金針菇多糖-Zn2＋螯合物對L929腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用及其抗氧化活性

趙姝雯，夏 宇，陳貴堂，胡秋輝,3，趙立艷,*（.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 0095；.中國藥科大學(xué)工學(xué)院，江蘇 南京 0009；3.南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 0046）

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金針菇多糖-Zn2＋螯合物對L929腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用及其抗氧化活性

趙姝雯1，夏 宇1，陳貴堂2，胡秋輝1,3，趙立艷1,*
（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.中國藥科大學(xué)工學(xué)院，江蘇 南京 210009；3.南京財經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210046）

摘 要：比較研究金針菇多糖-Zn2＋螯合前后的抗腫瘤作用與其體外抗氧化活性。通過小鼠成纖維肉瘤細(xì)胞L929培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，觀察不同質(zhì)量濃度金針菇多糖溶液對體外培養(yǎng)L929細(xì)胞形態(tài)的影響，四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）實(shí)驗(yàn)評價金針菇多糖對L929細(xì)胞生長和增殖的影響。結(jié)果表明：在質(zhì)量濃度為5～50 μg/mL時，金針菇粗多糖及其純化組分對L929細(xì)胞的抑制作用不強(qiáng)烈，金針菇多糖-Zn2＋對L929細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用。相比較金針菇多糖直接作用于L929細(xì)胞，金針菇多糖介導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞上清液對L929細(xì)胞的抑制率作用顯著增強(qiáng)。同時，以對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、超氧陰離子自由基（O2－?）、羥自由基（?OH）、H2O2的清除率為評價指標(biāo)，體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示金針菇多糖-Zn2＋抗氧化活性較螯合Zn2＋前有所提高。即金針菇多糖中Zn含量的提高有助于提升其抗氧化活性。

關(guān)鍵詞：金針菇多糖；螯合；Zn2＋；L929細(xì)胞；抗氧化活性

引文格式：

趙姝雯,夏宇,陳貴堂,等.金針菇多糖-Zn2＋螯合物對L929腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用及其抗氧化活性[J].食品科學(xué),2016,37(5):202-207.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605036.http://www.spkx.net.cn

ZHAO Shuwen,XIA Yu,CHEN Guitang,et al.Effect of Flammulina velutipes polysaccharide-Zn2+chelate on suppression of L929 tumor cell proliferation and its antioxidant activity[J].Food Science,2016,37(5):202-207.(in Chinese with English abstract)DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605036.http://www.spkx.net.cn

金針菇多糖（Flammulina velutipes polysaccharide，F(xiàn)VP）是一種以葡聚糖為主，由數(shù)個多糖組分構(gòu)成的混合多糖。研究表明，F(xiàn)VP對肝臟損傷有保護(hù)作用，對小鼠腫瘤S180、H22、L615及人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231均有明顯的抑制作用[1-2]。鋅（Zn）是人體必需的微量元素之一，對生物的生長發(fā)育、免疫功能等均具有重要作用。由于其具有重要的生物學(xué)功能，關(guān)于Zn的形態(tài)分析、富Zn食品的開發(fā)及其生物活性等方面的研究越來越多[3-4]。目前的補(bǔ)Zn產(chǎn)品中多為無機(jī)Zn，攝入過多對人體有一定的毒害作用，且無機(jī)Zn不利于人體吸收。無機(jī)Zn通過生物轉(zhuǎn)化作用可轉(zhuǎn)化為低毒的有機(jī)Zn。由于有機(jī)Zn更接近于Zn在體內(nèi)的作用形式從而易于被人體吸收，其生物學(xué)效價要高于無機(jī)Zn[5]。在生物體內(nèi)，Zn主要是和多糖等大分子物質(zhì)結(jié)合生成較為穩(wěn)定的配合物質(zhì)。與其他的營養(yǎng)物不同，Zn不能儲留在人體內(nèi)，也不能在身體中合成，只能從外界攝入[6]。交界離子如Fe2＋、Co2＋、Ni2＋、Cu2＋、Zn2＋、Pb2＋對硬軟配體都有一定親和性，能分別與軟硬離子競爭配體形成絡(luò)合物[7]。近年來，Zn2＋與殼聚糖、黑木耳多糖及金針菇多糖的螯合工藝已有研究報道[8-10]，但是關(guān)于其與金針菇多糖螯合產(chǎn)物的體內(nèi)、體外活性尚未有深入研究。

