基于PtNFs-GOD復(fù)合材料的電致化學(xué)發(fā)光葡萄糖生物傳感器的研究

廖 妮

(攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,四川攀枝花617000)

基于PtNFs-GOD復(fù)合材料的電致化學(xué)發(fā)光葡萄糖生物傳感器的研究

廖 妮*

(攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,四川攀枝花617000)

采用一鍋合成法制備了新型的具有大比表面積的花狀鉑納米顆粒（PtNFs），將制備好的花狀鉑納米顆粒與聚乙烯醇縮丁醛（PVB）的乙醇溶液混合，用溶膠-凝膠法使葡萄糖氧化酶（GOD）固定于玻碳電極上，構(gòu)建了一個(gè)高靈敏電致化學(xué)發(fā)光（ECL）生物傳感器用于檢測(cè)葡萄糖。基于PtNFs-GOD修飾的葡萄糖生物傳感器顯示出了良好的性能，其檢測(cè)線性范圍為1.00×10-5~3.00×10-4mol/L,檢測(cè)下限為0.33×10-6mol/L。該生物傳感器重現(xiàn)性、選擇性與穩(wěn)定性好、使用壽命較長(zhǎng)，回收率在96.81%~100.98%之間，可應(yīng)用于實(shí)際樣品葡萄糖含量的檢測(cè)。

花狀鉑納米顆粒；電致化學(xué)發(fā)光生物傳感器；葡萄糖

0 引言

葡萄糖是生命活動(dòng)中不可缺少的碳水化合物，也是人體新陳代謝的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。許多的慢性疾病比如心血管疾病、高血糖、肥胖癥、糖尿病都與葡萄糖密切相關(guān)。因此，葡萄糖含量檢測(cè)對(duì)于評(píng)估人體健康狀況具有非常重要的意義！目前，測(cè)定葡萄糖的方法主要有分光光度法[1]、高效液相色譜法[2]、毛細(xì)管電泳法[3]等，然而這些方法操作復(fù)雜、分析速度慢、成本較高，且在檢測(cè)范圍和靈敏度方面很難達(dá)到低濃度檢出限。因此，發(fā)展能夠快速、簡(jiǎn)便、靈敏地檢測(cè)低濃度葡萄糖的方法，具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。

電致化學(xué)發(fā)光（ECL）是近些年發(fā)展起來(lái)的一種新型分析方法[4]。由于其簡(jiǎn)單、快速、靈敏,可控及低背景等特點(diǎn)，該方法被廣泛地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域，如環(huán)境污染物監(jiān)測(cè)，藥物分析及人體相關(guān)生物分子的檢測(cè)等[5-6]。S2O82--O2體系的ECL發(fā)光現(xiàn)象由于其經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，該ECL體系被逐漸受到越來(lái)越多的關(guān)注[7]。

葡萄糖氧化酶對(duì)葡萄糖具有高的選擇性和靈敏度，常被用于制備各種生物傳感器，以滿足葡萄糖檢測(cè)的需要。研究表明，葡萄糖氧化酶（GOD）和辣根過(guò)氧化物酶（HRP）可以協(xié)同催化底物中的葡萄糖水解并產(chǎn)生O2，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)S2O82--O2ECL體系信號(hào)的放大及穩(wěn)定性的提高。近年來(lái)，葡萄糖傳感器由于靈敏度高、穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)已成為生化分析和臨床檢驗(yàn)等方面的一個(gè)重要研究方向。

在該工作中，該文課題組提出一種仿雙酶協(xié)同催化原位產(chǎn)生共反應(yīng)試劑的策略，并成功將其應(yīng)用于S2O82--O2ECL體系，實(shí)現(xiàn)了信號(hào)的放大及穩(wěn)定性的提高。因此，在該文中該文課題組制備了具有大比表面積的花狀鉑納米顆粒，鉑納米顆粒具有模擬辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的作用，并且與GOD酶性質(zhì)相結(jié)合，論證仿雙酶標(biāo)記可以大大增強(qiáng)過(guò)硫酸根體系的ECL信號(hào)。利用GOD和PtNFs同時(shí)作為標(biāo)記物，通過(guò)GOD的催化作用產(chǎn)生H2O2，接著被PtNFs催化原位產(chǎn)生高濃度的O2，從而克服了上述缺陷，從而實(shí)現(xiàn)葡萄糖的超靈敏檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

MPI-E型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)(西安瑞邁分析儀器有限公司、中科院長(zhǎng)春應(yīng)化所)；掃描電子顯微鏡(S-4800，日本Hitachi Instrument公司)。實(shí)驗(yàn)采用的三電極體系，修飾過(guò)的玻碳電極(GCE，Φ=4 mm)為工作電極，鉑電極為輔助電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極。

