骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)失血性休克大鼠早期炎性反應(yīng)的影響

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(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院，吉林　長(zhǎng)春　130021)

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骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)失血性休克大鼠早期炎性反應(yīng)的影響

李淑娟張?zhí)焓淄踝愚睆垖W(xué)軍李艷秋

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院，吉林長(zhǎng)春130021)

〔摘要〕目的探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)失血性休克大鼠血清炎性因子及重要臟器的影響。方法體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、治療組(n=20)。改良Wiggers法制備大鼠出血性休克模型，休克持續(xù)90 min。治療組在復(fù)蘇前給予106個(gè)第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞磷酸鹽緩沖液(PBS)懸液1 ml，假手術(shù)組和模型組給予相同體積PBS溶液。分別于復(fù)蘇后6、12、24、48、72 h取血清，酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)腫瘤壞死因子(TNF)-α，白介素(IL)-1β、IL-6和IL-10水平，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察心、肝、肺、腎病理?yè)p傷。結(jié)果治療組血清TNF-α和IL-6在復(fù)蘇后12~72 h內(nèi)較模型組顯著下降(P<0.05)；治療組血清IL-1β在復(fù)蘇后6~12 h內(nèi)較模型組下降顯著(P<0.05)；治療組IL-10水平在復(fù)蘇后6~48 h內(nèi)均較模型組有顯著升高(P<0.05)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞減輕肺、肝、腎、心等器官的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。結(jié)論骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能調(diào)節(jié)失血性休克早期重要炎性因子水平，促進(jìn)機(jī)體促炎-抗炎系統(tǒng)平衡。

〔關(guān)鍵詞〕骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；失血性休克；炎癥因子；免疫調(diào)節(jié)

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有極低的免疫原性和獨(dú)特的免疫調(diào)節(jié)功能〔1〕，在多種組織損傷和修復(fù)中表現(xiàn)出良好的免疫調(diào)節(jié)能力，但對(duì)失血性休克后免疫失衡的影響尚未研究。本研究利用培養(yǎng)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在大鼠失血性休克模型，調(diào)查間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)的影響，以證實(shí)其減輕失血性休克后炎性反應(yīng)的效果，從而探討失血性休克臨床救治的新思路。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物特殊清潔級(jí)(SPF)級(jí)SD大鼠，質(zhì)量250～300 g。購(gòu)于第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)附屬唐都醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑及儀器DMEM-LG培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；PE anti-rat CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD106(美國(guó)Biolegent公司)；戊巴比妥鈉(第四軍醫(yī)大學(xué)生物技術(shù)中心)；大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α 酶聯(lián)免疫試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、白介素(IL)-1β ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒、IL-10 ELISA試劑盒(美國(guó)RD&D公司)；鏈霉素、氨芐青霉素(華北制藥有限公司)。CO2恒溫孵育箱(美國(guó)Thermo公司)；液閃計(jì)數(shù)儀(美國(guó)Beckman公司)；IMT-2型倒置生物學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)；HH-4型恒溫水浴箱(金壇富華電器有限公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD FACSAriaTM)；高速調(diào)溫離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司)。

1.3大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增和鑒定大鼠頸椎脫臼處死，取雙后肢脛骨和股骨。無(wú)菌2 ml注射器吸取培養(yǎng)基迅速反復(fù)沖洗骨髓腔多次，直至沖出大部分骨髓。加入含10%胎牛血清的DMEM-LG培養(yǎng)基，無(wú)菌玻璃管反復(fù)吹打，直至細(xì)胞充分重懸于培養(yǎng)基。調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/cm2,接種細(xì)胞于75 cm2的塑料培養(yǎng)瓶中，37℃,5% CO2孵箱培養(yǎng)、傳代。取第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞棄去培養(yǎng)基，PBS溶液沖洗后棄去，用0.25%胰蛋白酶消化，細(xì)胞皺縮變圓并部分脫落時(shí)加入胎牛血清終止消化，反復(fù)吹打貼壁細(xì)胞至絕大部分脫落，制成細(xì)胞懸液。離心取上清，PBS溶液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107/ml。加入PE 抗鼠 CD29、PE 抗鼠CD34、PE 抗鼠CD45、PE 抗鼠CD90、PE 抗鼠 CD106。避光，4℃冰箱內(nèi)孵育30 min。將制備好的樣品行流式細(xì)胞儀鑒定，Cellquest軟件分析數(shù)據(jù)。

