中空纖維離心超濾—HPLC法測定鹽酸伊立替康脂質(zhì)體的包封率

孫婷 劉彥 王曉暉 律濤 蔣曄

摘 要 目的：建立測定鹽酸伊立替康脂質(zhì)體包封率的方法。方法：采用改進的中空纖維離心超濾法（HFCF-UF）分離脂質(zhì)體和游離藥物；采用高效液相色譜法測定脂質(zhì)體中鹽酸伊立替康的含量，色譜柱為Diamonsil C18，流動相為甲醇-乙腈-磷酸鹽緩沖液（稱取磷酸二氫鉀6.8 g溶于800 mL水中，加入三乙胺10 mL，以磷酸調(diào)pH至4.0，加水定容至1 000 mL）（55 ∶ 5 ∶ 45，V/V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為25 ℃，進樣量為20 μL。結(jié)果：鹽酸伊立替康檢測質(zhì)量濃度線性范圍為2.55～40.8 μg/mL（r=0.999 2）；定量限為0.64 μg/mL；中間精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD均小于2%；超濾提取回收率為96.9%～100.2%（RSD=1.0%，n=9），空白加樣回收率為95.5%～100.5%（RSD=1.7%，n=9）。包封率的平均值為94.85%（RSD=1.1%，n=3）。結(jié)論：該方法操作簡便、準確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，適用于鹽酸伊立替康脂質(zhì)體包封率的測定。

關(guān)鍵詞 中空纖維離心超濾法；高效液相色譜法；包封率；伊立替康

中圖分類號 R927.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）16-2220-04

ABSTRACT OBJECTIVE： To develop a method for determining entrapped efficiency of Irinotecan hydrochloride liposomes. METHODS： The improved hollow fiber centrifugal ultrafiltration （HFCF-UF） method was employed to separate the liposomal drug and the free drug. The content of irinotecan hydrochloride was determined by HPLC. The determination was performed on Diamonsil C18 with mobile phase consisted of methanol-acetonitrile-phosphate buffer solution （monobasic potassium phosphate 6.8 g dissolved in 800 mL water， triethylamine 10 mL， pH adjusted to 4.0 with phosphoric acid， adding water to 1 000 mL） （55 ∶ 5 ∶ 45，V/V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 254 nm， and column temperature was 25 ℃. The sample size was 20 μL. RESULTS： The linear range of irinotecan hydrochloride were 2.55-40.80 μg/mL （r=0.999 2）. The limit of quantitation was 0.64 μg/mL. RSDs of intermediate precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2%. The recovery rates of ultrafiltration were 96.9%-100.2% （RSD=1.0%，n=9）， and the blank adding recovery rates ranged 95.5%-100.5%（RSD=1.7%，n=9）. The average of entrapped efficiency was 94.85%（RSD=1.1%，n=3）. CONCLUSIONS： The method is simple， accurate， precise， stable， reproducible and durable. It can be used for the determination of entrapped efficiency of Iriticonite hydrochloride liposomes.

KEYWORDS Hollow fiber centrifugal ultrafiltration； HPLC； Entrapped efficiency； Irinotecan

鹽酸伊立替康是一種半合成的喜樹堿類衍生物，具有較好的水溶性，臨床所用劑型多為注射劑，主要用于治療晚期大腸癌、食管癌、小細胞肺癌等，但其缺點明顯（如半衰期短），并且可引發(fā)遲發(fā)性腹瀉、骨髓抑制等不良反應(yīng)[1]。為克服其缺點，延長其在體內(nèi)的滯留時間，同時增強其靶向性，減少不良反應(yīng)，國內(nèi)外學(xué)者研究并制備了鹽酸伊立替康脂質(zhì)體。

在脂質(zhì)體制劑的制備工藝中，包封率指標至關(guān)重要，關(guān)系到藥物增效減毒目的能否達成[2-3]。包封率測定的關(guān)鍵是分離脂質(zhì)體與游離藥物，目前常用方法有透析法[4-5]、凝膠色譜法[6-7]、固相微萃取法[8]、離心超濾法[9-11]等。但上述方法均存在一定的不足，如樣品稀釋倍數(shù)大、脂質(zhì)體易滲漏、游離藥物質(zhì)量濃度增加、回收率低等[9，12-13]。本研究采用改進的中空纖維離心超濾（HFCF-UF）-高效液相色譜法（HPLC）對鹽酸伊立替康脂質(zhì)體的包封率進行測定，操作簡單、快速，且避免了濃度差極化及脂質(zhì)體滲漏問題，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 儀器

