T細(xì)胞疫苗抑制了Flt3-L介導(dǎo)的小鼠肝移植急性排斥反應(yīng)①

趙振林　趙晨野　謝燕兵　楊　波　蘇繼榮

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院普外科,太原030001)

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T細(xì)胞疫苗抑制了Flt3-L介導(dǎo)的小鼠肝移植急性排斥反應(yīng)①

趙振林趙晨野②謝燕兵楊波蘇繼榮

(山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院普外科,太原030001)

[摘要]目的：探討供體抗原特異性T細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)肝移植免疫耐受的作用及其機(jī)理，同時(shí)對(duì)肝移植“自動(dòng)耐受”機(jī)制進(jìn)行探討。方法：以CBA小鼠作為受體，以B6小鼠作為供體，建立小鼠原位肝移植模型；制備T細(xì)胞疫苗：用B6小鼠的脾細(xì)胞免疫CBA小鼠，取CBA小鼠的脾淋巴細(xì)胞加以滅活，制備成T細(xì)胞疫苗(TCV)備用；實(shí)驗(yàn)分為3組：組1:單純移植組，以CBA小鼠作為受體，以B6小鼠作為供體，做原位肝移植。組2:用Flt3-L治療的B6小鼠作為供體，以CBA小鼠作為受體，做原位肝移植。組3:用Flt3-L治療的B6小鼠作為供體，以TCV免疫過(guò)的CBA小鼠作為受體，進(jìn)行原位肝移植。組間比較移植物存活時(shí)間(MST)；測(cè)定肝移植小鼠血清中的IL-10、IL-4和IFN-γ水平；組內(nèi)比較移植前后單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)；分離移植物浸潤(rùn)細(xì)胞(GICs)組間比較GICs凋亡率。結(jié)果：Flt3-L誘導(dǎo)了同種移植急性排斥反應(yīng)，應(yīng)用TCV于移植前和移植后可以顯著抑制Flt3-L誘導(dǎo)的同種肝移植排斥反應(yīng)。在沒(méi)有Flt3-L刺激作用的情況下移植排斥反應(yīng)非常輕微。肝移植小鼠血清中的IL-10、IL-4和IFN-γ水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lt3-L治療組IFN-γ水平顯著升高，IL-10、IL-4水平降低；TCV免疫組IL-10、IL-4水平顯著升高，IFN-γ水平顯著下降；單純移植自動(dòng)耐受組與TCV免疫組變化趨勢(shì)一致。單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)顯示：在單純移植組，淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)不明顯，CPM為3 318±1 190；在Flt3-L治療組，效應(yīng)細(xì)胞增殖顯著增強(qiáng),CPM 為9 790±1 369，在TCV免疫組，TCV免疫加Flt3-L治療，淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)被顯著抑制，CPM為4 017±880。分離肝臟移植物內(nèi)浸潤(rùn)細(xì)胞凋亡，TCV免疫組引起TIL凋亡率為(54.20±3.12)%，有效抑制了TIL引起的免疫排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)了免疫耐受。而在Flt3-L治療組，TIL凋亡率為(3.34±2.49)%。結(jié)論：小鼠同種肝移植存在“自動(dòng)耐受”現(xiàn)象；這種“自動(dòng)耐受”現(xiàn)象的免疫平衡可以被Flt3-L打破，從而誘發(fā)急性排斥反應(yīng)。針對(duì)排斥效應(yīng)T細(xì)胞的特異性T細(xì)胞疫苗可以顯著抑制Flt3-L誘導(dǎo)的同種肝移植排斥反應(yīng)。

