基于膠乳增強免疫比濁法的食物過敏原檢測試劑盒方法學(xué)的建立及臨床應(yīng)用評價①

盧玲玲　鄭國軍　涂斐佩　吳海鷗　林曉瓊

(瑞安市中醫(yī)院檢驗科，瑞安325200)

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基于膠乳增強免疫比濁法的食物過敏原檢測試劑盒方法學(xué)的建立及臨床應(yīng)用評價①

盧玲玲鄭國軍②涂斐佩吳海鷗林曉瓊

(瑞安市中醫(yī)院檢驗科，瑞安325200)

[摘要]目的：建立基于膠乳增強免疫比濁法的食物過敏原檢測試劑的方法并應(yīng)用于臨床。方法：采用膠乳增強免疫比濁法，對檢測體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線、最低檢測量、穩(wěn)定性、精密度、干擾實驗等相關(guān)性能指標(biāo)進(jìn)行評價，通過檢測健康體檢人員及臨床過敏人群血液標(biāo)本并與目前應(yīng)用于臨床的較成熟的ELISA方法進(jìn)行比對，評價膠乳增強免疫比濁法的食物過敏原檢測試劑的臨床應(yīng)用可行性。結(jié)果：該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=837.1x2-125.2x+10.036，線性范圍：0～400 U/ml，相關(guān)系數(shù)為0.996，最低檢測限為19.600 U/ml。批內(nèi)、批間精密度均<10%。該方法的正常參考范圍為<33.5 U/ml，敏感度89.61%，特異性65.22%，準(zhǔn)確度84.00%，陽性預(yù)示值89.61%，陰性預(yù)示值65.22%，ROC的曲線下面積(AUC)為0.957，該方法與目前應(yīng)用較廣泛的ELISA法具有很強的相關(guān)性(r=0.890 2)。結(jié)論：膠乳增強免疫比濁法的食物過敏原檢測試劑符合臨床診斷的相關(guān)要求，可應(yīng)用于臨床食物過敏性患者的診斷及疾病監(jiān)測。

[關(guān)鍵詞]膠乳;免疫比濁;方法學(xué);過敏原

過敏疾病為常見病、多發(fā)病，嚴(yán)重時可造成過敏性休克，甚至危及生命，約35%的過敏反應(yīng)由食物誘發(fā)。其中我市近年來病史資料查詢顯示，蟹過敏人數(shù)較多，呈遞增趨勢。

本項目擬采用乳膠增強法進(jìn)行國產(chǎn)化的蟹食物過敏原檢測試劑盒的開發(fā)。替代現(xiàn)有食物過敏原ELISA檢測試劑盒，此新型的產(chǎn)品可以用于遲發(fā)相食物過敏反應(yīng)的臨床診斷，檢測食物過敏原，為預(yù)防和治療過敏反應(yīng)，排除類似過敏癥狀慢性疾病的誤診提供輔助診斷依據(jù)。并且在此項目建立的基礎(chǔ)方法上我們將繼續(xù)展開其他類型食物過敏原的檢測項目。本項目的開展為加強食品安全檢測提供技術(shù)支持，提升我國食品安全的發(fā)展具有非常重要的意義。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1臨床標(biāo)本選取2013年6月至2015年6月在瑞安人民醫(yī)院及瑞安市中醫(yī)院蟹過敏患者100例，健康體檢人員100例，采集他們的血清標(biāo)本置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2試劑和儀器主要試劑：浙江天科高新技術(shù)發(fā)展有限公司制備：蛋白緩沖液：25 mmol/L磷酸鹽緩液(pH7.2～7.4)，蟹蛋白過敏原致敏乳膠顆粒2.5 mg/ml；校準(zhǔn)品人IgG(400 U/ml)購自杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司[校準(zhǔn)品溯源自 WHO International Stardard :Immunoglobulins G, A and M, human serum (67/086)]；主要儀器：貝克曼庫爾特IMMAGE 800特定蛋白分析：美國。