過(guò)硫酸鉀（K2S2O8）購(gòu)于上海康達(dá)氨基酸廠；氯鉑酸(H2PtCl6)購(gòu)于Sigma公司；葡萄糖氧化酶（GOD）購(gòu)于上海生化有限公司；磷酸緩沖溶液（PBS，0.1 mol/L，pH7.4）是用0.1 mol/L KH2PO4，0.1 mol/L Na2HPO4和0.1 mol/L KCl混合配制而成；其他試劑均為分析純?cè)噭?，?shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 花狀鉑納米顆粒（PtNFs）的制備

花狀鉑納米顆粒（PtNFs）的制備是采用一鍋合成法制得的。步驟如下：首先稱取0.0421 g多巴胺（DA）作為還原劑，溶于10 mL水中形成混合均勻的溶液。向上述溶液中加入20 μL 0.5% Nafion溶液和1 mL 1%H2PtCl6溶液。持續(xù)攪拌一個(gè)小時(shí)使得H2PtCl6充分還原。這里使用Nafion是為了使DA還原生成的Pt納米顆粒聚集生成具有更大表面積的花狀鉑納米顆粒（PtNFs）。

1.3 葡萄糖傳感器的制備

在電極修飾之前，首先將玻碳電極（GCE，Φ =4 mm）分別用0.3及0.05 μm的三氧化二鋁（Al2O3）粉在麂皮上打磨、拋光，然后用蒸餾水洗凈并依次用乙醇和蒸餾水超聲清洗干凈，最后將其置于室溫下晾干備用。

取10 μL 12 mg/L的葡萄糖氧化酶 (GOD)溶液與5 mL的鉑納米顆粒溶液混勻，加入到5 mL 2%聚乙烯醇縮丁醛(PVB)的無(wú)水乙醇凝膠溶液中混合均勻，取10 μL上述混合液滴加到GCE上靜置12 h，然后真空干燥，獲得GOD-PtNFs納米粒子修飾的玻碳電極(GOD-PtNFs/GCE)，保存在4℃冰箱中備用。

1.4 檢測(cè)方法

采用MPI-E型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)對(duì)所修飾電極的電致化學(xué)發(fā)光行為進(jìn)行研究，將所制得修飾電極置于測(cè)試底液為3 mL含有0.1 mol/L K2S2O8和不同濃度的葡萄糖PBS(pH7.4)緩沖溶液檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米材料的表征

對(duì)所制備納米材料的微觀形態(tài)和微觀結(jié)構(gòu)用掃描電子顯微鏡(SEM)進(jìn)行了表征。從圖1上可以看出PtNFs是團(tuán)簇的花狀結(jié)構(gòu)，說(shuō)明加入少量的Nafion能夠使得合成的鉑納米顆粒具有更大的表面積。

圖1 PtNFs掃描電鏡表征圖Fig.1 SEM of PtNFs

2.2 GOD用量的選擇

實(shí)驗(yàn)考查了酶電極GOD-PtNFs/GCE在制備過(guò)程中受不同濃度GOD用量的影響。當(dāng)GOD濃度分別為2、4、8、12、16、20 mg/L時(shí)，所制備的傳感器對(duì)3.0×10-5mol/L葡萄糖的響應(yīng)電流情況如圖2所示。由圖2可以看出，電極的ECL響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度隨著GOD濃度的增加而增大，在12 mg/L時(shí)達(dá)到飽和不再增大，由此可以確定GOD的最佳濃度為12 mg/L。

圖2 GOD-PtNFs受不同濃度GOD用量的影響Fig.2 Effect of the GOD concentration on the GODPtNFs/GCE biosensor

2.3 葡萄糖傳感器的響應(yīng)性能

2.3.1 傳感器的線性范圍及檢測(cè)限

實(shí)驗(yàn)考查了酶電極GOD-PtNFs/GCE對(duì)不同濃度葡萄糖的響應(yīng)情況。隨著葡萄糖濃度的增加，電極響應(yīng)的峰電流值也逐漸增加，圖3為GOD-PtNFs/GCE響應(yīng)葡萄糖的校正曲線。從圖中可知，傳感器在1.00×10-5~3.00×10-4mol/L范圍內(nèi)的響應(yīng)電流與葡萄糖濃度成線性關(guān)系，其校正曲線方程可擬合為：I=28.302 c+3476.6，(c為葡萄糖濃度；I為峰電流響應(yīng)值，r2=0.99)。檢測(cè)下限為0.33×10-6mol/L。

圖3 ECL生物傳感器在不同的葡萄糖濃度下的ECL-時(shí)間曲線，插入圖為線性斜率圖Fig.3 ECL-time curves of the biosensor with different concentrations of glucose in 0.1 mol/L PBS(pH7.4) containing 0.1 mol/L K2S2O8.glucose concentration:(a)10 μmol/L,(b)30 μmol/L,(c)80 μmol/L,(d)160 μmol/L,(e) 240 μmol/L,(f)300 μmol/L.The insert is the relationship between ECL intensity and the concentration of glucose. The voltage of the photomultiplier tube was set at 800 V.Scan rate,100 mV/s

