頂空氣相色譜法同時(shí)測定硫酸沃拉帕沙原料藥中7種有機(jī)溶劑的殘留量

劉英 劉葵葵 鄧玉曉 孫德清

摘 要 目的：建立同時(shí)測定硫酸沃拉帕沙原料藥中7種有機(jī)溶劑殘留量的方法。方法：采用頂空氣相色譜法。色譜柱為Agilent DB-624毛細(xì)管柱，程序升溫，進(jìn)樣口溫度為220 ℃，檢測器為氫火焰離子化檢測器，檢測器溫度為250 ℃，載氣為氮?dú)猓兌龋?9.999%），流速為2.0 mL/min，分流比為20 ∶ 1，頂空進(jìn)樣量為1 mL，頂空平衡溫度為80 ℃，頂空平衡時(shí)間為30 min。結(jié)果：乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、乙醇、乙腈、四氫呋喃、甲苯檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為2.0～201.0 μg/mL（r=0.999 8）、1.2～122.3 μg/mL（r=0.999 4）、0.24～24.0 μg/mL（r=0.999 2）、2.0～200.3 μg/mL（r=0.999 9）、0.2～16.7 μg/mL（r=0.999 9）、0.3～29.0 μg/mL（r=0.999 3）、0.4～35.8 μg/mL（r=0.999 3）；定量限分別為2.0、1.2、0.24、2.0、0.2、0.3、0.4 μg/mL，檢出限分別為0.60、0.30、0.07、0.60、0.06、0.09、0.12 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于4%；加樣回收率分別為97.02%～99.84%（RSD=0.88%，n=9）、98.05%～99.64%（RSD=0.54%，n=9）、97.37%～100.00%（RSD=0.83%，n=9）、98.67%～99.60%（RSD=0.34%，n=9）、 97.56%～99.76%（RSD=0.79%，n=9）、97.22%～99.45%（RSD=0.65%，n=9）、97.75%～99.33%（RSD=0.59%，n=9）；耐用性試驗(yàn)的RSD均小于8%。原料藥樣品中僅檢出甲醇、乙醇。結(jié)論：該方法操作簡便、準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性好，可用于硫酸沃拉帕沙原料藥中7種有機(jī)溶劑殘留量的同時(shí)測定。

關(guān)鍵詞 頂空氣相色譜法；硫酸沃拉帕沙；殘留溶劑

中圖分類號 R927.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）16-2224-04

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish simultaneous determination of 7 kinds of residual solvents in vorapaxar sulfate raw material. METHODS： The headspace gas chromatography was performed on Agilent DB-624 capillary column（programmed temperature） with inlet temperature of 220 ℃， detection temperature of 250 ℃ using nitrogen（99.999%） as carrier gas at the flow rate of 2.0 mL/min. The split ratio was 20 ∶ 1， and sample size was 1 mL. The headspace equilibrium temperature was 80 ℃，headspace equilibrium time was 30 min. RESULTS： The linear range of ethyl acetate， methanol， dichloromethane， ethanol， acetonitrile， tetrahydrofuran and toluene were 2.0-201.0 μg/mL（r=0.999 8）， 1.2-122.3 μg/mL（r=0.999 4）， 0.24-24.0 μg/mL（r=0.999 2）， 2.0-200.3 μg/mL（r=0.999 9）， 0.2-16.7 μg/mL（r=0.999 9）， 0.3-29.0 μg/mL（r=0.999 3）， 0.4-35.8 μg/mL（r=0.999 3）， respectively. The limits of quantification were 2.0， 1.2， 0.24， 2.0， 0.2， 0.3， 0.4 μg/mL； the limits of detection were 0.60， 0.30， 0.07， 0.60， 0.06， 0.09， 0.12 μg/mL. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 4%. The recoveries were 97.02%-99.84%（RSD=0.88%，n=9）， 98.05%-99.64%（RSD=0.54%，n=9）， 97.37%-100.00%（RSD=0.83%，n=9）， 98.67%-99.60%（RSD=0.34%，n=9）， 97.56%-99.76%（RSD=0.79%，n=9）， 97.22%-99.45%（RSD=0.65%，n=9）， 97.75%-99.33%（RSD=0.59%，n=9）， respectively. RSDs of durability tests were all lower than 8%. Methanol， ethanol were detected in samples. CONCLUSIONS： The method is simple， accurate， precise， stable， reproducible and durable， and can be used for simultaneous determination of 7 kinds of residual solvents in vorapaxar sulfate raw material.