1.2分析性能評價

1.2.1試劑穩(wěn)定性檢測將標(biāo)準(zhǔn)品人IgG稀釋成5個濃度(0、50、100、200、400 U/ml)來驗證蟹蛋白過敏原致敏乳膠顆粒的穩(wěn)定性。分別檢測蛋白緩沖液與致敏乳膠顆粒在37℃/7 d、4℃/30 d、4℃/180 d的穩(wěn)定性。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線將人IgG標(biāo)準(zhǔn)蛋白稀釋成0 U/ml(A)、6 U/ml(B)、30 U/ml(C)、150 U/ml(D)、400 U/ml(E)5個點，測試5次，由貝克曼庫爾特IMMAGE 800特定蛋白分析自帶軟件繪制蟹蛋白的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3最低檢測限與空白值空白檢測限使用的是無蟹蛋白的血清標(biāo)本；最低檢測限采用無過敏性疾病的健康體檢人員血清標(biāo)本，稀釋5倍后檢測。最低檢測限與空白檢測標(biāo)本均分為兩個批次，連續(xù)5 d檢測6次。本方法嚴(yán)格按照國際臨床化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)EP17-A進(jìn)行。

1.2.4分析不精密度分別檢測三個批次(標(biāo)記為20150110、20150210和20150710)的試劑檢測三種蛋白高、低兩個濃度(200 U/ml，20 U/ml)各3次/d，連續(xù)20 d，分別計算批內(nèi)及批間的變異系數(shù)。本方法嚴(yán)格按照國際臨床化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)委員會(NCCLS)EP5-A2進(jìn)行。

1.2.5交叉反應(yīng)分別選擇雞蛋、蝦、牛奶的等食物IgG陽性、蟹IgG陰性的血清標(biāo)本,與蟹蛋白過敏原致敏乳膠顆粒同時檢測，照上述實驗方法測定吸光度OD值，在同樣條件下同時檢測單一蟹IgG陽性的標(biāo)本,作為基礎(chǔ)樣品測定值,計算與其他種類食物IgG的交叉反應(yīng)情況。

1.2.6干擾實驗將相當(dāng)于甘油三酯濃度為2.00、3.00、4.00、5.00 mmol/L的橄欖油乳劑，血紅蛋白含量為0.5、1.5、2.5、5 g/L的血紅蛋白溶血液加到蟹IgG濃度為200 U/L的血清中,測定蟹IgG濃度，將實際測定值與理論預(yù)期值相比較，以誤差大于10%為判斷標(biāo)準(zhǔn)，觀察脂血及溶血對該方法的影響。

1.2.7正常參考范圍檢測100份正常體檢無明顯臨床疾病血清標(biāo)本[男∶女=60∶40，年齡(39.03±15.98)歲]，確定檢測蟹食物蛋白的正常參考范圍。

1.2.8方法學(xué)比較分別將100份蟹食物蛋白標(biāo)本進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA，儀器奧地利BioTek-Elx800，試劑批號：1505007)和PETIA(膠乳增強免疫比濁法)檢測，檢測結(jié)果進(jìn)行線性回歸計算其相關(guān)系數(shù)

2結(jié)果

2.1蟹蛋白過敏原致敏乳膠顆粒的穩(wěn)定性檢測試劑在37℃/7 d、4℃/30 d、4℃/180 d均保持穩(wěn)定。結(jié)果見表1。

2.2最低檢測限與空白值最低檢測限(LoD)為19.600 U/ml，空白檢測限(LoB)為13.241 U/ml；(計算公式：LoD: 13.241±2×3.844, LoD=LoB+2SD LoB:7.102 7±3.711 3, LoB=average+2SD)。所有檢測數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布。

2.3檢測范圍與標(biāo)準(zhǔn)曲線以吸光度值OD為橫坐標(biāo),以IgG的濃度為縱坐標(biāo),進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合,其劑量-反應(yīng)曲線見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=837.1x2-125.2x+10.036相關(guān)系數(shù)為0.996，線性范圍為0～400 U/ml。