同時，目前有關(guān)多糖抗氧化的研究比較多[11-14]，而對金針菇純化多糖與Zn螯合前后體外抗氧化活性比較、分析的研究相對較少。本實(shí)驗(yàn)通過考察金針菇多糖與Zn螯合前后的抗腫瘤效果以及金針菇多糖介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞上清液對L929細(xì)胞的抑制作用，以期進(jìn)一步了解其活性特點(diǎn)，為金針菇鋅多糖功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

金針菇購于眾彩農(nóng)副產(chǎn)品批發(fā)市場有限公司；L929小鼠成纖維肉瘤細(xì)胞、RAW 264.7巨噬細(xì)胞由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供。

RMPI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、DMEM培養(yǎng)基 美國Gibco公司；正丁醇、氯仿、硝酸、無水乙醇、丙酮、乙醚、硫酸、苯酚、氯化鐵、鄰苯三酚、鹽酸、硫酸亞鐵、H2O2、水楊酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、鐵氰化鉀、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）等均為國產(chǎn)分析純。各種溶液配制均使用超純水。

1.2儀器與設(shè)備

HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；TDL-5-A離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；2.5L冷凍干燥機(jī) 英國Labconco公司；MQX 200型酶標(biāo)儀 美國Bio-Tek公司。

1.3方法

1.3.1金針菇多糖分離純化及螯合

新鮮金針菇經(jīng)晾曬至半干后，放在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，60 ℃鼓風(fēng)烘干，然后用粉碎機(jī)將其粉碎，過60 目篩，制得金針菇粉，置于4 ℃條件下備用。

以水提法得到多糖提取液，Sevag試劑去蛋白質(zhì)，取其離心后的上清液合并旋蒸至50～100 mL。醇沉后進(jìn)行凍干得到初步分離純化的金針菇粗多糖（簡稱FVPc）[15]。

FVPc通過DEAE Cellulose-52離子層析柱分離純化及Sephadex G-100凝膠色譜分離純化得到純化的金針菇多糖（簡稱FVPp）[16]。

取0.6 g ZnSO4·7H2O溶于100 mL超純水中，配成Zn2＋質(zhì)量濃度為6 mg/mL的溶液，按FVPp與Zn2＋的質(zhì)量比為5∶1加入多糖；30 ℃、150 r/min振蕩螯合8 h，醇沉后凍干得到金針菇多糖-Zn2＋螯合物（簡稱Zn-FVP）[17]，按照下式計算螯合率。

式中：ρ0為螯合前溶液中Zn2＋的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；ρ為螯合后溶液中Zn2＋的質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.23種金針菇多糖對L929細(xì)胞增殖的抑制作用

將L929細(xì)胞密度調(diào)整為2×104個/mL，在96 孔板中按照每孔100 μL接種細(xì)胞懸液。置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁生長。吸去上清液，分別加入不同質(zhì)量濃度（5、12.5、25、50 μg/mL）的樣品溶液（FVPc、FVPp、Zn-FVP）100 μL和順鉑溶液（陽性對照組，5 μg/mL）100 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 mg/mL的四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液，后加入DMSO 100 μL振蕩，培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 min。用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定各孔的吸光度[18]，按照下式計算L929細(xì)胞存活率。

式中：Ak為樣品組或陽性對照組的吸光度；A1為陰性對照組（不加多糖樣品）的吸光度；A0為空白組的吸光度。

1.3.33種金針菇多糖介導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞上清液對L929細(xì)胞的增殖抑制作用

將RAW 264.7細(xì)胞密度調(diào)整為2×105個/mL，在96 孔板中按照每孔100 μL接種細(xì)胞懸液。置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁生長。吸去上清液，分別加入不同質(zhì)量濃度（5、12.5、25、50 μg/mL）的樣品溶液（FVPc、FVPp、Zn-FVP）100 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。收集上清液，－20 ℃保存。

將L929細(xì)胞密度調(diào)整為2×104個/mL，在96 孔板中按照每孔100 μL接種細(xì)胞懸液。置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁生長。吸去上清液，分別加入上述以不同質(zhì)量濃度（5、12.5、25、50 μg/mL）的樣品溶液（FVPc、FVPp、Zn-FVP）培養(yǎng)的RAW 264.7細(xì)胞上清液和順鉑溶液（5 μg/mL）100 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液，加入DMSO 100 μL振蕩，培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 min。用酶標(biāo)儀在490 nm波長處測定各孔的吸光度[19]，按照公式（2）計算L929細(xì)胞存活率。

