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

基于魯米諾修飾AuAg@MnO2納米復(fù)合材料構(gòu)建的β淀粉樣蛋白電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的研究

王靖茜，朱阿敏，袁 若*，柴雅琴*

（重慶市現(xiàn)代分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，重慶400715）

該文以電致化學(xué)發(fā)光（ECL）物質(zhì)魯米諾作為還原劑制備了魯米諾功能化的金銀納米顆粒（Lum-AuAgNPs），并將其成功固載到二氧化錳納米顆粒（MnO2NPs）的表面，制備了一種新的納米復(fù)合材料Lum-AuAg@MnO2。該復(fù)合材料具有較低的生物毒性，極大的比表面積和良好的電催化能力，可以用作蛋白質(zhì)的納米載體構(gòu)建生物傳感器。文中以該材料為二抗（Ab2）載體制備了一個(gè)能夠高靈敏檢測(cè)阿茲海默癥標(biāo)志物β淀粉樣蛋白（Aβ）的夾心型ECL免疫傳感器。由于Lum-AuAg@MnO2具有良好的導(dǎo)電性和過氧化氫催化活性，能夠有效提高luminol-H2O2體系的電化學(xué)發(fā)光效率，進(jìn)而檢測(cè)到較強(qiáng)的ECL信號(hào)。實(shí)驗(yàn)表明，該傳感器在β淀粉樣蛋白抗原的測(cè)定上有良好的線性關(guān)系，線性范圍為100 ng/mL～1 pg/mL，最低檢測(cè)限為0.33 pg/mL。該傳感器對(duì)Aβ的檢測(cè)具有靈敏度高、檢測(cè)范圍寬、制作簡(jiǎn)便、成本低的優(yōu)點(diǎn)，并且具有良好的選擇性和重現(xiàn)性。

電致化學(xué)發(fā)光；β淀粉樣蛋白（Aβ）；魯米諾；免疫傳感器

0 引言

免疫是人體的一種生理功能，它能夠?qū)M(jìn)入人體的異物進(jìn)行有效的識(shí)別，通過人體產(chǎn)生的抗體（antibody）對(duì)有害異物進(jìn)行排斥和破壞，以此維持人體的健康。這類能夠引起免疫反應(yīng)的異物被稱為抗原（antigen），通常能與之對(duì)應(yīng)的抗體特異性地結(jié)合在一起。正是基于生物體內(nèi)抗原與抗體之間的特異識(shí)別功能，Henry等[1]提出了免疫傳感器（immunosensor）的概念，免疫傳感器結(jié)合了高靈敏的傳感換能技術(shù)與特異性免疫反應(yīng)，將抗原與抗體的識(shí)別轉(zhuǎn)化成為可被直觀檢測(cè)的物理化學(xué)信號(hào)[2]。在測(cè)定過程中根據(jù)是否使用了標(biāo)記物免疫傳感器可以分為直接型和間接型的免疫傳感器：直接型免疫傳感器是抗體直接與抗原結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)抗原的檢測(cè)；間接型是基于捕獲抗體（capture antibody,Ab1）、被測(cè)抗原（antigen, Ag）以及標(biāo)記抗體（secondary antibody,Ab2）構(gòu)建夾心免疫模式進(jìn)行免疫分析，其抗原分子表面至少存在兩個(gè)抗原決定簇，能先后與兩個(gè)抗體結(jié)合，形成夾心模式，通過抗體上的信號(hào)標(biāo)記物產(chǎn)生并放大免疫反應(yīng)信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度。與傳統(tǒng)的免疫測(cè)試相比，免疫傳感器集免疫反應(yīng)、信號(hào)產(chǎn)生、信號(hào)檢測(cè)一體化，具有結(jié)構(gòu)緊湊、靈敏度高、使用方便、成本低等特點(diǎn)。它將不斷推動(dòng)傳統(tǒng)免疫測(cè)試的發(fā)展，并對(duì)臨床和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域做出貢獻(xiàn)[3]。