1200型HPLC儀，包括紫外-可見分光檢測器等（美國Agilent公司）；XSE型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；PHS-25型pH計（上海精科科學(xué)儀器有限公司）；Centrifuge 5424型高速離心機（德國Eppendorf公司）；CQ-200B-ST型超聲波清洗機（上海躍進醫(yī)用光學(xué)器械廠）；聚砜（PSU）中空纖維膜材（壁厚：150 μm，內(nèi)徑：1 000 μm，截留分子量：10 000）均購自天津北奧膜工程技術(shù)有限公司；玻璃離心管（天津鼎杰生物科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸依立替康脂質(zhì)體（河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院自制）；鹽酸伊立替康對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100767-201303，純度：98%）；氫化大豆卵磷脂（上海寶曼生物科技有限公司，批號：160105）；膽固醇（武漢德美凱生物科技有限公司，批號：160408）；聚乙二醇單甲醚（分子量：2 000）膽固醇琥珀酸酯（河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院實驗室自制）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸伊立替康脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體的制備

將氫化大豆卵磷脂、膽固醇、聚乙二醇單甲醚膽固醇琥珀酸酯按質(zhì)量比3 ∶ 1 ∶ 1混合，加入10%乙醇溶液，于65 ℃水浴中攪拌溶解；加入0.2 mol/L 乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）溶液5 mL，于65 ℃水浴中攪拌20 min，超聲（功率：200 W，維持2 min；功率：400 W，維持6 min；頻率：40 kHz）處理8 min，經(jīng)微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得空白脂質(zhì)體混懸液。取上述空白脂質(zhì)體混懸液0.3 mL，上樣于3 mL的陰陽混合離子交換樹脂柱（濕法裝柱，陰離子樹脂與陽離子樹脂體積比2 ∶ 1），洗劑洗脫后以2 000 r/min離心4 min，得具有跨膜離子梯度的空白脂質(zhì)體混懸液。取已建立跨膜離子梯度的空白脂質(zhì)體混懸液0.1 mL，加入3.0 mg/mL鹽酸伊立替康溶液0.3 mL，于60 ℃保溫10 min，得質(zhì)量濃度為2.25 mg/mL的鹽酸伊立替康脂質(zhì)體[14]。另取已建立跨膜離子梯度的空白脂質(zhì)體混懸液0.2 mL，于60 ℃保溫10 min，得空白脂質(zhì)體。

2.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-磷酸鹽緩沖液（稱取磷酸二氫鉀6.8 g溶于800 mL水中，加入三乙胺10 mL，以磷酸調(diào)pH至4.0，加水定容至1 000 mL）（55 ∶ 5 ∶ 45，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：20 μL。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液 精密稱取鹽酸伊立替康對照品10.02 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，得質(zhì)量濃度為1.02 mg/mL的對照品貯備液。精密量取上述對照品貯備液1 mL，置于50 mL量瓶中，加水定容，得質(zhì)量濃度為20.4 μg/mL的對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液 （1）供試品溶液Ⅰ。精密量取“2.1”項下鹽酸伊立替康脂質(zhì)體1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加水定容，得供試品溶液Ⅰ。（2）供試品溶液Ⅲ。精密量取“2.1”項下鹽酸伊立替康脂質(zhì)體0.2 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，得質(zhì)量濃度為90.0 μg/mL的供試品溶液Ⅱ；精密量取上述供試品溶液Ⅱ1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加水定容，得供試品溶液Ⅲ。

2.3.3 陰性對照溶液 取“2.1”項下空白脂質(zhì)體適量，按“2.3.2”項下供試品溶液Ⅰ制備方法制備陰性對照溶液。

2.4 超濾液的制備

將PSU中空纖維剪成長度為17 cm的小段，超聲（功率：400 W，頻率：40 kHz）處理15 min，晾干，備用。將經(jīng)處理的中空纖維置于吐溫20溶液（1 mg/mL）中浸泡24 h進行改性，晾干，備用。取1段已完成改性的中空纖維置于離心管中，分別加入“2.3”項下供試品溶液Ⅰ、Ⅲ和陰性對照溶液0.2 mL（如圖1所示），4 500 r/min離心15 min，取出中空纖維，一端注入空氣另一端流出超濾液，即得供試品Ⅰ、Ⅲ、陰性對照超濾液。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.3.1”項下對照品溶液、“2.4”項下供試品Ⅰ超濾液和陰性對照超濾液各適量，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖2。結(jié)果，理論板數(shù)按伊立替康峰計應(yīng)不低于3 000；基線分離良好，分離度>1.5。

2.6 線性關(guān)系考察

精密量取“2.3.1”項下對照品貯備液1 mL，置于10 mL量瓶中，加水定容，得質(zhì)量濃度為102.0 μg/mL的對照品溶液Ⅰ。精密量取上述對照品溶液Ⅰ適量，分別置于10 mL量瓶中，加水定容，制成鹽酸伊立替康質(zhì)量濃度分別為2.55、5.1、10.2、20.4、40.8 μg/mL的系列對照品溶液。分別精密量取上述系列對照品溶液20 μL，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以鹽酸伊立替康質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程y=1.25×104x-1.54×104（r=0.999 2）。結(jié)果表明，鹽酸伊立替康檢測質(zhì)量濃度線性范圍為2.55～40.8 μg/mL。

