大鯢精子結(jié)構(gòu)研究

喬志剛， 沈方方， 劉淑琰

(河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007)

大鯢精子結(jié)構(gòu)研究

喬志剛， 沈方方， 劉淑琰

(河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453007)

為了解大鯢精子超微結(jié)構(gòu)，應(yīng)用掃描電鏡和透射電鏡開展了大鯢精子形態(tài)結(jié)構(gòu)研究。結(jié)果顯示：大鯢精子由頭部、頸部和尾部3部分組成。精子總長216.36 μm±9.93 μm(n=30)，頭部長65.80 μm±3.70 μm(n=30)，頸部較短，多不明顯，尾部長153.52 μm±3.22 μm(n=30)。頭部由頂體、穿孔器和細(xì)胞核組成；頸部包括核窩、近端中心粒及遠(yuǎn)端中心粒、線粒體、軸絲和軸纖維；尾部無明顯分段，由軸絲、軸纖維、軸絲旁纖維和波動膜組成。大鯢精子內(nèi)線粒體較少，可能與精子運動緩慢、精子活力維持時間短有關(guān)；成熟過程中精子細(xì)胞頭部包圍的胞質(zhì)分泌物中含有一定數(shù)量的線粒體。

大鯢；精子；超微結(jié)構(gòu)

研究精子結(jié)構(gòu)不僅能為研究生物的分類地位、進化規(guī)律提供理論依據(jù)，同時也是探究生物受精機制的基礎(chǔ)。有尾兩棲類動物精子結(jié)構(gòu)的研究(Selmietal.，1997；鄭中華等，2004，2005；Emilioetal.，2009)多集中在蠑螈科Salamandridae和小鯢科Hynobiidae，而對隱鰓鯢科Cryptobranchidae物種精子形態(tài)結(jié)構(gòu)的研究相對較少。

大鯢Andriasdavidianus俗稱娃娃魚，隸屬于兩棲綱Amphidia有尾目Urodela隱鰓鯢科，為國家Ⅱ級重點保護動物。近年來，由于環(huán)境變化和人為干擾，加上大鯢對生境依賴性強、遷徙能力差等因素，野生大鯢種群數(shù)量明顯下降(喬志剛等，2013)。為增加大鯢的種群數(shù)量，提高大鯢的繁育能力，對其開展繁殖生物學(xué)研究十分必要。動物精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)與受精過程密切相關(guān)，是繁殖生物學(xué)重要的研究內(nèi)容之一。許多學(xué)者(鄧鳳嬌等，1998；劉鑒毅等，1999；周海燕等，2003；羅慶華等，2005；鄭中華等，2008；彭亮躍，2010；殷夢光等，2014)曾對大鯢的繁殖生物學(xué)及其精子和卵子的形態(tài)結(jié)構(gòu)開展了部分研究，為了解大鯢的繁殖特點提供了相關(guān)資料。關(guān)于大鯢精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)，周海燕等(2003)、鄭中華等(2008)、彭亮躍(2010)等有過相關(guān)報道，但對大鯢精子線粒體的闡述較少，且關(guān)于大鯢精子頂體的記述有所不同。本研究應(yīng)用掃描電鏡和透射電鏡技術(shù)對大鯢成熟精子的形態(tài)結(jié)構(gòu)進行了觀察，旨在深入認(rèn)識大鯢精子的形態(tài)特征，為大鯢的繁殖生物學(xué)積累基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗材料由河南省濟源市宏基鱘鯢養(yǎng)殖基地提供。挑選6～9齡，體質(zhì)量3.80～7.50 kg，成熟、健康的泄殖孔周圍呈橘瓣狀隆起，泄殖孔內(nèi)緣周邊有一圈米粒狀白點分布的雄性大鯢10尾待用。