1.3.43種金針菇多糖對L929細(xì)胞形態(tài)的影響

將L929細(xì)胞密度調(diào)整為2×104個/mL，在6 孔板中按照每孔3 mL接種細(xì)胞懸液。置于含5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁生長。吸去上清液，分別加入不同質(zhì)量濃度（100、200 μg/mL）的樣品溶液（FVPc、FVPp、Zn-FVP）3 mL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。使用倒置顯微鏡觀察不同質(zhì)量濃度的樣品溶液對L929細(xì)胞形態(tài)的影響。

1.3.5金針菇多糖對DPPH自由基清除能力的測定

分別取不同質(zhì)量濃度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的樣品溶液（FVPc、FVPp、Zn-FVP）1 mL到試管中，加入0.4 mL 0.2 mmol/L DPPH-甲醇溶液和1.6 mL去離子水，混合均勻在30 ℃反應(yīng)30 min后，用分光光度計在517 nm波長處測定吸光度As。同時測定不加DPPH的樣品空白吸光度A1、加DPPH但不加樣品（以體積分?jǐn)?shù)80%甲醇或蒸餾水代替樣品）的吸光度A0；用1 mL不同質(zhì)量濃度的VC溶液代替樣品溶液作為陽性對照組，測定其對DPPH自由基的清除能力[20-22]。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 組平行，結(jié)果取平均值。按照下式計算3 種金針菇多糖對DPPH自由基的清除率。

1.3.6金針菇多糖對超氧陰離子自由基（O2－?）清除能力的測定

取不同質(zhì)量濃度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的樣品溶液（FVPc、FVPp、Zn-FVP）1 mL于試管中，加入0.05 mol/L的Tris-HCl（pH 8.2）溶液3 mL，各管用蒸餾水補(bǔ)齊到7 mL，在30 ℃條件下水浴15 min，最后加入由10 mmol/L HCl配制的8 mmol/L鄰苯三酚溶液1 mL，混合均勻后反應(yīng)6 min，立即加入2 滴8 mol/L的HCl終止反應(yīng)，用分光光度計在325 nm波長處測定吸光度。用蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照組，用1 mL不同質(zhì)量濃度的VC溶液代替樣品溶液作為陽性對照[23-25]。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 組平行，結(jié)果取平均值。按照下式計算3 種金針菇多糖對O2－?的清除率。

式中：A0為空白對照組的吸光度；A1為樣品或陽性對照組的吸光度。

1.3.7金針菇多糖對羥自由基（?OH）清除能力的測定取不同質(zhì)量濃度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的樣品溶液（FVPc、FVPp、Zn-FVP）2 mL于試管中，分別加入6 mmol/L的FeSO4溶液2 mL、6 mmol/L H2O2溶液2 mL，混合均勻，靜置10 min，再加6 mmol/L水楊酸溶液2 mL，搖勻后靜置30 min，用分光光度計在510 nm波長處測定吸光度。以蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照組，以1 mL不同質(zhì)量濃度的VC溶液代替樣品溶液作為陽性對照組[26]。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 組平行，結(jié)果取平均值。按照下式計算3 種金針菇多糖對?OH的清除率。

式中：A0為空白對照組的吸光度；AS為樣品或陽性組的吸光度；A1為樣品干擾實(shí)驗(yàn)（以蒸餾水代替水楊酸）組的吸光度。

1.3.8金針菇多糖對H2O2清除能力的測定

取不同質(zhì)量濃度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的樣品溶液（FVPc、FVPp、Zn-FVP）1 mL于試管中，分別加入2.8 mL 0.1 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 4）和0.6 mL 40 mmol/L的H2O2溶液，混合物在30 ℃條件下反應(yīng)10 min，之后用分光光度計在230 nm波長處測定吸光度。以蒸餾水代替樣品溶液作為空白對照組；以1 mL不同質(zhì)量濃度的VC溶液代替樣品溶液作為陽性對照[27-28]。實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 組平行，結(jié)果取平均值，按照下式計算3 種金針菇多糖對H2O2的清除率。