電致化學(xué)發(fā)光（Electrochemiluminescence,簡(jiǎn)稱ECL）是指通過電極對(duì)含有化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的體系施加一定的電壓或通過一定的電流，在電極表面生成某些物質(zhì)，這些物質(zhì)之間或者與體系中的其他組分通過電子傳遞生成激發(fā)態(tài)，當(dāng)激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)時(shí)產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象。電致化學(xué)發(fā)光分析結(jié)合了電化學(xué)分析和化學(xué)發(fā)光分析兩種分析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，在檢測(cè)過程中可同時(shí)測(cè)定電解電流強(qiáng)度和發(fā)光強(qiáng)度，具有高的靈敏度和選擇性、寬的線性范圍以及較強(qiáng)的抗干擾能力[4]。

1928年Albercht發(fā)現(xiàn)魯米諾（3-氨基鄰苯二甲酰肼）在堿性條件下發(fā)光，這對(duì)于有機(jī)化學(xué)發(fā)光具有里程碑的意義[5]。魯米諾因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、水溶性好、易制備、發(fā)光量子產(chǎn)率高而被廣泛研究[6]。魯米諾在堿性的條件下可被過氧化氫、高錳酸鉀、溶解氧等氧化劑氧化，氧化產(chǎn)物由激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)時(shí)會(huì)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。在實(shí)際的試驗(yàn)研究中，研究者常用過氧化氫（H2O2）作為魯米諾的氧化劑，從而構(gòu)建魯米諾-過氧化氫發(fā)光體系。在魯米諾-過氧化氫體系中，過氧化氫被催化分解生成大量的羥基自由基（OH·）和超氧自由基（O2-·），在發(fā)光過程中起著關(guān)鍵的作用[7]。其中，過氧化氫酶是一種非常常見的過氧化氫生物催化劑，它能夠很好地催化過氧化氫的分解，從而產(chǎn)生大量的活性氧，極大地促進(jìn)魯米諾的發(fā)光效率。但是，過氧化氫酶仍然存在一些不足：需要低溫儲(chǔ)藏，對(duì)環(huán)境pH等要求苛刻。近年來，為了克服過氧化氫酶的弱點(diǎn)，貴金屬和金屬氧化物納米材料[8]作為一種新的氧化還原反應(yīng)催化劑參與魯米諾-過氧化氫體系的化學(xué)發(fā)光，如金納米粒子（AuNPs）、銀納米粒子（AgNPs）、氧化鋅納米粒子（ZnO NPs）、二氧化錳納米粒子（MnO2NPs）等，顯著放大了魯米諾的ECL信號(hào)。崔華實(shí)驗(yàn)組利用魯米諾作為還原劑制備了魯米諾功能化的納米金顆粒[9]，實(shí)現(xiàn)了魯米諾在納米材料表面的固載，提高了魯米諾的使用效率和發(fā)光效率。由此，基于ECL和免疫傳感器的優(yōu)點(diǎn)，該文課題組構(gòu)建了一個(gè)以魯米諾為信號(hào)物質(zhì)的電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器（ECL Immunosensor）。

阿爾茲海默癥 （Alzheimer’s disease，簡(jiǎn)稱AD）是由神經(jīng)病理學(xué)家阿爾茲海默發(fā)現(xiàn)，并以其名字命名，這是一種主要發(fā)生在老年人群中的神經(jīng)變性疾病，最顯著的臨床特征為記憶退化、認(rèn)知及運(yùn)動(dòng)功能產(chǎn)生障礙等[10]。伴隨著全球人口的老齡化，阿爾茨海默病的發(fā)病率逐漸上升，因此對(duì)阿茲海默癥的及早發(fā)現(xiàn)具有十分重要的意義。關(guān)于阿爾茲海默癥的發(fā)病機(jī)理有很多種學(xué)說，其中Hardy等提出的阿爾茲海默癥是由于β淀粉樣蛋白（β-amyloid protein，簡(jiǎn)稱Aβ）的級(jí)聯(lián)假說引起的關(guān)注度最高。該學(xué)說認(rèn)為Aβ的聚集在阿爾茲海默癥的發(fā)生、發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用[11]。