1.2 方法

1.2.1 采精方法 采用絨毛膜促性腺激素(HCG)與促黃體素釋放激素類似物(LRH-A)的混合溶液進行人工催產(chǎn)，催產(chǎn)劑量為：每千克體質(zhì)量的雄性大鯢注射HCG 2 000 IU+LRH-A 20 μg。將注射后的大鯢放入具流水條件的水池中等待其精子成熟。水溫(19±1) ℃時，50 h(效應(yīng)時間)后檢查成熟情況并采集精子。

采精方法：將大鯢腹部朝上，輕壓腹部，擠出膀胱中的尿液后，采集精子(要求無糞便、無血液等污染)。放入盛有2.5%戊二醛溶液的玻璃瓶中，密封，標(biāo)記，置4 ℃冰箱保存，用于電鏡制樣和實驗觀察。

1.2.2 掃描電鏡制樣 在干凈的培養(yǎng)皿中平鋪一層濾紙，其上放置若干18 mm×18 mm的蓋玻片(平鋪、不重疊)，將煮沸的5%瓊脂液緩緩倒入(沒過蓋玻片即可)，放入37 ℃烘箱烘干；剪下蓋玻片放入新的培養(yǎng)皿中，用吸管吸取上述保存的精子溶液滴加到蓋玻片上，5 min后依次用30%、50%、70%、80%、90%、100%(2次)梯度乙醇洗滌各10 min；最后在蓋玻片上滴加一層叔丁醇，-20 ℃至結(jié)晶，真空泵干燥30 min 取出。干燥后的樣品噴金50 s，以日立SU8010掃描電鏡觀察、攝像。

1.2.3 透射電鏡制樣 取2.5%戊二醛溶液固定保存的精子溶液用磷酸鹽緩沖液(0.1 M，pH7.2～7.4)漂洗后，滴加1%鋨酸進行再固定；依次用梯度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、100%、100%)、乙醇∶丙酮(3∶1/1∶1/1∶3)、丙酮(2次)脫水，每次10 min；環(huán)氧樹脂(Epon812)包埋，萊卡(Leica U7)超薄切片機切片，5%醋酸鈾-檸檬酸鉛雙染法染色，日立HT-7700透射電鏡觀察、攝像。

2 結(jié)果

在掃描電鏡下，大鯢的成熟精子由頭部、頸部和尾部3部分組成(圖版Ⅰ：1)。精子總長216.36 μm±9.93 μm(n=30)，頭部長65.80 μm±3.70 μm(n=30)；頸部較短，多不明顯；尾部細(xì)長，長為153.52 μm±3.22 μm(n=30)，約占總長的2/3。

2.1 精子頭部結(jié)構(gòu)

掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，大鯢成熟精子頭部較直，前端漸細(xì)呈絲狀或錐狀，無頂體鉤(acrosomal bar，圖版 Ⅰ：2，4)，中后端呈棒狀，表面有密集的點狀顆粒(圖版Ⅰ：7)。成熟過程中的精子頭部中末端外周有類似細(xì)胞質(zhì)的物質(zhì)包圍成的厚壁，稱胞質(zhì)團(cytoplasmic droplet，圖版Ⅰ：6)，此外，少數(shù)精子頭部頂端有多根纖維互相纏繞成纖維束(fiber bundle，圖版Ⅰ：5)。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，大鯢精子頭部由頂體(acrosome)、穿孔器(perforatorium)和細(xì)胞核(nucleus)組成，細(xì)胞核后端凹陷的部分成為核窩(nuclear fossa)，核窩與頸部相連(圖版Ⅱ：1)。

頂體位于細(xì)胞核前端，縱切面為錐形，電子密度較高，分布均勻，外面有膜包裹，近核端在核的兩側(cè)，向頂端漸細(xì)；頂體下有一電子透明區(qū)，稱為頂體下腔(subacrosomal space)；在頂體下腔的中央，細(xì)胞核的前端，有一錐形結(jié)構(gòu)，為穿孔器(圖版Ⅱ：5)。