2.7 定量限考察

分別精密量取“2.3.1”項下對照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.2”項下色譜條件進樣測定，以信噪比10 ∶ 1計算定量限。結(jié)果，鹽酸伊立替康定量限為0.64 μg/mL。

2.8 中間精密度試驗

由2名分析員在不同日期精密量取“2.1”項下鹽酸伊立替康脂質(zhì)體適量，共5份，按“2.3.2”項下供試品溶液Ⅰ制備方法制備供試品溶液，進而按“2.4”項下方法制備超濾液，再按“2.2”項下色譜條件在不同儀器上進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸伊立替康峰面積的RSD為1.8%（n=5），表明本方法中間精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗

取“2.3.2”項下供試品溶液Ⅰ適量，按“2.4”項下方法制備超濾液，分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸伊立替康峰面積的RSD為0.9%（n=5），表明供試品超濾液在室溫下放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.10 重復(fù)性試驗

精密稱取“2.1”項下鹽酸伊立替康脂質(zhì)體適量，共6份，按“2.3.2”項下供試品溶液Ⅰ制備方法制備供試品溶液，進而按“2.4”項下方法制備超濾液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，鹽酸伊立替康峰面積的RSD為1.2%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.11 回收率試驗

2.11.1 超濾提取回收率試驗 取對照品適量，共9份，分別制備低、中、高質(zhì)量濃度的對照品溶液，進而按“2.4”項下方法制備超濾液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算超濾提取回收率，結(jié)果見表1。

2.11.2 空白加樣回收率試驗 取“2.1”項下已知含量鹽酸伊立替康脂質(zhì)體適量，共9份，分別加入“2.1”項下空白脂質(zhì)體0.2 mL，按“2.3.2”項下供試品溶液Ⅰ制備方法制備供試品溶液，進而按“2.4”項下方法制備超濾液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.12 包封率測定

取“2.1”項下鹽酸伊立替康脂質(zhì)體各適量，分別按“2.3.2”項下供試品溶液Ⅲ制備方法制備供試品溶液，進而按“2.4”項下方法制備超濾液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計算游離藥物含量，按下列公式計算鹽酸伊立替康脂質(zhì)體包封率：包封率=（藥物的總質(zhì)量-游離藥物的質(zhì)量）/藥物的總質(zhì)量×100%。結(jié)果，鹽酸伊立替康脂質(zhì)體包封率的平均值為94.85%，RSD為1.1%（n=3）。

3 討論

3.1 不同膜材的非特異性吸附考察及膜材改性研究

非特異性吸附是膜分離技術(shù)中的常見問題，該問題的存在使得超濾液的質(zhì)量濃度低于樣品溶液的真實質(zhì)量濃度，由此造成結(jié)果偏差[13]。本試驗以5.1、10.2、20.4 μg/mL 3個質(zhì)量濃度的鹽酸伊立替康對照品溶液分別考察了PSU、PP、PVDF、PAN 4種不同膜材的非特異性吸附情況，結(jié)果表明，僅PSU膜材對鹽酸伊立替康的回收率大于50%，但仍未達到試驗要求（90%～110%）。因此，本試驗嘗試采用表面活性劑對中空纖維膜材進行改性，分別考察了吐溫20、吐溫80、十二烷基磺酸鈉對PSU膜材的中空纖維改性的效果。原理為殘留在中空纖維膜材表面的表面活性劑可占據(jù)一定的吸附位點從而降低其對待測物的非特異性吸附。結(jié)果表明，經(jīng)吐溫20改性的PSU中空纖維制備的超濾液提取回收率均大于96%，符合試驗要求。

與以往研究中所用的HFCF-UF法[13-14]相比，本試驗對中空纖維的非特異性吸附問題進行了改進，并成功解決了PSU中空纖維對鹽酸伊立替康的吸附問題，使得該方法可以很好地適用于鹽酸伊立替康脂質(zhì)體包封率的測定，并為HFCF-UF法的推廣應(yīng)用提供了借鑒。

3.2 離心轉(zhuǎn)速的優(yōu)化

離心超濾法的濾過速度主要取決于離心力，在一定時間內(nèi)，離心力若太小則所得超濾液量較小，不利于進樣分析[13]。因此，本試驗考察了離心時間為15 min，離心轉(zhuǎn)速分別為2 500、4 500、6 500 r/min時所得超濾液量。結(jié)果表明，離心轉(zhuǎn)速分別為4 500、6 500 r/min時，收集到的超濾液量基本一致，因此，選擇4 500 r/min為試驗離心轉(zhuǎn)速。

綜上所述，本試驗建立了改進的HFCF-UF法分離鹽酸伊立替康脂質(zhì)體中的游離藥物，并以HPLC法測定其游離藥物含量，進而計算包封率，操作簡便、準確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好。

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（收稿日期：2018-02-05 修回日期：2018-03-20）

（編輯：張 靜）