[關(guān)鍵詞]T細(xì)胞疫苗； 同種移植；免疫耐受；肝移植

針對(duì)移植供體的特異性T淋巴細(xì)胞是同種移植免疫排斥的效應(yīng)細(xì)胞，如果能將這些效應(yīng)細(xì)胞清除或有效抑制，則可以防止免疫排斥的發(fā)生。本文作者長(zhǎng)期致力于T細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)移植免疫耐受的研究[1]，其基本策略是用供體器官抗原刺激受體誘導(dǎo)體產(chǎn)生排斥性T細(xì)胞，再將這些T細(xì)胞分離滅活，制備成T細(xì)胞疫苗，在移植前和移植后用TCV 免疫受體動(dòng)物，誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)排斥效應(yīng)T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，從而達(dá)到抑制或清除反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞,誘導(dǎo)特異性移植耐受的作用[2,3]。因?yàn)樾∈蟾我浦簿哂凶詣?dòng)接受現(xiàn)象，本研究選擇小鼠原位肝移植模型，對(duì)研究移植免疫耐受具有重要價(jià)值。本研究設(shè)計(jì)旨在比較同種肝移植在發(fā)生急性排斥反應(yīng)、發(fā)生自動(dòng)耐受、應(yīng)用T細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)免疫耐受三種狀態(tài)下的免疫機(jī)制，進(jìn)一步探討T細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)同種移植免疫耐受的方法和機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以CBA小鼠作為受體，以B6小鼠作為供體，建立小鼠原位肝移植模型清潔級(jí),以上動(dòng)物由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2試劑及藥品Flt3-L(PeproTech EC Ltd.)；Annexin V-FITC(BD Biosciences)； Con A、淋巴細(xì)胞分離液、RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液胎牛血清(華美公司)；絲裂霉素(Kyowa hakko co Ltd.)；3H-TDR(北京原子能研究所)。

1.2方法

1.2.1T細(xì)胞疫苗制備(TCV)制備B6小鼠的肝細(xì)胞懸液，按照1×106/次腹腔注射，連續(xù)3次，每周1次，于第3次免疫后第5天，分別取出被免疫的CBA小鼠的脾臟，用密度梯度離心法分離脾淋巴細(xì)胞，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2×105ml-1，加Con A 2.5 μg/ml,混合后移至100 ml的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)(10 ml/瓶)，置5%CO237℃孵箱中培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，然后加入絲裂霉素C(25 μg/ml)處理滅活細(xì)胞(37℃水浴45 min)，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度到1×108ml-1，制成供體特異性T淋巴細(xì)胞疫苗(TCV)凍存?zhèn)溆?。

1.2.2Flt3-L治療B6小鼠于移植前3周給B6小鼠皮下注射Flt3-L,1 mg/kg,每周1次，連續(xù)3周。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組及原位肝移植，統(tǒng)計(jì)移植物平均存活時(shí)間 (Mean survival time,MST)組1:單純移植組，以CBA小鼠作為受體，以B6小鼠作為供體，做原位肝移植。組2:用Flt3-L治療的B6小鼠作為供體，以CBA小鼠作為受體，做原位肝移植。組3:用Flt3-L治療的B6小鼠作為供體，以TCV免疫過(guò)的CBA小鼠作為受體，進(jìn)行原位肝移植。

肝移植手術(shù)屬于清潔型手術(shù)，乙醚麻醉，應(yīng)用三袖套法進(jìn)行小鼠原位肝移植,參見(jiàn)文獻(xiàn)[4]。術(shù)后肌注青霉素40萬(wàn)U，3 d內(nèi)單籠喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)小鼠肝移植無(wú)肝期要求無(wú)肝期小于20 min,手術(shù)順利，術(shù)后正常蘇醒，能活動(dòng)，非排斥性原因致死者除外。

1.2.4單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MCR)(3H-TDR摻入法)移植后第5天進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)，反應(yīng)細(xì)胞為經(jīng)TCV 免疫后的CBA小鼠的脾T淋巴細(xì)胞，刺激細(xì)胞為滅活的B6小鼠脾T淋巴細(xì)胞，兩者濃度均為1×106ml-1，取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入反應(yīng)細(xì)胞100 μl，刺激細(xì)胞100 μl，每份標(biāo)本設(shè)三復(fù)孔，在含體積分?jǐn)?shù)為5%CO237℃ 飽和濕度下培養(yǎng)96 h，終止培養(yǎng)前18 h每孔加入1 μg3H-TDR。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞于玻璃纖維濾紙上，用蒸餾水反復(fù)沖洗，將樣品濾紙置于60℃～80℃的烤箱內(nèi)烘干，將紙片分別置于閃爍瓶中，每瓶加閃爍液5 ml，用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)定每分鐘脈沖數(shù)值(cpm值) 。