細(xì)胞核呈棒狀，前段漸細(xì)，與穿孔器相連(圖版Ⅱ：1)。核內(nèi)染色質(zhì)(chromatin)分布均勻，高度濃縮為致密狀態(tài)；細(xì)胞核的近前段，有一電子透明通道，為核內(nèi)通道(endonuclear canal，圖版Ⅱ：2，3，4)；核內(nèi)其他部位分布有少量不規(guī)則的電子透明區(qū)，為核空隙(lacunae，圖版Ⅱ：2，7)；細(xì)胞核內(nèi)僅在靠近核窩處有少量線粒體(mitochondria，圖版Ⅲ：3)，而在細(xì)胞核外分泌的胞質(zhì)團中發(fā)現(xiàn)有大量線粒體存在(圖版Ⅱ：7)。在大鯢精子頭部橫切中，僅見高度濃縮、分布均勻的染色質(zhì)，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核內(nèi)、外有分層現(xiàn)象(圖版Ⅱ：6)。

2.2 大鯢精子頸部結(jié)構(gòu)

大鯢精子頸部較短(圖版Ⅰ：1)，掃描電鏡下不明顯，無波動膜(undulating membrane)。透射電鏡下，可見頭部和尾部相連處存在一特殊區(qū)域，為大鯢精子的頸部。頸部由核窩(nuclear fossa)、近端中心粒及遠(yuǎn)端中心粒(proximal and distal centriole)、軸絲(axoneme)、線粒體(mitochondria)和軸纖維(axial fiber)組成(圖版Ⅲ：

1，2)。其中近端中心粒位于核窩前端，與精子長軸垂直；遠(yuǎn)端中心粒位于近端中心粒后，與精子長軸平行，形成軸絲基部。核窩內(nèi)、外分散有少量的線粒體。

圖版 Ⅰ 掃描電鏡下大鯢精子和精子頭部結(jié)構(gòu)Plate Ⅰ Scanning electron microscope photograph of the Andrias davidianus sperm and head structure

1. 完整精子， 示頭部、頸部、尾部; 2.精子頭部， 頂端為錐狀; 3. 精子頭部脫落結(jié)構(gòu); 4. 精子頭部， 頂端為絲狀; 5. 精子成熟過程中頭部頂端纖維束; 6. 精子成熟過程中頭部中間胞質(zhì)團; 7. 精子頭部末端表面顆粒突起; CD. 胞質(zhì)團， FB. 纖維束， H. 頭， Ne. 頸， Pa. 顆粒物突起， T. 尾。

1.The whole photograph of spermatozoa， showing the head， neck and tail; 2. The conical top of the head; 3. The caduceus structure of head; 4. The filiform top of head; 5. The fiber bundle on the top of head during the process of sperm maturation; 6. The cytoplasmic droplet in the middle of head during the process of sperm maturation; 7. Particulates on the surface of head end; CD. cytoplasmic droplet， FB. fiber bundle， H. head， Ne. neck， Pa. particulates， T. tail.

圖版Ⅱ 透射電鏡下精子頭部結(jié)構(gòu)Plate Ⅱ Transmission electron microscope photograph of the head structure of Andrias davidianus sperm

1、2、4、5. 精子頭部縱切， 示頭部頂體、頂體下腔、穿孔器、細(xì)胞核、核窩和核內(nèi)通道; 3. 精子頭部橫切， 示細(xì)胞核、核內(nèi)通道; 6. 精子頭部橫切， 示細(xì)胞核、核空隙和頭部外胞質(zhì)團中線粒體; 7. 精子頭部橫切， 示細(xì)胞核; A. 頂體， EC. 核內(nèi)通道， La. 空隙， Mi. 線粒體， N. 細(xì)胞核， NF. 核窩，Pe. 穿孔器， SS. 頂體下腔。

1， 2， 4， 5. Longitudinal section of sperm head， showing acrosome， subacrosomal space， perforatorium， nucleus， nuclear fossa and endonuclear canal;3. Cross section of head， showing nucleus and endonuclear canal; 6. Cross section of head， showing nucleus， lacunae and mitochondrions around the head; 7. Cross section of head， showing nucleus; A. acrosome， EC. endonuclear canal， La. lacunae， Mi. mitochondrion， N. nucleus， NF. nuclear fossa， Pe. perforatorium， SS. subacrosomal space.