1.4大鼠失血性休克模型3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后固定。分離左股動(dòng)脈插管，按3 mg/kg體重輸注肝素鈉溶液，連接心電監(jiān)護(hù)儀持續(xù)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓(MAP)。分離右股動(dòng)脈，插管連接無(wú)菌注射器。急性快速放血至MAP降至40 mmHg，而后間斷放血或回輸失血維持MAP在30~40 mmHg水平90 min，90 min后回輸全部失血進(jìn)行復(fù)蘇。

1.5實(shí)驗(yàn)分組假手術(shù)組：大鼠麻醉后固定，分離左右股動(dòng)脈插管，不失血，不輸注任何溶液，90 min后拔管結(jié)扎血管后縫合切口。(2)失血性休克模型組：大鼠麻醉固定，分離左右股動(dòng)脈插管，均造失血性休克模型，90 min后回輸全部失血(5~6 min回輸1 ml失血)，之后輸注PBS溶液1 ml，結(jié)扎血管，縫合切口。(3)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療組：失血 90 min后回輸全部失血(5~6 min回輸1 ml失血)，之后輸注含有106個(gè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的PBS溶液1 ml，結(jié)扎血管，縫合切口。各組于復(fù)蘇后6、12、24、48、72 h取4只大鼠樣本待檢。

1.6血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的ELISA測(cè)定分別于復(fù)蘇后各時(shí)間點(diǎn)取大鼠下腔靜脈血，離心取上清，-80℃冷凍保存?zhèn)錂z。檢測(cè)按照ELISA說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。

1.7各組大鼠重要臟器的HE染色各組大鼠處死后，取下心、肝、肺、腎臟，PBS沖洗后4%甲醛固定24 h以上。高濃度酒精脫水，浸蠟包埋。蠟塊切片5~8 μm。二甲苯脫蠟，酒精伊紅染色液染色2~3 min。純酒精脫水后二甲苯透明。加拿大樹(shù)膠封固、觀察。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS13.0軟件行方差分析和t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、傳代將骨髓內(nèi)細(xì)胞離心重懸后接種于75 cm2塑料培養(yǎng)瓶后，倒置顯微鏡下可見(jiàn)大量細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中。12 h即見(jiàn)部分細(xì)胞貼壁，呈大小不等圓形，并開(kāi)始繁殖。48~72 h后可見(jiàn)不規(guī)則形、三角形，并伴有小突起。8~10 d后，細(xì)胞大多呈梭形，突起明顯，排列呈旋渦狀。當(dāng)傳代至第3代時(shí)，紡錘形和梭形細(xì)胞增多明顯，呈典型的成纖維樣細(xì)胞結(jié)構(gòu)，生長(zhǎng)均勻，形態(tài)趨向一致。流式細(xì)胞儀將第3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行表面標(biāo)記物檢測(cè)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表明高表達(dá)CD29、CD90、CD106、CD44，低表達(dá)CD34、CD45，表達(dá)率分別98.4%、99.6%、50.2%、17.2%、1.5%、4.7%。

2.2各組大鼠血清炎性因子濃度變化休克復(fù)蘇后相對(duì)于假手術(shù)組，模型組的TNF-α、IL-1β、IL-6濃度顯著上升(P<0.05)，而治療組TNF-α、IL-1β、IL-6濃度在各時(shí)間點(diǎn)均比模型組明顯下降(P<0.05)。模型組IL-10的濃度較假手術(shù)組顯著下降(P<0.05)；6~48 h內(nèi)，治療組IL-10的濃度均比模型組升高(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