1.2.5肝臟移植物內(nèi)浸潤(rùn)細(xì)胞分離和GICs凋亡測(cè)定于移植后3 d取肝臟移植物應(yīng)用原位灌注及膠原酶消化法[3]分離肝臟NPC(Nonparenchymal cells)，用0.09%EGTA液經(jīng)門-腔靜脈原位灌注后再用0.05%、含Ca+的Ⅵ型膠原酶灌注,無(wú)菌取下肝臟,剪碎后,用Ⅵ型膠原酶消化,用200目鋼絲網(wǎng)過(guò)濾,制備成細(xì)胞懸液,用RPMI1640培養(yǎng)液洗滌兩次,用Percoll液(比1.079,Sigma公司)分離,收集中層細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)拒染法鑒定活細(xì)胞>95%。取肝臟NPC用PBS液洗滌兩次,用陽(yáng)性磁珠分離法分離CD3陽(yáng)性T細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106ml-1，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，取每一管標(biāo)本100 μl細(xì)胞,加AnnexinV-FITC 5 μl和 PI 5 μl，常溫避光孵育15 min后，加400 μl結(jié)合液，用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becion Dickinson)分析。

2結(jié)果

2.1各組肝移植后大鼠存活時(shí)間(MST)在移植對(duì)照組，MST為(41.9±3.0)d；在Flt3-L治療組，MST為(6.7±2.4)d；而在Flt3-L加TCV組MST為(80.7±10.2)d，移植物存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)，與Flt3-L治療組比較P<0.01，見(jiàn)圖1。

2.2移植小鼠血清中的IL-10、IL-4和IFN-γ水平測(cè)定測(cè)定肝移植小鼠血清中的IL-10、IL-4和IFN-γ水平，并設(shè)正常對(duì)照。Flt3-L治療組IFN-γ水平顯著升高，IL-10、IL-4水平降低；TCV免疫組IL-10、IL-4水平顯著升高，IFN-γ水平顯著下降；單純移植自動(dòng)耐受組與TCV免疫組趨勢(shì)一致。見(jiàn)圖2。

2.3單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)結(jié)果于移植后第3天進(jìn)行單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),應(yīng)用3H-TDR摻入法,最后用液體閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)得每分鐘脈沖數(shù)值(cpm值)。在單純移植組，淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)不明顯，為3 318±1 190；在Flt3-L治療組，效應(yīng)細(xì)胞增殖顯著增強(qiáng)到9 790±1 369;Flt3-L +TCV組，淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)被顯著抑制， cpm為4 017±880,與單純移植物比較無(wú)顯著差異，和Flt3-L治療組比較顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖3。

圖1　各組肝移植后大鼠存活時(shí)間(MST)Fig.1　Mean survival time (MST) after liver transplanta-tion in three groupNote: TCV vaccination significantly prolonged the grafts mean survival time (MST) in TCV group , but Flt3-L mediated acute immune rejection against the liver grafts which result in shortened MST compared with the TCV group and transplant control.

2.4肝臟移植物內(nèi)浸潤(rùn)細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝臟移植物內(nèi)浸潤(rùn)T細(xì)胞凋亡情況：TCV免疫組引起GICs凋亡率為(54.20±3.12)%，顯著有效抑制了GICs引起的免疫排斥反應(yīng)，誘導(dǎo)了免疫耐受。而在Flt3-L治療組，GICs凋亡率為(3.34±2.49)%。見(jiàn)圖4，表1。

圖2　肝移植小鼠血清中的IL-10、IL-4和IFN-γ水平測(cè)定Fig.2　Serum value of IL-10,IL-4 and IFN-γ after liver transplantationNote: TCV induced incresed production of IL-4 and IL-10 but depressed the production of IFN-γ in TCV group; Flt3-L mediated acute rejection with incresed IFN-γ and reduced IL-4 and IL-10.

圖3　單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)Fig.3　Cpm value of one-way mixed lymphocyte reaction in three groups after transplantation(MLR)Note: The TCV depressed the responding T cells proliferation which may contribute to the inducing immune tolerance .Flt3-L stimulated the proliferation of responding T cells.

表1肝臟移植物浸潤(rùn)細(xì)胞凋亡

Tab.1Apoptosis rate of liver graft infiltrating cells

GroupsGroups1Groups2Groups3Apoptosis(%)7.92±2.253.34±2.491)54.20±3.121)

Note：1)P<0.01 versus group 1.