2.3 大鯢精子尾部結(jié)構(gòu)

大鯢精子尾部由軸纖維(axial fiber)、波動膜、軸絲(axoneme)和軸絲旁纖維(juxta-axonemal fiber)組成(圖版Ⅲ：5)。掃描電鏡下可見，軸纖維呈圓柱形，與頸部相連；波動膜包圍軸纖維并與軸絲相連；軸絲較長，從頭部末端一直貫穿至尾部，呈“Ω”形依附在軸纖維上，部分精子在尾部末端可以看到單獨的軸絲結(jié)構(gòu)(圖版Ⅲ：4)。透射電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，軸纖維與精子長軸平行，緊接于頸部近端中心粒下面，并一直延伸到尾部；軸纖維橫切面近似“心”形，主要由2種不同成分構(gòu)成，外層電子密度較低，稱為皮質(zhì)(cortex)，內(nèi)層電子密度較高，稱為髓質(zhì)(medulla)，皮質(zhì)層外面有膜包裹(圖版Ⅲ：5)；波動膜為膜樣結(jié)構(gòu)，橫切片可見波動膜包裹著整個軸纖維，膜的一側(cè)伸展與軸絲相連，連接段中充滿細(xì)胞質(zhì)；軸絲由2根中央微管和9對外周微管組成，屬典型的“9+2”結(jié)構(gòu)；軸絲的一側(cè)平行排列著致密纖維，稱為軸絲旁纖維，橫切顯示，軸絲旁纖維呈半圓形，外面有膜包裹(圖版Ⅲ：6)。

3 討論

3.1 大鯢精子頭部頂體結(jié)構(gòu)探討

頂體是精子結(jié)構(gòu)中最重要的部分之一，是受精的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。頭部有頂體、頂體下錐、穿孔器是有尾兩棲動物精子的共同特征。已有研究表明，兩棲類小鯢科、蠑螈科的龍洞山溪鯢Batrachuperuslongdongensis(鄭中華等，2005)、鎮(zhèn)海棘螈Echinotritonchinhaiensis(鄭中華等，2004)、意大利蠑螈Lissotritionitalicus(Emilioetal.，2009)、眼鏡蠑螈Salamandrinaterdigitata(Selmietal.，1997)、高山蠑螈Triturarsalpestrisapuanzcs(Selmietal.，1997)等的精子頭部前端均有頂體結(jié)構(gòu)存在，穿孔器起始于頂體前段或頂體鉤，延伸到細(xì)胞核前部末端。

圖版Ⅲ 掃描和透射電鏡下大鯢精子頸部和尾部結(jié)構(gòu)

Plate Ⅲ Scanning electron microscope and transmission electron microscope photograph of the neck and tail structure ofAndriasdavidianussperm

1. 精子頸部、尾部縱切， 示近、遠(yuǎn)端中心粒、軸絲、軸纖維、線粒體; 2.精子頸部橫切， 示核窩、線粒體、遠(yuǎn)端中心粒; 3. 精子縱切， 示細(xì)胞核、線粒體、軸纖維、皮質(zhì)、髓質(zhì); 4. 掃描電鏡精子尾部， 示軸絲、軸纖維、波動膜; 5、6. 精子尾部橫切， 示軸絲、軸纖維、波動膜、軸絲旁纖維、皮質(zhì)和髓質(zhì); AF. 軸纖維， AX. 軸絲， Co. 皮質(zhì)， Cy. 胞質(zhì)， DC. 遠(yuǎn)端中心粒， J-AX. 軸絲旁纖維， La. 空隙， Me. 髓質(zhì)， Mi. 線粒體， MT. 微管， PC. 近端中心粒， UM. 波動膜。

