HPLC法測(cè)定復(fù)方葛根片中綠原酸的含量

楊文超，路其康，李允江，畢云生，張淑瑜，于燕莉

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HPLC法測(cè)定復(fù)方葛根片中綠原酸的含量

楊文超，路其康，李允江，畢云生，張淑瑜，于燕莉＊

［關(guān)鍵詞］高效液相色譜法；復(fù)方葛根片；綠原酸

［作者單位］250355山東濟(jì)南，山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院（楊文超，路其康，李允江）；250031山東濟(jì)南，濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科（畢云生，張淑瑜，于燕莉）

復(fù)方葛根片是濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院制劑室生產(chǎn)的一種活血化瘀類中成藥，制劑標(biāo)準(zhǔn)符合《中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》（2002年增補(bǔ)版）。該中成藥由葛根、丹參、茵陳和延胡索組成，具有活血化瘀，和氣止痛，生津養(yǎng)心的作用，臨床主要用于心腦血管等疾病的治療［1］。方中茵陳清熱利濕，利膽退黃，其含有的有效成分綠原酸具有抗菌、抗病毒，抗氧化、清除自由基，抗衰老，保護(hù)血管和降壓的作用［2－4］。為更好地控制復(fù)方葛根片的臨床療效，筆者參考文獻(xiàn)及2010版中國藥典，采用HPLC法對(duì)復(fù)方葛根片中綠原酸含量進(jìn)行測(cè)定，為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器Agilent1200高效液相色譜儀（安捷倫公司，四元泵，DAD檢測(cè)器），Agilent1200色譜工作站（美國安捷倫公司）；UV－2550紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；BS124S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；AS－3120型超聲清洗器（北京華瑞博遠(yuǎn)科技發(fā)展有限公司）。

1.2試藥復(fù)方葛根片（規(guī)格：0.4 g/片，濟(jì)南軍區(qū)總醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)：20150130；20150204；20150427），綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品（供含量測(cè)定用，中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110753－200413）。甲醇、乙腈為色譜純，超純水，試劑為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：SHIMADZU VP－ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈－0.05%－磷酸水溶液（10∶90）；檢測(cè)波長(zhǎng)：327 nm；柱溫：30℃；流速：0.8 ml/min。

2.2溶液制備（1）對(duì)照品溶液。精密稱取綠原酸對(duì)照品2.4 mg，置于10 ml量瓶中，加50%甲醇適量，超聲處理30 min，冷卻至室溫，50%甲醇定容至刻度，搖勻，配制成0.24 mg/ml的溶液，微孔濾膜濾過，作為對(duì)照品溶液。（2）供試品溶液。取復(fù)方葛根片刮去糖衣層，研為細(xì)末，精密稱取3.048 g，置50 ml量瓶中，加50%甲醇適量，超聲（120 W，40 KHz）處理30 min，冷至室溫，用50%甲醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為樣品溶液。（3）陰性對(duì)照品溶液。取處方量的除茵陳外的其他藥材，按復(fù)方葛根片制備工藝制成陰性對(duì)照樣品，按照“2.2（2）”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.3專屬性試驗(yàn)分別精密吸取對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄HPLC圖譜。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液在綠原酸吸收峰相應(yīng)保留時(shí)間無吸收峰，表明處方中其他成分對(duì)綠原酸含量測(cè)定無干擾，理論塔板數(shù)以綠原酸計(jì)>6000。結(jié)果見圖1。

2.4線性關(guān)系精密量取“2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液1、1.5、2、2.5、3 ml分別置于10 ml量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，分別按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，以綠原酸質(zhì)量濃度（mg/ml）為橫坐標(biāo)X，吸收峰面積積分值為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行線性回歸，得方程為：Y＝4962X－38.2（r＝0.9996，n＝4），表明綠原酸在0.024～0.06 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度試驗(yàn)取同一綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄綠原酸吸收峰面積，計(jì)算RSD值為1.65%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一批復(fù)方葛根片（批號(hào)：20150204）的供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)的色譜條件下分別于0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣，10 μl/次，記錄綠原酸吸收峰面積，結(jié)果RSD＝1.58%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)取同一批復(fù)方葛根片（批號(hào)：20150204）的供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，平行進(jìn)樣5次，10 μl/次，記錄綠原酸吸收峰面積，結(jié)果RSD＝0.65%（n＝5），表明重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)取已知綠原酸含量的同一批次復(fù)方葛根片（批號(hào)：20150204）精密稱取6份，分別加入配制濃度為0.2532 mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液1 ml，按照上述方法制備供試品溶液，并按照色譜條件測(cè)定綠原酸含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。

圖1　HPLC圖譜

表1　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.9樣品含量測(cè)定取復(fù)方葛根片3批，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液注入液相色譜儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行進(jìn)樣3次，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算綠原酸含量，結(jié)果為：批號(hào)20130123樣品平均含量為0.607 mg/g，批號(hào)20130216樣品平均含量為0.618 mg/g，批號(hào)20130407樣品平均含量為0.615 mg/g。

3　討論

3.1檢測(cè)波長(zhǎng)及色譜條件的選擇在測(cè)定綠原酸含量之前，用50%甲醇溶液配制0.01 mg/ml的綠原酸對(duì)照品溶液，用200～400 nm紫外光進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)綠原酸在327 nm處有最大吸收。再對(duì)供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在327 nm處綠原酸峰型良好，且無其他成分干擾。同時(shí)參考相關(guān)文獻(xiàn)［5－7］，確定本實(shí)驗(yàn)中綠原酸的檢測(cè)波長(zhǎng)327 nm。對(duì)乙腈－0.05%磷酸溶液（10∶90），乙腈－0.1%磷酸溶液（10∶90），乙腈－0.2%磷酸溶液（10∶90）三種流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙腈－0.05%磷酸溶液（10∶90）為流動(dòng)相時(shí)分離效果最好。

3.2供試品溶液配制方法和提取工藝的選擇考察了溶媒濃度及不同溶媒對(duì)綠原酸提取效率的影響，分別選擇100%甲醇、50%甲醇和50%乙醇提取，結(jié)果顯示在相同條件下50%的甲醇提取的綠原酸峰面積最大。供試品溶液的提取工藝考察了回流提取法和超聲提取法，結(jié)果顯示在相同條件下兩者提取的綠原酸峰面積相差不大，考慮到方法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)高效，提取工藝選擇超聲提取法。結(jié)果表明超聲（120 W，40 KHz）處理30 min，樣品溶液含量最高，且干擾成分較少，操作簡(jiǎn)便。

參考文獻(xiàn)

［1］中國人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部.中國人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范（2002年版）增補(bǔ)本［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2007：21.

［2］劉穎，郭明曄，白根本.綠原酸的研究進(jìn)展［J］.中藥材，2012，35（7）：1180－1185.

［3］王麗萍，郭棟，王果，等.中藥綠原酸的研究進(jìn)展［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2011，22（4）：961－963.

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［5］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：223－224.

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［7］童珊珊，徐亞萍，金花，等.綿茵陳提取液中綠原酸的測(cè)定及其抗氧化活性研究［J］.江蘇中醫(yī)藥，2009，41（4）：57－59.

［2015-07-18收稿，2015-08-16修回］

［本文編輯：劉一洋］

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［通訊作者］于燕莉，Email：yuyanli323@sohu.com

DOI：10.14172/j.issn1671-4008.2016.01.024

［中圖分類號(hào)］R914.1

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］B