圖4　肝臟移植物內(nèi)浸潤(rùn)細(xì)胞凋亡Fig.4　Apoptosis of liver graft infiltrating cells:TCV induced incresed apoptosis of GICs in TCV group，The percentage of apoptosis of GICs was markedly increased in Flt3-L+TCV group in comparison with Flt3-L group.

3討論

器官移植后發(fā)生急慢性免疫排斥仍然是器官移植面臨的主要難題，盡管目前應(yīng)用免疫抑制劑可以有效抑制急性免疫排斥反應(yīng)，但免疫抑制劑帶來(lái)的毒副作用嚴(yán)重影響了患者的重要臟器功能和患者的生存質(zhì)量[5]，因此探討誘導(dǎo)特異性移植免疫耐受是目前移植免疫研究的核心問(wèn)題。研究小鼠肝移植自動(dòng)耐受現(xiàn)象的機(jī)理對(duì)探討誘導(dǎo)同種免疫耐受方法具有重要價(jià)值，本研究以小鼠原位肝移植作為研究模型，發(fā)現(xiàn)小鼠同種肝移植存在自動(dòng)耐受現(xiàn)象，在沒(méi)有任何免疫干預(yù)的情況下可以不發(fā)生排斥反應(yīng)，同時(shí)移植物內(nèi)無(wú)明顯炎性浸潤(rùn)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)用Flt3-L刺激B6小鼠介導(dǎo)了同種肝移植急性排斥反應(yīng)，在實(shí)驗(yàn)組用T細(xì)胞疫苗于移植前后免疫CBA大鼠，再用Flt3-L刺激B6小鼠的肝臟進(jìn)行移植，則不能誘導(dǎo)發(fā)生急性免疫排斥反應(yīng)。

研究表明肝移植“自動(dòng)耐受”與外周T細(xì)胞凋亡有關(guān),肝臟含有大量的過(guò)客細(xì)胞,其中不成熟樹(shù)突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DCs)比例很高,這些不成熟的DCs細(xì)胞低表達(dá)MHC，不表達(dá)B7分子，這些DC細(xì)胞(immature DCs)雖然有攝取處理抗原和一定的抗原呈遞能力，但不能活化T細(xì)胞，反而導(dǎo)致T細(xì)胞無(wú)能。因此導(dǎo)致肝臟不發(fā)生免疫排斥，出現(xiàn)所謂的“自動(dòng)耐受”現(xiàn)象。因此肝臟被稱為“耐受器官”、“優(yōu)惠器官(Privileged organ)”。Thomson 等[6]從小鼠肝臟中分離出DCs前體細(xì)胞(DCs progenitors),在體外加入GM-CSF及IL-4擴(kuò)增后,于小鼠心臟移植前輸入受體小鼠,發(fā)現(xiàn)移植的異體心臟存活期明顯延長(zhǎng),證明了不成熟的DCs具有誘導(dǎo)耐受的功能。

Flt3-L是如何誘發(fā)同種肝移植急性排斥反應(yīng)的？其機(jī)理與DC分化有關(guān)[7]，研究發(fā)現(xiàn)Flt3-L能夠誘導(dǎo)供體間質(zhì)樹(shù)突狀細(xì)胞(Interstitial DCs)的增加,這些間質(zhì)DCs分化為成熟的DCs遷移到肝臟,從而誘發(fā)了肝移植急性排斥反應(yīng)的發(fā)生。