表1試劑穩(wěn)定性

Tab.1Stability of reagent

Proposedconcentration37℃OD7dconcentration(U/ml)4℃OD30dconcentration(U/ml)37℃OD180dconcentration(U/ml)A(0U/ml)0.0237.590.0316.960.0138.55B(50U/ml)0.29244.850.31955.280.32457.35C(100U/ml)0.39189.060.40596.640.38988.00D(200U/ml)0.562204.070.582220.720.549193.60E(400U/ml)0.765404.150.761399.540.785427.60

表2批內(nèi)精密度

Tab.2Results of intra-assay precision

Proposedconcentration(U/ml)20150110IgG(U/ml)CV(%)20150210IgG(U/ml)CV(%)20150710IgG(U/ml)CV(%)20.022.52±1.787.925.35±2.289.018.79±1.548.2200212.08±18.678.8190.95±15.288.0219.06±15.557.1

表3批間的精密度(n=3×8)

Tab.3Results of inter-assay precision (n=3×8)

Additionalconcentration(U/ml)IgG(U/ml)CV(%)20.025.88±1.716.6200209.69±17.048.3

表4不同食物間交叉反應(yīng)率

Tab.4Cross-reactivity rate of different kinds of food

Antigentypescross-reactionrate(%)EggShrimpMilkSoybeanBeefPorkCrab6.137.313.022.783.252.56

表5蟹IgG(200 U/ml)濃度中加入干擾物后預(yù)測值與實測值的比較

Tab.5Comparison of predicted values and measured values after Crab IgG(200 U/ml ) joining distractors

Crab-IgGconcentration(U/ml)Triglycerideconcentration(mmol/L)2345Hemoglobinconcentration(g/L)0.51.52.55Predictedvalue200200200200200200200200Measuredvalue195189193179192193188175Error2.55.53.510.54.03.56.012.5

圖1　蟹蛋白過敏原膠乳免疫增強檢測法標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1　Crab protein standard curve of PETIA

2.4精密度交叉反應(yīng)高低兩個IgG濃度的變異系數(shù)(CV)分別為：批號20150110為7.9%和8.8%；批號20150210為9.0%和8.0%；批號20150710為8.2%,7.1%。批間變異系數(shù)分別為6.6%,8.3%；甘油三酯濃度在5.00 mmol/L以上，血紅蛋白濃度在5g/L以上對蟹IgG檢測濃度產(chǎn)生影響。見表2～5。

2.5參考范圍所有檢測數(shù)據(jù)均呈正態(tài)分布，其平均值為12.02 U/ml，標(biāo)準(zhǔn)差為10.753，得出膠乳免疫增強比濁法檢測血清特異性蟹IgG的95%可信區(qū)間為<33.5 U/ml。將血清中蟹特異性IgG值大于33.5 U/ml的患者認(rèn)定為陽性。見圖2。

圖2　蟹血清特異性IgG正態(tài)分布圖Fig.2　Eyes crab serum specific IgG normal distribution

2.6ROC工作曲線收集100份蟹過敏性患者血清(男∶女=46∶54，年齡1～36歲)。結(jié)合臨床，共有77名患者確診為蟹過敏性疾病。膠乳免疫增強比濁法的敏感度89.61%，特異性65.22%，準(zhǔn)確度84.00%，陽性預(yù)示值89.61%，陰性預(yù)示值65.22%(表6)。ROC的曲線下面積(AUC)為 0.957 (圖3)。

2.7方法學(xué)比較收集100份患者血清，用PETIA法以及臨床在用的ELISA法同時進(jìn)行檢測?；貧w方程為Y=1.264x+27.599(Y為ELISA法結(jié)果，x為PETIA法結(jié)果)，相關(guān)系數(shù)為0.890 2(圖4)。線性回歸結(jié)果表明，兩者具有良好的相關(guān)性，該結(jié)果表明我們新創(chuàng)的PETIA法可用于臨床血清標(biāo)本中蟹食物過敏原。