該次實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建了一個(gè)能夠高靈敏檢測(cè)Aβ的ECL免疫傳感器。首先，在PDDA（聚二烯丙基二甲基氯化銨）功能化的MnO2NPs表面利用靜電吸附固載魯米諾功能化的 AuAgNPs（Lum-AuAg@MnO2），并將其作為二抗（Ab2）納米載體。同時(shí)這種納米復(fù)合材料也是一種極好的過氧化氫酶類似物，表現(xiàn)出了極好的H2O2催化性能。H2O2分解產(chǎn)生的羥基自由基（OH·）和超氧自由基（O2-·）與材料表面的魯米諾反應(yīng)，產(chǎn)生強(qiáng)的ECL信號(hào)。其次，二抗通過Au-N鍵被固載在Lum-AuAg@MnO2表面，從而制備了ECL二抗信號(hào)探針（Ab2@Lum-AuAg@MnO2）。最后，捕獲抗體（Ab1）被固載在沉積金修飾的玻碳電極（glassy carbon electrode，GCE）上，構(gòu)建了該傳感器的傳感界面。該實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)物Aβ介于Ab1和Ab2@Lum-AuAg@MnO2之間構(gòu)建夾心模式，實(shí)現(xiàn)了對(duì)Aβ的超靈敏檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

MPI-A型毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀（西安瑞邁分析儀器有限公司）；FA-2004A FA/JA系列電子天平（Metter Toledo公司）；CHI 660A型電化學(xué)工作站（上海辰華儀器公司）；SB-80超聲清洗儀 （寧波新芝生物科技股份有限公司）；TGL-20M高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；移液槍 （成都方舟科技開發(fā)公司）；SZCL-3B磁力攪拌器。

β淀粉樣蛋白（Aβ）及其對(duì)應(yīng)抗原（anti-Aβ）（上海信裕生物科技有限公司），Mn(CH3CHOO)2（天津市福晨化學(xué)試劑廠），高錳酸鉀（KMnO4）（成都市科龍化工試劑廠），1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC)、N-羥基硫代琥珀酰亞胺(NHS)、殼聚糖、牛血清白蛋白（BSA 96%~ 99%）、聚二烯丙基二甲基氯化銨（PDDA）均購于Sigma-Aldrich，氯金酸（HAuCl4）(上海)，鐵氰化鉀（K3[Fe(CN)6]），磷酸緩沖溶液（PBS，0.1 mol/L，pH7.4）是由0.1 mol/L Na2HPO4，0.1 mol/L KH2PO4和0.1 mol/L KCl混合配制而成，其他試劑均為分析純?cè)噭?，?shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

1.2 MnO2納米顆粒的合成

5 mL新制的Mn(CH3CHOO)2溶液（0.03mol/L）加入到50 mL潔凈燒杯中，并用去離子水稀釋至20 mL，在攪拌條件下往溶液中慢慢滴加約1 mL新制的KMnO4溶液（0.02 mol/L），攪拌1 h。然后往溶液中分別緩慢滴入1 mL氨水和1 mL PDDA（與水體積比1∶3），繼續(xù)攪拌6 h。最后將制得的黑色沉淀用去離子水離心洗滌至中性，得到的MnO2納米顆粒分散在去離子水中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 Lum-AuAg@MnO2的制備

首先，取1 mL MnO2分散液稀釋至20 mL，分別加入 200 μL 1%的 HAuCl4和 500 μL 0.025 mol/L luminol溶液，在100℃條件下攪拌6 h。然后向混合液中加入200 μL 1%的AgNO3溶液，在100℃條件下繼續(xù)攪拌6 h。最后將制得的物質(zhì)用去離子水洗滌3次，得到的Lum-AuAg@MnO2分散在去離子水中并儲(chǔ)存在4℃下備用。

1.4 二抗復(fù)合物 （Ab2@Lum-AuAg@MnO2）的合成

向2 mL Lum-AuAg@MnO2分散液中加入40 mmol/L的EDC和10 mmol/L的NHS[12]，并加入100 μL anti-Aβ，在4℃條件下攪拌8 h。然后加入100 μL的BSA（1%）攪拌4 h用以封閉材料表面的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。最后將制得的二抗復(fù)合物用去離子水洗滌，用于洗掉未能與材料結(jié)合的多余抗體和BSA，得到的Ab2@Lum-AuAg@MnO2被分散在2 mL PBS（0.1 mol/L，pH7.4）中并儲(chǔ)存在4℃條件下備用。