式中：A0為空白對照組的吸光度；As為樣品或陽性對照組的吸光度；A1為樣品干擾實(shí)驗(yàn)組（以蒸餾水代替H2O2）的吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1Zn-FVP螯合物的制備結(jié)果

Zn2＋的初始質(zhì)量濃度為6mg/mL，F(xiàn)VPp與Zn2＋的質(zhì)量比為5∶1、鰲合時間為8 h時，F(xiàn)VPp與Zn2＋的螯合率達(dá)到97.28%，Zn-FVP中的Zn含量為175 mg/g。

2.2FVPc、FVPp、Zn-FVP對L929細(xì)胞增殖的抑制作用

分別測定MTT實(shí)驗(yàn)中在FVPc、FVPp、Zn-FVP的4 個質(zhì)量濃度梯度（5、12.5、25、50 μg/mL）處理下細(xì)胞A490 nm的變化，確定其對L929細(xì)胞存活率的影響。由圖1可知，F(xiàn)VPc、FVPp對L929細(xì)胞有微弱的促增殖效果，且這種促增殖效果隨著3 種金針菇多糖質(zhì)量濃度的增加而下降，且下降趨勢不明顯。在5～50 μg/mL之間，Zn-FVP 對L929細(xì)胞有抑制增殖的作用，在5～25 μg/mL范圍內(nèi)，L929細(xì)胞存活率下降較明顯，在25～50 μg/mL時L929細(xì)胞存活率下降趨勢平緩。當(dāng)質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，Zn-FVPp使L929細(xì)胞存活率下降至17.33%。

圖1　3 種金針菇多糖對L929細(xì)胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of Flammulina velutipes polysaccharides on the growth of L929 cells

2.3FVPc、FVPp、Zn-FVP介導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞上清液對L929細(xì)胞的增殖抑制作用

圖2　3 種金針菇多糖介導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞上清液對L929細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.2 RAW 264.7 macrophage-mediated anti-tumor activity of Flammulina velutipes polysaccharides

分別測定MTT實(shí)驗(yàn)中4 個質(zhì)量濃度梯度（5、12.5、25、50 μg/mL）介導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞上清液處理下細(xì)胞A490 nm的變化，確定3 種金針菇多糖介導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞上清液對L929細(xì)胞存活率的影響。由圖2可知，在低質(zhì)量濃度時，F(xiàn)VPc、FVPp對L929細(xì)胞有微弱的促進(jìn)增殖效果，但這種促增殖效果隨著3 種金針菇多糖質(zhì)量濃度的增加而下降，當(dāng)FVPc、FVPp質(zhì)量濃度超過25 μg/mL時，RAW 264.7巨噬細(xì)胞上清液對細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用。Zn-FVP在5～50 μg/mL范圍內(nèi)對L929細(xì)胞有抑制增殖的作用，在5～25 μg/mL范圍內(nèi)，L929細(xì)胞存活率下降較明顯，在25～50 μg/mL時，L929細(xì)胞存活率下降趨勢平緩。當(dāng)質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，3 種金針菇多糖介導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞上清液使L929細(xì)胞的存活率分別下降至83.52%、78.37%、3.97%，與3 種金針菇多糖直接作用于L929細(xì)胞相比，抑制率分別增強(qiáng)了27.35%、20.79%、77.07%。

據(jù)文獻(xiàn)[29]報道，當(dāng)歸多糖對小鼠腹腔巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞效應(yīng)分子的誘導(dǎo)作用對癌細(xì)胞沒有直接殺傷作用，而是通過調(diào)節(jié)免疫功能對癌細(xì)胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。本實(shí)驗(yàn)使用3 種金針菇多糖刺激RAW 264.7巨噬細(xì)胞的上清液培養(yǎng)成纖維肉瘤細(xì)胞L929，檢測其是否會對L929的增殖產(chǎn)生更大的抑制效果，結(jié)果表明3 種金針菇多糖介導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞上清液對L929細(xì)胞有更強(qiáng)的抑制效果。這可能是因?yàn)長929細(xì)胞對于腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）更敏感，金針菇多糖可促進(jìn)RAW 264.7巨噬細(xì)胞釋放TNF-α等細(xì)胞效應(yīng)分子，從而間接發(fā)揮抗腫瘤免疫作用。