1. Longitudinal section of neck and tail， showing distal and proximal centriole， axoneme， axial fiber and mitochondrion; 2. Cross section of neck， showing nuclear fossa， mitochondrion and distal centriole; 3. Longitudinal section of sperm， showing nucleus， mitochondrion， axial fiber， cortex and medulla;4. SEM tail structure， showing axoneme， axial fiber， and undulating membrane; 5， 6. Cross section of tail， showing axoneme， axial fiber， undulating membrane, juxta-axonemal fiber， cortex and medulla; AF. axial fiber， AX. axoneme, Co. cortex, Cy. cytoplasm, DC. distal centriole， J-AX. juxta-axonemal fiber， La. lacunae， Me. medulla， Mi. mitochondrion， MT. microtubules， PC. proximal centriole， UM. undulating membrane.

不同研究者關(guān)于大鯢精子頭部有無頂體及其頂體結(jié)構(gòu)的看法不一。周海燕等(2003)認(rèn)為，大鯢精子頭部無頂體，精子頭部前段的絲狀結(jié)構(gòu)為染色質(zhì)，僅有1層細(xì)胞質(zhì)膜包圍，膜內(nèi)沒有囊泡和高爾基復(fù)合體，不是頂體結(jié)構(gòu)。而鄭中華等(2008)、彭亮躍(2010)的研究表明，大鯢精子頭部具有頂體，但兩者對頂體結(jié)構(gòu)認(rèn)識不同。鄭中華等(2008)采用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，大鯢精子頭部頂端為頂體，頂體由頂體鞘(acrosomal sheath)和穿孔器組成；有一部分精子頭部的頂體鞘脫落，僅見細(xì)長如針狀的穿孔器存在。彭亮躍(2010)在透射電鏡下發(fā)現(xiàn)，大鯢精子頭部存在頂體復(fù)合物，由頂體、頂體下錐和穿孔器組成；掃描電鏡下大鯢精子頭部頂端只見一細(xì)絲狀結(jié)構(gòu)，為穿孔器。

本研究認(rèn)為大鯢精子同其他有尾兩棲類相似，存在頂體和穿孔器。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，大鯢精子頭部前端漸細(xì)，呈錐狀或絲狀。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，大鯢精子頭部由頂體、穿孔器和細(xì)胞核組成，頂體位于細(xì)胞核前端，縱切面為錐形，電子密度較高，分布均勻，外面有膜包裹，近核端在核的兩側(cè)，向頂端漸細(xì)；穿孔器為一錐形結(jié)構(gòu)，位于頂體下腔的中央，細(xì)胞核的前端，與彭亮躍(2010)報道中的圖片基本相似。綜合認(rèn)為，掃描電鏡下觀察到的錐形頭部尖端即為精子頂體，絲狀結(jié)構(gòu)為精子頭部頂端頂體鞘脫落后裸露的穿孔器，精子頭部頂體鞘脫落現(xiàn)象普遍(鄭中華等，2008)；本研究精子頭部橫切在透射電鏡下未觀察到頂體和穿孔器，或與切片制作過程有關(guān)。大鯢精子的頭部結(jié)構(gòu)與大鯢成熟卵子表面平整、不存在受精孔(鄧鳳嬌等，1998；彭亮躍，2010)的生理結(jié)構(gòu)是適應(yīng)的，而大鯢精子頭部頂體鞘脫落現(xiàn)象對精子活力及受精能力的影響有待進一步研究。與其他有尾兩棲動物不同，大鯢精子頭部無頂體下錐，這可能是由于頂體下錐和穿孔器功能相似(Gardaetal.，2002)導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)簡化。

表1 大鯢與其他有尾目動物精子尾部結(jié)構(gòu)比較Table 1 The tail structure of Andrias davidianus sperm compared with other species of Urodela

注： +表示存在， -表示不存在。

Notes： + present， - absent.