1.5 電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備

電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的制備過程如圖1所示。將玻碳電極分別用粒徑為0.3和0.05 μm的Al2O3粉拋光后用去離子水清洗，在室溫條件下風(fēng)干待用。將處理好的玻碳電極置于氯金酸溶液（1%）中，在-0.2 V條件下靜電位沉積30 s，獲得修飾有沉積金的玻碳電極（DpAu/GCE）。其次將10 μL Ab1滴在電極表面，在4℃條件下放置12 h，使Ab1通過Au-N鍵固載到電極表面。然后用去離子水洗去多余的Ab1，并將10 μL 1%的BSA加在電極表面，在常溫下孵育1 h以封閉電極表面的非特異性位點(diǎn)，減少非特異性吸附。最后，用去離子水洗去多余的BSA，并將不同濃度的Aβ滴加在電極表面，在室溫下孵育1 h，制備得到免疫傳感器，并儲(chǔ)存在4℃下備用。

1.6 ECL檢測(cè)

將制備好的Ab2@Lum-AuAg@MnO2滴加在修飾好的電極表面，室溫下孵育1 h。然后用去離子水洗去未參與免疫反應(yīng)的 Ab2@Lum-AuAg@MnO2，然后在電極表面滴加5 μL殼聚糖室溫放置自然晾干成膜。已經(jīng)形成夾心結(jié)構(gòu)的免疫傳感器在2 mL PBS（pH8.0，含有2.5 mmol/L H2O2）中檢測(cè)發(fā)光信號(hào)。檢測(cè)過程中光電倍增管（PMT）的光電倍增高壓設(shè)置為800 V，工作電壓掃描范圍設(shè)置為0～0.6 V，掃描速率為100 mV/s。

圖1 免疫傳感器的制備過程示意圖Fig.1 Schematic diagram of the stepwise immunosensor construction process

2 結(jié)果與討論

2.1 電致化學(xué)發(fā)光免疫傳感器修飾過程的特性表征

修飾有不同物質(zhì)的玻碳電極置于鐵氰化鉀溶液（5 mmol/L）中，在-0.2～0.6 V的電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安的電化學(xué)表征。結(jié)果如圖2(A)所示：a曲線是裸電極的CV表征曲線；當(dāng)裸電極表面沉積了納米金后，由于納米金具有極好的導(dǎo)電性，加快了電子的傳遞速率，使CV電流增強(qiáng)（b曲線）。當(dāng)anti-Aβ修飾到電極表面后，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)分子阻礙了電子的傳遞，使CV電流與b曲線相比減弱（c曲線）。然后，BSA被滴加到電極表面用于封閉傳感器界面的非特異性吸附位點(diǎn)，CV信號(hào)進(jìn)一步降低（d曲線）。滴加Aβ后，由于Aβ與anti-Aβ發(fā)生特異性反應(yīng)，電極界面阻礙電子傳遞的蛋白質(zhì)分子進(jìn)一步增多，電子傳遞速率下降，信號(hào)繼續(xù)減弱（e曲線）。綜上所述，該傳感器的修飾過程符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期。

圖2 （A）CV表征（a.裸電極，b.納米金/裸電極，c.anti-Aβ/納米金/裸電極，d.BSA/anti-Aβ/納米金/裸電極，e.Aβ/BSA/anti-Aβ/納米金/裸電極）（B）ECL表征（紅色曲線：Ab2/Aβ/BSA/anti-Aβ/納米金/裸電極，黑色曲線：Aβ/BSA/anti-Aβ/納米金/裸電極）Fig.2 （A）The characterization of CV(a.bare GCE,b.DpAu/GCE,c.anti-Aβ/DpAu/GCE,d.BSA/anti-Aβ/DpAu/ GCE,e.Aβ/BSA/anti-Aβ/DpAu/GCE)（B）The characterization of CEL(The red curve：Ab2/Aβ/BSA/anti-Aβ/DpAu/GCE，The black curve：Aβ/BSA/anti-Aβ/DpAu/GCE)

為了證明發(fā)光物luminol成功固載到了二抗復(fù)合物，并且該復(fù)合物能夠形成夾心免疫模式。該實(shí)驗(yàn)將孵育有Ab2和沒有孵育Ab2的免疫傳感器分別置于2 mL PBS（pH8.0，含有2.5 mmol/L H2O2）中檢測(cè)發(fā)光信號(hào)。結(jié)果如圖2（B）所示：修飾有Ab2得到的紅色曲線ECL信號(hào)值明顯高于無Ab2的黑線，表明成功地將luminol固載到Ab2上并構(gòu)建了夾心模式免疫傳感器。