KEYWORDS Headspace gas chromatography； Vorapaxar sulfate； Residual solvents

硫酸沃拉帕沙（Vorapaxar sulfate）是一種可逆性蛋白酶激活受體1（PAR-1）拮抗藥，能夠選擇性地阻斷凝血酶介導(dǎo)的血小板激活通路，同時(shí)，不影響二磷酸腺苷、膠原、血栓烷介導(dǎo)的血小板聚集，達(dá)到既抑制血栓形成又保留生理性止血能力的目的，較其他傳統(tǒng)抗血小板藥物有較大優(yōu)勢[1-4]。臨床上，硫酸沃拉帕沙主要用于有心肌梗死和外周動(dòng)脈栓塞病史的患者，以降低其血栓性心血管事件的發(fā)生率[5-6]。2014年5月8日，硫酸沃拉帕沙獲美國FDA批準(zhǔn)上市，商品名Zontivity[2，7]。目前2015年版《中國藥典》、《歐洲藥典》（9.0版）、《日本藥典》（16版）與《美國藥典》（40版）均未收載該藥。已有文獻(xiàn)報(bào)道了硫酸沃拉帕沙片的溶出度測定方法[8]，但尚未見有關(guān)于硫酸沃拉帕沙原料藥中有機(jī)溶劑殘留量測定的報(bào)道。硫酸沃拉帕沙后5步合成工藝中分別使用了乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、乙醇、乙腈、四氫呋喃和甲苯等有機(jī)溶劑。為確保藥品的安全、有效和質(zhì)量可控，根據(jù)2015年版《中國藥典》（四部）[9]的相關(guān)規(guī)定和人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)（ICH）指導(dǎo)原則[10-11]的相關(guān)要求，應(yīng)增加有機(jī)溶劑的考察。因此，筆者對硫酸沃拉帕沙原料藥中7種有機(jī)溶劑的殘留量進(jìn)行了同時(shí)測定，以完善其藥品質(zhì)量檢測項(xiàng)目。

1 材料

1.1 儀器

7890N型氣相色譜儀，包含氫火焰離子化檢測器（FID）、7697A頂空自動(dòng)進(jìn)樣器等（美國Agilent公司）；BS 210S型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；ZUPT-I-20T型純水機(jī)（臺(tái)灣艾柯電子有限公司）。

1.2 藥品與試劑

硫酸沃拉帕沙原料藥[山東省化學(xué)藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，批號：20171001（純度：99.8%）、20171002（純度：99.7%）、20171003（純度：99.8%）]； 乙酸乙酯對照品（批號：20161106，純度：99.7%）、甲醇對照品（批號：20170206，純度：99.8%）、二氯甲烷對照品（批號：20170310，純度：99.5%）、乙醇對照品（批號：20161208，純度：99.8%）、乙腈對照品（批號：20170808，純度：99.8%）、四氫呋喃對照品（批號：20160912，純度：99.8%）、甲苯對照品（批號：20170502，純度：99.6%）均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；N，N-二甲基甲酰胺（DMF）為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent DB-624毛細(xì)管柱（30 m×0.53 mm，3.0 μm）；升溫程序：初始溫度為40 ℃，保持8 min，以25 ℃/min的速度升溫至160 ℃，保持2 min；進(jìn)樣口溫度：220 ℃；檢測器：FID；檢測器溫度：250 ℃；載氣：氮?dú)猓兌龋?9.999%）；流速：2.0 mL/min；分流比：20 ∶ 1；頂空進(jìn)樣量：1 mL；頂空瓶裝樣量：5 mL；頂空平衡溫度：80 ℃；頂空平衡時(shí)間：30 min。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別稱取各待測成分對照品適量，置于同一100 mL量瓶中，加DMF溶解并定容，搖勻，制成乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、乙醇、乙腈、四氫呋喃、甲苯質(zhì)量濃度分別為500、300、60、500、41、72、89 μg/mL的混合對照品貯備液。精密量取上述混合對照品貯備液5 mL，置于50 mL量瓶中，加DMF定容，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取原料藥樣品0.5 g，置于頂空瓶中，精密加入DMF 5 mL，密封，振搖使溶解，即得。

2.2.3 空白對照溶液 精密量取DMF 5 mL作為空白對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下空白對照溶液、混合對照品溶液和供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果，理論板數(shù)以甲醇峰計(jì)為39 548；各待測成分峰分離度均大于2。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品貯備液0.1、0.5、1、2、3、4、5、10 mL，置于25 mL量瓶中，加DMF定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各5 mL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表1。