在研究中,于移植前后用T細(xì)胞疫苗免疫CBA受體小鼠,發(fā)現(xiàn)Flt3-L介導(dǎo)的急性排斥反應(yīng)被TCV抑制,TCV免疫使移植物存活期顯著延長(zhǎng)，T細(xì)胞凋亡顯著增加；以接受TCV的CBA的T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，以接受Flt3-L治療的B6小鼠脾細(xì)胞作為刺激細(xì)胞作單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，T細(xì)胞增殖被顯著抑制，而以未治療的CBA的T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞，以接受Flt3-L治療的B6小鼠脾細(xì)胞作為刺激細(xì)胞作單向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，T細(xì)胞增殖顯著增強(qiáng)。而在單純移植出現(xiàn)自動(dòng)耐受的情況下，雖然沒(méi)有發(fā)生急性排斥反應(yīng)，但是其T細(xì)胞凋亡無(wú)顯著增加。由此可以推斷，肝移植自動(dòng)耐受是由于肝臟組織內(nèi)不成熟的DC細(xì)胞誘導(dǎo)了T細(xì)胞的活化障礙和向調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)化，因此導(dǎo)致了移植物無(wú)反應(yīng)狀態(tài)。用Flt3-L治療供體小鼠，可以顯著增加間質(zhì)DC向成熟DC轉(zhuǎn)化，促使成熟DC向肝臟募集，當(dāng)肝移植后存在于肝臟中的大量成熟DC細(xì)胞就會(huì)活化大量的反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，從而誘發(fā)急性免疫排斥反應(yīng)[8,9]。TCV疫苗細(xì)胞是用供體肝臟抗原刺激受體產(chǎn)生的移植排斥效應(yīng)T細(xì)胞經(jīng)滅活而得，用TCV免疫受體就會(huì)誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)移植排斥效應(yīng)T細(xì)胞的獨(dú)特型T細(xì)胞克隆，獨(dú)特型T細(xì)胞克隆針對(duì)移植排斥效應(yīng)T細(xì)胞的免疫反應(yīng)清除了移植排斥效應(yīng)細(xì)胞，抑制了肝移植免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生[10]。

TCV誘導(dǎo)免疫耐受與T細(xì)胞克隆轉(zhuǎn)換有關(guān)[11,12]，CD4+和CD8+T細(xì)胞通過(guò)識(shí)別自身TCR的抗原決定簇而發(fā)揮作用，本研究發(fā)現(xiàn)TCV 誘導(dǎo)了CD4/CD8降低，CD8T細(xì)胞比例上升，說(shuō)明CD8+T細(xì)胞在TCV誘導(dǎo)移植耐受中起著重要作用。T細(xì)胞疫苗誘導(dǎo)并激活了CD8+抗獨(dú)特型T細(xì)胞，通過(guò)CD8+抗獨(dú)特型T細(xì)胞的作用誘導(dǎo)針對(duì)供肝抗原的反應(yīng)性T細(xì)胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)TCV疫苗導(dǎo)致移植肝內(nèi)IL-4 mRNA的表達(dá)顯著上調(diào)，INF-γ mRNA的表達(dá)受到明顯抑制。說(shuō)明T細(xì)胞疫苗可以誘導(dǎo)Th前體向Th2分化。 致敏的CD4+T細(xì)胞與抗原接觸后，分化成Th1和Th2，Th1主要分泌IL-2和IFN-γ，Th2主要分泌IL-4、IL-5和IL-10等，肝移植自動(dòng)耐受時(shí)，供肝內(nèi)含有大量的缺乏共刺激分子活性的DCs前體，阻礙了CD4+反應(yīng)性T細(xì)胞進(jìn)一步活化,使Th前體分化為Th2，形成了有利于肝移植“自動(dòng)耐受”的環(huán)境[13]。而Flt3-L誘導(dǎo)的成熟DCs增加，這些DC細(xì)胞具有充足的共刺激分子活性，使肝移植后CD4+反應(yīng)性T細(xì)胞進(jìn)一步活化,Th前體分化為Th1，介導(dǎo)了強(qiáng)烈的免疫排斥反應(yīng)。根據(jù)本研究，T細(xì)胞疫苗可以誘導(dǎo)針對(duì)反應(yīng)性T細(xì)胞的CD8+抗克隆型T細(xì)胞產(chǎn)生，這些CD8+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可以從另一個(gè)水平對(duì)Th1和Th2進(jìn)行調(diào)控，從Th2中識(shí)別出成熟的Th1并加以抑制或清除[14]。所以TCV誘導(dǎo)移植耐受存在多環(huán)節(jié)多水平。