2.2 SEM表征

圖3為SEM表征二抗復(fù)合物納米載體（Lum-AuAg@MnO2）的合成過程，圖3（A）為二氧化錳納米顆粒的表面形態(tài)，從圖中可看出二氧化錳納米顆粒呈四邊形顆粒，表面光滑，粒徑大約50 nm。圖3（B）可看出許多顆粒狀的金銀合金吸附在二氧化錳表面，呈現(xiàn)出了較大比表面積。由此，可以看出魯米諾修飾的金銀納米合金成功地包裹在二氧化錳納米表面形成了二抗復(fù)合物納米載體。

圖3 SEM表征（A：二氧化錳納米顆粒，B：包裹了魯米諾修飾的金銀合金的二氧化錳納米復(fù)合材料）Fig.3 The characterization of SEM(A:MnO2NPs,B:Lum-AuAg@MnO2NPs)

2.3 傳感器的性能優(yōu)化

檢測(cè)底液中的H2O2濃度對(duì)免疫傳感器的分析性能有重要的影響。如圖4（A）所示，隨著H2O2濃度增加到2.5 mmol/L時(shí)發(fā)光強(qiáng)度增加明顯，然后趨于平穩(wěn)水平。因此 H2O2最佳濃度為 2.5 mmol/L。

圖4 （A）H2O2濃度對(duì)免疫傳感器發(fā)光強(qiáng)度的影響；（B）Ab2孵育時(shí)間對(duì)免疫傳感器發(fā)光強(qiáng)度的影響Fig.4 (A)Effects of H2O2concentration on ECL intensity of the immunosensor;(B)Effects of Ab2incubation time on ECL intensity of the immunosensor

免疫電極在構(gòu)建過程中孵育時(shí)間是另一個(gè)重要影響因素，孵育時(shí)間主要由Aβ和Ab2之間的時(shí)間決定。將Aβ的濃度定為1 ng/mL，分別檢測(cè)Ab2孵育不同時(shí)間的ECL。如圖4（B）顯示，在孵育時(shí)間為1 h時(shí)測(cè)得了最高的ECL強(qiáng)度，然后趨于平穩(wěn)水平。因此最佳時(shí)間為1 h。

2.4 ECL信號(hào)響應(yīng)特性

在最優(yōu)條件下，電極表面修飾不同濃度的Aβ溶液，于2 mL PBS（pH8.0，含有 2.5 mmol/L H2O2）的底液中，在0～0.6 V范圍內(nèi)進(jìn)行ECL表征，結(jié)果如圖5所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著Aβ濃度的升高，ECL信號(hào)也明顯升高，并且在0.001～100 ng/mL的濃度范圍，ECL響應(yīng)信號(hào)與Aβ濃度的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系。其線性回歸方程為：I= 5203.62+805.57 lgc（c為Aβ的濃度），相關(guān)系數(shù)為r2=0.9938。

圖5 ECL信號(hào)（Aβ溶液的濃度分別為a.100 ng/mL，b.10 ng/mL，c.1 ng/mL，d.100 pg/mL，e.10 pg/mL，f.1 pg/mL，g.0 pg/mL）Fig.5 ECL signal(Aβ solution concentration were a.100 ng/mL,b.10 ng/mL,c.1 ng/mL,d.100 pg/mL, e.10 pg/mL,f.1 pg/mL,g.0 pg/mL)

2.5 Aβ免疫傳感器的選擇性和穩(wěn)定性

為研究Aβ免疫傳感器的選擇性，該實(shí)驗(yàn)使用甲胎蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA）作為干擾物質(zhì)，在傳感器表面分別孵育AFP（1 ng/mL），CEA（1 ng/mL）以及Aβ（0.1 ng/mL）。從圖6（A）可以看出，孵育AFP和CEA的傳感器測(cè)得較低的ECL信號(hào)，而孵育有目標(biāo)物Aβ的傳感器則可以測(cè)得高的ECL信號(hào)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中還將三種蛋白的混合溶液 （1 ng/mL CEA，1 ng/mL AFP，0.1 ng/mL Aβ）修飾到傳感器表面，檢測(cè)到的ECL信號(hào)與0.1 ng/mL濃度的Aβ十分接近，表明該ECL免疫傳感器對(duì)Aβ具有良好的選擇性。