3.2 大鯢精子活力狀況與其線粒體數(shù)量

線粒體通常是精子維持運動的主要能量來源。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，大鯢精子僅在頭部細(xì)胞核靠近核窩處和頸部有少量線粒體存在，尾部不見線粒體的分布，這與線粒體大量存在于精子尾部的有尾兩棲動物，如蠑螈科(鄭中華等，2004)、鈍口螈科(Sever & Klopfer，1993)和無肺螈科(Worthametal.，1977)等科的物種有明顯差別。喬志剛等(2013)研究報道，人工催產(chǎn)雄性大鯢，觀察到大鯢成熟精子運動緩慢、精子活力維持時間短，結(jié)合人工催產(chǎn)大鯢受精率較低的這一生產(chǎn)實際，分析可能與大鯢精子線粒體數(shù)量少，精子運動缺乏能量供給有關(guān)。

另外，研究發(fā)現(xiàn)，精子成熟過程中頭部會分泌大量細(xì)胞質(zhì)，在精子頭部外周形成厚厚的突起，其中含有大量線粒體，推測這可能是在精子變態(tài)過程中，線粒體隨胞質(zhì)排出體外的一種正常現(xiàn)象，但線粒體外排的機理和作用仍有待深入研究。

3.3 大鯢與其他有尾目動物精子尾部結(jié)構(gòu)比較

兩棲類有尾目動物精子結(jié)構(gòu)的研究表明，精子尾部多有中段、主段、末段之分，且各段組成結(jié)構(gòu)、軸纖維的形狀多有不同。一般情況下，中段由軸纖維、軸絲、波動膜、軸絲旁纖維和線粒體組成，主段線粒體消失，末段通常只有軸絲和軸絲旁纖維。

與其他有尾目動物的精子結(jié)構(gòu)相比較，大鯢精子尾部符合有尾目動物精子結(jié)構(gòu)的一般特征，其尾部也由軸纖維、軸絲、波動膜和軸絲旁纖維組成。但大鯢精子的尾部結(jié)構(gòu)相對簡單，其尾部沒有明顯的分段，橫切面似“心”形狀。同小鯢科物種相似，大鯢精子尾部沒有線粒體(表1)。

研究認(rèn)為大鯢精子尾部的軸絲結(jié)構(gòu)在精子運動中起著重要作用，而精子尾部的波動膜或類似于魚類精子結(jié)構(gòu)中的側(cè)鰭(劉雪珠，楊萬喜，2002)，不僅起到連接軸絲與軸纖維的作用，可能對大鯢精子波浪式的運動具有一定的推動作用。

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Study on the Spermatozoon Structure ofAndriasdavidianus

QIAOZhigang，SHENFangfang，LIUShuyan

(Fisheries College， Henan Normal University， Xinxiang， Henan Province 453007， China)

To understand the morphology and structure of the sperm of theAndriasdavidianus， and increase the success of artificial insemination， the morphology and ultrastructure of the sperm ofA.davidianuswere studied by transmission and scanning electron microscopy. The results showed that the sperm ofA.davidianuswas composed of head， neck and tail. The total length of a sperm was 216.36 μm±9.93 μm (n=30)， of which the head was 65.80 μm±3.70 μm (n=30) long， and the tail was 153.52 μm±3.22 μm (n=30) long. The head was consisted of acrosome, perforatorium and nucleus. The neck was consisted of nuclear fossa， proximal and distal centrioles， mitochondrias， axoneme and axial fiber. The tail was integrated with no clear segmentation and consisted of axoneme， axial fiber， juxta-axonemal fiber and undulating membrane. The sperm ofA.davidianushad less mitochondrion， and this might be accordant to the short duration and slow motion of sperm. However， there were some mitochondria in the cellular secretions that surrounding around sperm cell head during maturation process.

Andriasdavidianus; sperm; ultrastructure

2016-04-15 接受日期：2016-06-08

國家自然科學(xué)基金項目(30250001); 河南省科技攻關(guān)項目(0224050027)

喬志剛(1965—)， 男， 博士， 教授， 從事水產(chǎn)苗種工程及集約化健康養(yǎng)殖研究， E-mail：hnsddsyy@126.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20160083

Q952.4； Q959.5

A

1000-7083(2016)04-0534-07