表6PETIA方法的敏感性和特異性

Tab.6Sensitivity and specificity of PETIA

ClinicaldiagnosisofallergiesTotal+-CrabIgG+69877-81523Total7723100

圖3　PETIA ROC曲線Fig.3　ROC curve of PETIA

圖4　ELISA和PETIA方法比較的線性回歸圖Fig.4　Comparison between ELISA and PETIA

3討論

膠乳增強免疫比濁法(PETIA)是近年來出現(xiàn)的一種較為穩(wěn)定、準(zhǔn)確的體液蛋白均相免疫比濁檢測方法[1-3]。是在高分子膠乳微球的表面交聯(lián)抗體或抗原，當(dāng)交聯(lián)有抗體或抗原的微球與抗原或抗體結(jié)合后，在短時間內(nèi)會迅速聚集在一起，改變了反應(yīng)液的散光性能或透光性能。而且，反應(yīng)液散光性能或透光性能(即吸光度)的改變與被測抗原或抗體的濃度有較強的相關(guān)性,在一定范圍內(nèi)可以反映被測物的濃度。PETIA法操作步驟的簡化也相應(yīng)地避免了許多人為操作因素和試劑、環(huán)境等外界因素的干擾，穩(wěn)定性和重復(fù)性都較好，能較真實地反映被測物質(zhì)的含量，從而能更好地幫助醫(yī)生正確地診斷過敏原，并判定該過敏原的致敏反應(yīng)程度。目前國外關(guān)于食物過敏原診斷試劑盒都生產(chǎn)企業(yè)主要有瑞典Pharmacia Diagnostis、英國GENESIS、美國BIOMERICA和德國MEDIWISS等公司，而國內(nèi)主要是杭州浙大迪迅生物基因工程有限公司等公司。這些診斷試劑公司的食物過敏原診斷試劑盒都主要采用ELISA方法[3-12]。

該方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=837.1x2-125.2x+10.036，線性范圍：0～400 U/ml，相關(guān)系數(shù)為0.996，本實驗建立的蟹食物蛋白PETIA檢測法，具有靈敏、特異、操作簡單、快速、穩(wěn)定且易自動化操作等優(yōu)點，能夠滿足臨床應(yīng)用的要求：在表1我們看出，經(jīng)4℃/7 d，37℃/30 d與半年時間檢測，所得檢測數(shù)據(jù)與曲線沒有明顯差異及偏移；方法靈敏，最低檢測限(LoD)為19.600 U/ml。線性范圍較寬：0～40 U/ml，相關(guān)系數(shù)為0.996，批內(nèi)以及批間的變異系數(shù)均低于10%；在臨床應(yīng)用上，第一，我們獲得參考范圍95%可信區(qū)間為<33.5 U/ml。將血清中蟹IgG水平大于33.5 U/ml的患者認(rèn)定為蟹食物過敏原陽性；第二，該方法的敏感度89.61%，特異性65.22%，準(zhǔn)確度84.00%，陽性預(yù)示值89.61%，陰性預(yù)示值65.22%,甘油三酯濃度在5.00 mmol/L以下，血紅蛋白濃度在5 g/L以下對蟹IgG檢測濃度影響不大，ROC的曲線下面積(AUC)為0.957。第三，收集的100份患者血清，進(jìn)行PETIA與ELISA法進(jìn)行結(jié)果比對，顯示回歸方程為Y=1.264x+27.599(Y為ELISA法結(jié)果，x為PETIA法結(jié)果)，相關(guān)系數(shù)為0.890 2，兩者具有良好的相關(guān)性，由該結(jié)果可見我們新創(chuàng)的膠乳免疫增強比濁法可用于臨床血清標(biāo)本中蟹食物蛋白過敏原的檢測，從而預(yù)示患者過敏狀態(tài)的發(fā)生發(fā)展。所以我們建立的蟹食物蛋白過敏原膠乳免疫增強比濁法，符合2010版《中國藥典》中有關(guān)體外診斷試劑的應(yīng)用要求[13]。但也存在很多不足，如，我們改進(jìn)了實驗方法，但在檢測范圍上與其他檢測方法相比并未改進(jìn)；其次在臨床評價上選取的標(biāo)本例數(shù)100例，還需進(jìn)一步檢測，來提高方法的陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值以及方法的靈敏度與特異性。

參考文獻(xiàn)：

[1] 郁新.乳膠增強免疫比濁法測定血清Lp(a)[J].江西醫(yī)學(xué)檢驗,2007,25(5):433-434.