T細(xì)胞疫苗是作者的系列研究，本實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)B6小鼠作為供體，CBA小鼠作為受體的原位肝移植模型證明：肝移植存在“自動(dòng)耐受”現(xiàn)象,其機(jī)理與肝臟內(nèi)的幼稚DC無(wú)法遞呈抗原有關(guān)，而Flt3-L可以增加肝移植物內(nèi)的成熟DC細(xì)胞，通過(guò)mDC活化反應(yīng)性CTL細(xì)胞，促進(jìn)Th0向Th1轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)急性排斥反應(yīng)的發(fā)生；TCV 可以誘導(dǎo)針對(duì)供肝抗原免疫排斥效應(yīng)細(xì)胞的抗獨(dú)特性克隆的CD8獨(dú)特型克隆T細(xì)胞，這一群獨(dú)特克隆T細(xì)胞清除了移植排斥效應(yīng)細(xì)胞，抑制了免疫排斥反應(yīng)，同時(shí)TCV還可以促進(jìn)Th0向Th2轉(zhuǎn)化，為移植免疫耐受創(chuàng)造有利條件。證明了T細(xì)胞疫苗能夠有效地抑制肝移植急性排斥反應(yīng),具有誘導(dǎo)特異性移植耐受的作用。

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[收稿2015-08-03修回2015-09-15]

(編輯倪鵬)

Effects of donor-Ag specific T cell vaccination on inhibiting Flt3-L-induced acute liver allograft rejection

ZHAOZhen-Lin,ZHAOChen-Ye,XIEYan-Bing，YANGBo，SUJi-Rong.

DepartmentofHepatobiliarySurgery,theSecondHospital,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China

[Abstract]Objective:To investigate the effect and mechanism of donor-Ag specific T cell vaccination on inducing specific immune tolerance of allogenic liver transplantation and the mechanism of immune privilege of liver transplantation.Methods: CBA mice were recipients,B6 mice were donors,T cell vaccination (TCV) were made from the attenuated spleen cells of CBA mice,which were stimulated by Con A and were challenged with the spleen cells of B6 mice.There are 3 groups in this experiment:Transplant control group:Orthotopic liver transplantation (OLT) were performed with the recipients of CBA mice and donors of B6 mice;Flt3-L treating group:OLT were performed with the recipients of CBA mice and donors of B6 mice treated with Flt3-L;TCV group:OLT were performed with the recipients of CBA mice inoculated with TCV and donors of B6 mice treated with Flt3-L.Median survival time (MST) of liver grafts was recorded,IL-4,IL-10 and IFN-γ in peripheral blood were tested after transplantation in each group.One-way mixed lymphocyte reaction(MLR) were carried out with effectors of spleen cells from CBA mice and stimulator of spleen cells from B6 mice at the 5th day after transplantation.The apoptosis of liver graft infiltrating cells (GICs) were analyzed by flow cytometric analysis at the 5th day after transplantation.Results: Flt3-L treating donor activated allogenic acute rejecting reaction,TCV vaccinating recipient before and after transplantation significantly depressed the acute immune rejecting reaction mediated by Flt3-L.The liver grafts were accepted by recipient without the presence of Flt3-L.The cytokines test show that the serum value of IL-4 and IL-10 were increased in Transplant control group and TCV group,but decreased in Flt3-L treating group.The value of IFN-γ was increased in Flt3-L treating group,but decreased in Transplant control group and TCV group .The result of one-way MLR show that the cpm values in Flt3-L treating group was 9 790±1 369 which was higher than Transplant control group which was 3 318±1 190;the cpm values in TCV group was 3 318±1 190 which show that TCV inhibited Flt3-L mediated liver transplant acute immune rejection.The flow cytometric analysis showed that the percentage of apoptosis of TILs was markedly increased in TCV group (54.20±3.12) in comparison with Flt3-L treating group(3.34±2.49%).The apoptosis analysis certified that TCV inhibited the TIL-mediated immune rejecting reaction.Conclusion: Automatic tolerance can be observed at the situation of allogenic liver transplantation in mice,Flt3-L can break the balance of automatic tolerance and mediate acute rejection reaction .Donor-Ag specific T cell vaccination can successfully inhibit acute immune rejection mediated by Flt3-L.

[Key words]T cell vaccine;Allogenic;Immune tolerance;Liver transplantation

中圖分類號(hào)R392.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼A

文章編號(hào)1000-484X(2016)03-0327-05

作者簡(jiǎn)介：趙振林(1967年-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，主要從事移植免疫方面的研究，E-mail:2412205354@qq.com。

doi:10.3969/j.issn.1000-484X.2016.03.007

①本文受山西省歸國(guó)留學(xué)人員科研基金資助(No.2010-57)。

②深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院干細(xì)胞再生醫(yī)學(xué)科，深圳518035。