圖6 （A）Aβ免疫傳感器的選擇性；（B）Aβ免疫傳感器的穩(wěn)定性Fig.6 (A)The selectivity of Aβ immunosensor;(B)The ECL stability of Aβ immunosensor

為了考察電化學(xué)發(fā)光免疫傳感器的穩(wěn)定性，將孵育了0.1 ng/mL濃度的Aβ的電極在2 mL PBS（pH8.0，含有2.5 mmol/L H2O2）的底液中連續(xù)掃描了12圈。結(jié)果如圖6（B）所示，ECL響應(yīng)值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.16%，說明該傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

2.6 實(shí)際樣品的檢測(cè)

采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，利用被PBS（pH7.4）稀釋40倍的人體血清液配置一系列不同濃度的Aβ溶液，在這種模擬人體環(huán)境中檢測(cè)ECL傳感器的性能。測(cè)得的ECL免疫傳感器響應(yīng)信號(hào)，結(jié)果如表1所示，顯示加標(biāo)回收率在96.5%～103.5%范圍內(nèi)，證明該免疫傳感器可以應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

表1 不同濃度Aβ樣品的檢測(cè)Tab.1 Determination of Aβ added in normal human serum with the proposed aptasensor

3 結(jié)論

在該研究中，以Lum-AuAg@MnO2納米復(fù)合材料作為Ab2的納米載體，成功地構(gòu)建了一種用于超靈敏檢測(cè)β淀粉樣蛋白的免疫傳感器。該實(shí)驗(yàn)制備了Lum-AuAg@MnO2納米復(fù)合材料并將其用于基于魯米諾為發(fā)光物的ECL免疫傳感器的構(gòu)建。在Luminol-H2O2體系中，MnO2NPs作為一種酶類似物對(duì)H2O2的分解有極好的催化性能，催化產(chǎn)生的活性氧能夠極大的提高魯米諾的發(fā)光性能。AuNPs和AgNPs的存在也能夠很好地促進(jìn)魯米諾的發(fā)光，從而得到高的ECL信號(hào)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該免疫傳感器制備方法簡(jiǎn)單，有著較好的選擇性，能夠檢測(cè)血清中的β淀粉樣蛋白抗原濃度，有望應(yīng)用于β淀粉樣蛋白抗原的醫(yī)學(xué)研究和臨床檢驗(yàn)。

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Luminol-capped AuAg@MnO2nanocomposite based electrochemiluminescence immunosensor for the detection of βamyloid protein

Wang Jing-xi,Zhu A-min,Yuan Ruo*,Chai Ya-qin*
(College of Chemistry and Chemical Engineering,Southwest University,Chongqing 400715,China)

In this work,the electrochemiluminescence (ECL)luminophore of luminol was utilized as reductant to synthesize luminol functionalized gold-silver nanoparticles (Lum-AuAgNPS).And the Lum-AuAgNPs were immobilized on the surface of MnO2NPs with low bio-toxicity,large specific surface area,and favourable chemical catalytic activity(Lum-AuAg@MnO2),which could be used as protein carrier to fabricate biosensors.Encouraged by the advantages above,a sandwiched electrochemiluminescence(ECL)immunosensor based on Lum-AuAg@MnO2was constracted for ultrasensitive detection of β-amyloid protein(Aβ,a biomarker for Alzheimer’s disease).Lum-AuAg@MnO2exhibited excellent conductivity and admirable catalytic activity in H2O2decomposition,which could increase the ECL efficiency of luminol-H2O2system and generate strong ECL signal.The experiment proved that the immunosensor had good linear range of 100 ng/mL to 1 pg/mL and an ultralow detection limit of 0.33 pg/mL in the determination of β-amyloid protein,exhibiting high sensitivity and controllable reaction in Aβ detection.

electrochemiluminescence;β-amyloid protein(Aβ);luminol;immunosensor

國家自然科學(xué)面上基金項(xiàng)目（21575116,21675129,21675130）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（XDJK2015A002）

*通信聯(lián)系人,E-mail:yuanruo@swu.edu.cn;yqchai@swu.edu.cn，Tel.:Fax:023-68253172