[2] 于德軍,蒙凱.乳膠增強免疫比濁法測定血清胱抑素C[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2011,8(10): 1159 -1160, 1163.

[3] 陳建文，張凡，劉玉俠,等.乳膠增強免疫比濁法測定血清肌鈣蛋白I的實驗探討[J].中華全科醫(yī)學(xué),2013,11(11):1777-1778.

[4] 馮彥娟,袁娟麗,佟平,等.大豆過敏原的檢測方法研究進(jìn)展[J].食品科學(xué),2012,33 (23):365-369.

[5] 廖萬清,孟云芳.蛋白質(zhì)過敏原與食物過敏[J].空軍醫(yī)學(xué)雜志,2013,29(1):5-7.

[6] 馬超,王偉,吳玉紅.慢性蕁麻疹患者過敏原特異性IgE與特異性IgG分析[J].安徽醫(yī)學(xué),2014,35(2): 183-186.

[7] 周煌, 楊安樹, 佟平,等.食物過敏原標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2012,33 (23):438-443.

[8]閆飛, 廖志勇, 吳志華,等.食物過敏原蛋白的定量檢測方法[J].食品科學(xué),2010, 31(19): 426-429.

[9] 徐國強,倪海東,楊明,等.食物過敏原蛋白家族分類及其結(jié)構(gòu)特點[J].檢驗檢疫學(xué)刊,2012,22(5): 66-70,76.

[10]顧可飛,李春紅,高美須,等.食物過敏原及檢測技術(shù)的研究進(jìn)展[J].食品科技,2006,(8):1-5.

[11] 陳穎,王瑋.食物過敏原檢測方法研究進(jìn)展[J].檢驗檢疫學(xué)刊,2011,21(3):4-7,19.

[12] 石良, 王錫昌, 劉源.食物過敏原免疫學(xué)檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].分析測試學(xué)報,2010, 29(9): 981-986.

[13]中國藥物化學(xué)委員會.《中國藥典》體外診斷試劑規(guī)程2010 版[J].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：1-200.

[收稿2015-07-16修回2015-11-25]

(編輯張曉舟)

Development and application of Latex enhanced immune turbidimetry for food allergen

LULing-Ling,ZHENGGuo-Jun,TUFei-Pei,WUHai-Ou,LIUXiao-Qiong.

RuianHospitalofTraditionalChineseMedicine,Ruian325200，China

[Abstract]Objective:To establish a method to detect food allergen based on Latex-enhanced immune turbidimetry (PETIA) and apply to clinic.Methods: The PETIA method was used for evaluating the detection system including standard curve, detection-limit,stability, intra-assay and inter-assay precision and cross-reactivity,clinical normal serum specimens and clinical allergic diseases serum specimens were measured to evaluated the perspective of the clinical application.Results: The standard curve :Y=837.1x2-125.2x+10.036, linear range: 0.0-400 U/ml,the correlation coefficient of the standard curve was 0.996,the intrabatch and interbatch precision was<10%.The normal reference range was≤33.5 U/ml,the AUC of ROC curve was 0.957,the sensitivity was 89.61%,The specificity was 65.22%，the accuracy was 84.00%, and the positive predicted value was 89.61%,the negative predicted value was 65.22%.the test results have strong correlation with ELISA (r=0.890 2).Conclusion: The PETIA method for detecting food allergen achieved corresponding clinical application standards and may be used for the diagnosis of food allergies.

[Key words]Latex;Immunonephelometry;Methodology;Allergen

中圖分類號R383.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號1000-484X(2016)03-0377-05

作者簡介：盧玲玲(1984年-)，女，碩士，主管檢驗師，主要從事臨床診斷學(xué)研究。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.018

①本文為瑞安市科技局項目(No.MS2015042)。

②瑞安市人民醫(yī)院檢驗科，瑞安325200。