與模型組比較：1)P<0.05圖1　各組大鼠血清炎性因子濃度變化

2.3臟器染色觀察模型組肺組織正常結(jié)構(gòu)遭到破壞，肺間質(zhì)水腫，肺泡壁明顯增寬，肺泡腔含氣量減少，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。輸注骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞則炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少，肺組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。休克后大鼠肝臟結(jié)構(gòu)排列紊亂，肝細(xì)胞有空泡樣變性，胞質(zhì)呈疏松樣改變，匯管區(qū)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，小葉中央靜脈擴(kuò)張充血，給予骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇72 h后，肝結(jié)構(gòu)排列正常，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。休克后腎間質(zhì)有少量淤血，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，腎正常結(jié)構(gòu)遭破壞，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇后72 h可見(jiàn)病損區(qū)新的毛細(xì)血管再生，炎細(xì)胞浸潤(rùn)減少。模型組心肌細(xì)胞渾濁腫脹，間質(zhì)水腫，橫紋不規(guī)則，胞核完整或稍大，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。輸注骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞72 h后，心肌排列整齊，炎性細(xì)胞減少，胞核完整。

3討論

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過(guò)多種免疫抑制介質(zhì)進(jìn)行多靶位、多途徑的免疫調(diào)節(jié)、控制炎性反應(yīng)。對(duì)組織缺血再灌注損傷具有良好的修復(fù)功能和調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)平衡的能力〔2~4〕。出血性休克復(fù)蘇后免疫功能紊亂是全身炎性反應(yīng)綜合征的發(fā)病基礎(chǔ)，表現(xiàn)為過(guò)度的促炎反應(yīng)和明顯抑制的抗炎反應(yīng)〔5〕。目前的各種治療和預(yù)防措施效果有限。研究表明，CD4+CD25+Tregs細(xì)胞〔6〕是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要效應(yīng)細(xì)胞。CD4+CD25+Tregs細(xì)胞是一群具有免疫調(diào)節(jié)能力、控制免疫病理?yè)p傷的T細(xì)胞群，主要來(lái)源于CD4+CD8-細(xì)胞，特征是能表達(dá)某種或某些細(xì)胞表面分子與靶細(xì)胞表面受體相互作用，使靶細(xì)胞休止于細(xì)胞周期G0/G1期而停止增殖，從而介導(dǎo)免疫抑制作用〔7~9〕。CD4+CD25+Tregs細(xì)胞特異性分子標(biāo)志物Foxp3是自身免疫的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)物質(zhì)，直接控制各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其基因表達(dá)產(chǎn)物Scurfin蛋白是一種轉(zhuǎn)錄的阻遏物，可結(jié)合至細(xì)胞因子基因的啟動(dòng)區(qū)，減少細(xì)胞因子的產(chǎn)量，而缺乏Scurfin可引起迅速的淋巴細(xì)胞增生性疾病，對(duì)免疫環(huán)境的自我穩(wěn)定十分重要。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)CD4+CD25+Tregs細(xì)胞的調(diào)節(jié)可能是其在出血性休克復(fù)蘇后發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的主要途徑。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)出血性休克的免疫調(diào)節(jié)提供了新方法，但仍有許多問(wèn)題需要解決，隨著對(duì)休克病理機(jī)制更加深入的研究、對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞認(rèn)識(shí)的不斷增多，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞將有可能用于臨床出血性休克的救治。

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〔2015-11-03修回〕

(編輯李相軍)

〔中圖分類號(hào)〕R39

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)05-1044-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.05.009

通訊作者：李彤(1958-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事臨床口腔麻醉學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：吉林省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(吉發(fā)改高技〔2013〕779號(hào))

第一作者：李淑娟(1969-)，女，主管護(hù)師，主要從事口腔護(hù)理學(xué)研究。