2.4FVPc、FVPp、Zn-FVP對L929細(xì)胞形態(tài)的影響

圖3　3 種金針菇多糖對L929細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.3 Morphological change of L929 cells in the presence of Flammulina velutipes polysaccharides

為了直觀地顯示出不同質(zhì)量濃度金針菇多糖對L929細(xì)胞形態(tài)的影響，本實(shí)驗(yàn)選取了較高質(zhì)量濃度（100、200 μg/mL）的金針菇多糖提取液。如圖3所示，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，100、200 μg/mL的FVPc、FVPp處理組的L929細(xì)胞多為長梭形和多角形，細(xì)胞密度隨著多糖質(zhì)量濃度增加而下降，100、200 μg/mL組的細(xì)胞形態(tài)基本相同。但100、200 μg/mL的Zn-FVP處理組的L929細(xì)胞數(shù)目均顯著減少，細(xì)胞核縮小，懸浮細(xì)胞增多，基本不貼壁，細(xì)胞收縮為圓形，絕大部分細(xì)胞死亡。

2.5FVPp、Zn-FVP對DPPH自由基的清除能力

由于FVPc與FVPp的自由基清除效果大致相當(dāng)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)只選用FVPp與Zn-FVP進(jìn)行對比分析。如圖4所示，螯合Zn2＋前后，F(xiàn)VP均有清除DPPH自由基的能力，但都弱于陽性對照組VC。各組DPPH自由基清除能力均隨質(zhì)量濃度增加逐漸增大，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，金針菇多糖的DPPH自由基清除率與質(zhì)量濃度成正相關(guān)。在1.0 mg/mL時，VC、FVPp、Zn-FVP對DPPH自由基的清除率分別為84.11%、42.63%、52.10%。FVPp與Zn-FVP可以終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，與DPPH自由基反應(yīng)生成更穩(wěn)定的產(chǎn)物。

圖4　金針菇多糖對DPPH自由基的清除率Fig.4 DPPH radical scavenging efficiency of Flammulina velutipes polysaccharides

2.6FVPp、Zn-FVP對O2－?的清除能力

圖5　金針菇多糖對OO2－·的清除率Fig.5 Superoxide anion radical scavenging efficiency of Flammulina velutipes polysaccharide

O2－?是生物體內(nèi)最重要的自由基之一。如圖5所示，各組O2－?清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大。在同等質(zhì)量濃度條件下，O2－?清除能力由強(qiáng)到弱排序?yàn)?/p>

VC＞Zn-FVP＞FVPp。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果表明，F(xiàn)VPp、

Zn-FVP的O2－?清除能力在α＝0.05水平上差異顯著。在質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時，與FVPp相比，Zn-FVP的O2－?清除率提高了20%。

2.7FVPp、Zn-FVP對?OH的清除能力

圖6　金針菇多糖對·OH的清除率Fig.6 Hydroxyl radical scavenging efficiency of Flammulina velutipes polysaccharide

采用Fenton體系產(chǎn)生?OH，水楊酸法檢測樣品清除?OH的能力。如圖6所示，各組?OH清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大。FVPp與Zn-FVP的?OH清除能力均弱于VC，Zn-FVP略強(qiáng)于FVPp。這可能是由于Zn能夠阻斷金屬離子如Fe3＋、Cu2＋與H2O2和超氧化物反應(yīng)產(chǎn)生?OH，防止在金屬離子的作用過程中形成羥基基團(tuán)，進(jìn)而阻止了因金屬離子的催化生成的?OH對機(jī)體組織產(chǎn)生的破壞作用[30]。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果表明，F(xiàn)VPp與Zn-FVP的?OH清除能力在α＝0.05水平上差異顯著。

2.8FVPp、Zn-FVP對H2O2的清除能力

圖7　金針菇多糖對HH2O2的清除率Fig.7 Hydrogen peroxide scavenging efficiency of Flammulina velutipes polysaccharide

如圖7所示，各組的H2O2清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大。在金針菇多糖同等質(zhì)量濃度條件下，對H2O2的清除能力由強(qiáng)到弱排序?yàn)閂C＞Zn-FVP＞FVPp。