2.5 定量限與檢出限考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計(jì)算定量限、檢出限。結(jié)果，乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、乙醇、乙腈、四氫呋喃和甲苯的定量限分別為2.0、1.2、0.24、2.0、0.2、0.3、0.4 μg/mL，檢出限分別為0.60、0.30、0.07、0.60、0.06、0.09、0.12 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、乙醇、乙腈、四氫呋喃和甲苯峰面積的RSD分別為2.4%、3.6%、3.7%、2.8%、3.3%、2.9%、2.8%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號：20171001）適量，置于10 mL量瓶中，加入“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品貯備液1.0 mL，加DMF定容，搖勻，分別于室溫下放置0、2、4、6、8 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、乙醇、乙腈、四氫呋喃和甲苯峰面積的RSD分別為3.2%、3.8%、2.9%、3.4%、2.7%、2.8%、3.1%（n=5），表明供試品溶液在室溫下放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取原料藥樣品（批號：20171001）適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品殘留量。結(jié)果，乙腈、四氫呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷和甲苯均未檢出；甲醇和乙醇?xì)埩袅科骄捣謩e為0.01%、0.06%，RSD分別為2.8%、1.9%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知?dú)埩袅吭纤帢悠罚ㄅ枺?0171001）適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度的各待測成分對照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

2.10 耐用性試驗(yàn)

2.10.1 色譜柱考察 精密稱取原料藥樣品（批號：20171002）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件[分別設(shè)置色譜柱為DB-624（30 m×0.53 mm，3.0 μm）、AT-624（30 m×0.53 mm，3.0 μm）、 CP-624（30 m×0.53 mm，3.0 μm）]進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品殘留量，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，色譜柱發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿足試驗(yàn)要求，提示耐用性良好。

2.10.2 頂空平衡溫度考察 精密稱取原料藥樣品（批號：20171002）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件（分別設(shè)置頂空溫度為79、80、81 ℃）進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品殘留量，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，頂空平衡溫度發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿足試驗(yàn)要求，提示耐用性良好。

2.10.3 流速考察 精密稱取原料藥樣品（批號：20171003）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件（分別設(shè)置流速為1.9、2.0、2.1 mL/min）進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品殘留量，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，流速發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿足試驗(yàn)要求，提示耐用性良好。

2.10.4 柱溫（初始溫度）考察 精密稱取原料藥樣品（批號：20171003）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件[分別設(shè)置柱溫（初始溫度）為39、40、41 ℃]進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品殘留量，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，柱溫（初始溫度）發(fā)生一定程度變化時(shí)，本方法能滿足試驗(yàn)要求，提示耐用性良好。

2.11 樣品殘留量測定

取3批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并以外標(biāo)法計(jì)算7種有機(jī)溶劑的殘留量，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 進(jìn)樣方式的選擇

本試驗(yàn)待測成分均為低沸點(diǎn)溶劑，雖然直接進(jìn)樣相比頂空進(jìn)樣操作簡單，但是待測樣品在高溫條件下可能分解出揮發(fā)性產(chǎn)物干擾測定結(jié)果，故本試驗(yàn)采用頂空進(jìn)樣方式[11-12]。

3.2 色譜柱的選擇

筆者前期分別選擇了不同極性的毛細(xì)管柱進(jìn)行試驗(yàn)，如DB-1701、HP-1、HP-5、DB-624。結(jié)果，采用HP-1柱進(jìn)樣測定時(shí)，甲醇、二氯甲烷與乙醇峰不能完全分離；采用DB-1701、HP-5柱進(jìn)樣測定時(shí)，乙酸乙酯與甲醇峰不能完全分離；而采用DB-624柱進(jìn)樣測定時(shí)，各待測成分峰之間的分離度均符合要求[13]。因此，選擇DB-624為本試驗(yàn)的色譜柱。

3.3 溶劑的選擇

頂空氣相色譜法常用溶劑為水、DMF、N-甲基吡咯烷酮和二甲基亞砜。硫酸沃拉帕沙的水溶性較差，因此不可以水為溶劑。經(jīng)考察硫酸沃拉帕沙在DMF中溶解性良好，且DMF在各待測成分之后出峰，對測定結(jié)果無干擾，故本試驗(yàn)選用DMF作為溶劑。

綜上所述，本方法操作簡便、準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性好，可用于硫酸沃拉帕沙原料藥中7種有機(jī)溶劑殘留量的同時(shí)測定。

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（收稿日期：2017-10-11 修回日期：2018-02-15）

（編輯：張 靜）