2.3.2 傳感器的重現(xiàn)性、選擇性、穩(wěn)定性和使用壽命

將按照上述方法制備好的GOD-PtNFs/GCE在1.60×10-4mol/L的葡萄糖溶液中來(lái)回進(jìn)行6次測(cè)試，表明該傳感器在兩種溶液響應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.50%,說(shuō)明傳感器的重現(xiàn)性較好。選擇性是傳感器能否應(yīng)用的一個(gè)重要考核指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)考察了該電極在1.60×10-4mol/L葡萄糖溶液中分別加入20倍濃度的抗壞血酸、尿酸、果糖后的電流響應(yīng)情況，結(jié)果沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的電流增強(qiáng)響應(yīng)信號(hào)，說(shuō)明抗壞血酸、尿酸、果糖等對(duì)葡萄糖傳感器無(wú)明顯的干擾。

傳感器的穩(wěn)定性是分析檢測(cè)應(yīng)用的一個(gè)重要性能指標(biāo)。 實(shí)驗(yàn)考察了該電極在 1.60×10-4mol/L葡萄糖溶液中連續(xù)檢測(cè)9圈，其ECL相應(yīng)響應(yīng)過(guò)程如圖4所示，其ECL電流響應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.86%，說(shuō)明該傳感器具有較好的穩(wěn)定性。并且該電極經(jīng)過(guò)15 d使用后，響應(yīng)電流下降至最初值的90%，說(shuō)明傳感器具有良好的穩(wěn)定性且至少可以使用12 d。

圖4 生物傳感器的穩(wěn)定性Fig.4 The stability of the proposed ECL biosensor

2.3.3 生物傳感器催化機(jī)理

PtNFs-GOD修飾到電極表面后，GOD催化底液中的葡萄糖產(chǎn)生H2O2，H2O2被仿HRP酶作用的PtNFs催化原位產(chǎn)生大量的共反應(yīng)劑O2，其涉及的反應(yīng)用公式表示如下：

從而循環(huán)往復(fù)，大大增強(qiáng)ECL光信號(hào)，進(jìn)而大大提高了反應(yīng)靈敏度。可能的機(jī)理為[8]：

2.3.4 傳感器的回收率與分析應(yīng)用

將按照上述方法制備好的GOD-PtNFs/GCE，對(duì)實(shí)驗(yàn)室配制的5個(gè)葡萄糖樣品溶液的濃度進(jìn)行了加標(biāo)回收測(cè)試，結(jié)果表明其回收率在96.81% ~100.98%之間（見(jiàn)表1），說(shuō)明GOD-PtNFs/GCE能夠較好地應(yīng)用于葡萄糖的快速檢測(cè)。

表1 傳感器的回收結(jié)果（n=5）Tab.1 The recovery of the glucose biosensor

3 結(jié)論

該文探討了一種基于花狀鉑納米顆粒修飾電極用于葡萄糖檢測(cè)的生物傳感器。提出了仿雙酶循環(huán)反應(yīng)原位產(chǎn)生共反應(yīng)劑促進(jìn)ECL反應(yīng)的有效放大策略，成功的提高了檢測(cè)靈敏度，擴(kuò)大了檢測(cè)范圍，所構(gòu)建的生物傳感器也顯示了良好的選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。因此，該工作提供了一個(gè)新穎的信號(hào)放大策略并可望應(yīng)用于實(shí)際樣品葡萄糖含量的檢測(cè)。

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Electrochemiluminescence biosensor based on PtNFs-GOD composite materials for the determination of glucose

Liao Ni*
(College of Biological and Chemical Engineering,Panzhihua University,Panzhihua 617000,China)

In this paper,a novel electrochemiluminescence biosensor for the detection of glucose was proposed based on flower-like platinum nanoparticles(PtNFs)via an one-pot chemical synthesis method.Glucose biosensors were formed in optimal conditions with glucose oxidase (GOD)immobilized glassy carbon electrode,which was composed of platinum nanoparticles and polyvinyl butyral(PVB)with sol-gel method.The present glucose biosensor showed a wide linear range of 1.00×10-5mol/L to 3.00×10-4mol/L,with a low detection limit of 0.33×10-6mol/L for detecting glucose.The glucose biosensor possessed nice reproducibility,selectivity,stability and long lifetime with a recovery of 96.81%~100.98%,which can be well applied to determination of glucose in actual samples.

flower-like structures platinum nanoparticles；electrochemiluminescence biosensor；glucose

*通信聯(lián)系人