FVPp與Zn-FVP 的H2O2清除率在α＝0.05水平上差異不顯著。在質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL時，VC、FVPp與Zn-FVP的H2O2清除率分別為92.73%、39.59%、42.73%。含有Zn的豬苓多糖比不含Zn的豬苓多糖體外抗氧化能力高[31]，這與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)論相一致，說明Zn含量較高有利于提高多糖對H2O2的清除能力，引起這一現(xiàn)象的原因可能是Zn2＋與多糖分子結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生自由基所必需的醇羥基絡(luò)合在一起，使自由基的產(chǎn)生被抑制。

3　結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)VP螯合Zn2＋后，其對DPPH自由基、O2－?、?OH、H2O2的清除率均有所提高。通過幾組成分抗氧化活性能力的檢測與其Zn含量的對比，可以初步得出多糖體外抗氧化活性與樣品中Zn含量密切相關(guān)的結(jié)論。Zn2＋質(zhì)量濃度越大，Zn含量越高，多糖清除自由基的能力越強(qiáng)，抗氧化活性越高[32]。金針菇多糖與Zn2＋的螯合增強(qiáng)了多糖的抗氧化活性。

本實(shí)驗(yàn)通過小鼠成纖維肉瘤細(xì)胞L929培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)VPc及其純化組分FVPp在質(zhì)量濃度為5～50 μg/mL時對L929細(xì)胞的抑制率不大，F(xiàn)VPc對L929細(xì)胞無抑制作用，F(xiàn)VPp有微弱的抑制作用，在質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，L929細(xì)胞存活率為98.93%。Zn-FVP對L929細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用，在質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，L929細(xì)胞存活率為17.33%。而以FVPc、其純化組分FVPp及其螯合后的Zn-FVP培養(yǎng)RAW 264.7巨噬細(xì)胞，其上清液對L929細(xì)胞抑制率有顯著提高。FVPc、FVPp、Zn-FVP在質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，L929細(xì)胞存活率分別為83.52%、78.37%、3.97%，與3 種金針菇多糖直接作用于L929細(xì)胞相比，抑制率分別增強(qiáng)了27.35%、20.79%、77.07%。金針菇多糖介導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞上清液對L929細(xì)胞的抑制率明顯提升。多糖抗腫瘤的機(jī)理可能是通過活化巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞因子分泌或活化補(bǔ)體等從而間接性發(fā)揮抗腫瘤免疫作用，但還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證明金針菇多糖介導(dǎo)的RAW 264.7巨噬細(xì)胞上清液對L929細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用的機(jī)理。

Zn-FVP表現(xiàn)出了良好的抗氧化活性與抗腫瘤細(xì)胞增殖作用，這為Zn-FVP產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了科學(xué)依據(jù)，它有望成為一種有效的保健藥物。

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Effect of Flammulina velutipes Polysaccharide-Zn2+Chelate on Suppression of L929 Tumor Cell Proliferation and Its Antioxidant Activity

ZHAO Shuwen1,XIA Yu1,CHEN Guitang2,HU Qiuhui1,3,ZHAO Liyan1,*
(1.College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China; 2.College of Engineering,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China; 3.College of Food Science and Engineering,Nanjing University of Finance and Economics,Nanjing 210046,China)

Abstract:The antitumor effect and antioxidant activity of purified polysaccharide from Flammulina velutipes before and after chelation with Zn2+were evaluated.To investigate the antitumor effect of the polysaccharide-Zn2+chelate on the proliferation of L929 tumor cells,methlthiazolyl tetrazolium(MTT)experiments were carried out and the morphology of L929 cells was observed with different concentrations of polysaccharide.The results showed that crude and purified polysaccharide at concentrations of 5–50 μg/mL had little impact on the growth of L929 cells,while the polysaccharide-Zn2+chelate played an important role in the inhibition of cell growth.Furthermore,the supernatant of macrophages co-cultured with Flammulina velutipes polysaccharides could kill L929 cells.Moreover,the antioxidant activity was improved after the chelation with Zn2+.This study demonstrated that zinc chelation could enhance the antioxidant activity of purified polysaccharide from Flammulina velutipes.

Key words:Flammulina velutipes polysaccharide; chelation; Zn2+; L929 cell; antioxidant activity

中圖分類號：TS201.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）05-0202-06

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201605036

*通信作者：趙立艷（1977—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)化學(xué)。E-mail：zhlychen@njau.edu.cn

作者簡介：趙姝雯（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)化學(xué)。E-mail：2013108035@njau.edu.cn

基金項(xiàng)目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（食用菌）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-24）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31101255）

收稿日期：2015-09-11