ISSR分子標(biāo)記鑒定巴馬香豬

金玉蘭， 李婉麗， 李松， 李璽洋， 楊陽(yáng)， 陳秋虹， 孫群*

(1. 四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，成都610064； 2. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610064； 3. 廣西壯族自治區(qū)分析測(cè)試研究中心，南寧530022)

ISSR分子標(biāo)記鑒定巴馬香豬

金玉蘭1， 李婉麗2， 李松2， 李璽洋2， 楊陽(yáng)2， 陳秋虹3， 孫群2*

(1. 四川大學(xué)輕紡與食品學(xué)院，成都610064； 2. 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都610064； 3. 廣西壯族自治區(qū)分析測(cè)試研究中心，南寧530022)

結(jié)合線粒體基因和ISSR兩種DNA分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)巴馬香豬、環(huán)江香豬、藏豬、巴馬本地土豬和成華豬進(jìn)行種類鑒定。研究從55條ISSR引物中篩選出1條帶型清晰、重復(fù)性好的引物53可以鑒別巴馬香豬、環(huán)江香豬、藏豬、巴馬本地土豬和成華豬。巴馬香豬與藏豬線粒體基因分析結(jié)果表明，藏豬具有特異的短串聯(lián)重復(fù)片段“TGTGTACGCA”，可用于進(jìn)一步鑒別巴馬香豬與藏豬。ISSR分子標(biāo)記與聚類分析結(jié)果顯示，引物53可以鑒別5種豬并成功鑒定了一份未知種類的巴馬產(chǎn)豬肉樣品。結(jié)果表明，ISSR分子標(biāo)記與線粒體基因聯(lián)合分析可以快速準(zhǔn)確鑒別巴馬香豬、環(huán)江香豬、藏豬、巴馬本地土豬和成華豬。

巴馬香豬；鑒定；線粒體基因；ISSR

我國(guó)是世界上豬品種資源最豐富的國(guó)家之一，擁有70多個(gè)地方豬品種。我國(guó)地方豬品種具有繁殖性能高、肉質(zhì)好、耐粗飼、抗病力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但由于受國(guó)外引進(jìn)豬品種的競(jìng)爭(zhēng)，地方豬品種的飼養(yǎng)量已經(jīng)大大減少，甚至有許多地方豬品種已處于瀕危狀態(tài)(歐陽(yáng)解秀，王立賢，2013)。巴馬香豬起源于廣西壯族自治區(qū)巴馬瑤族自治縣，是國(guó)家級(jí)畜禽品種資源保護(hù)豬品種之一，屬于封閉近交繁殖品種，遺傳性能穩(wěn)定(張蓮英等，2011)。巴馬香豬具有肉質(zhì)細(xì)嫩、清香可口、風(fēng)味獨(dú)特等優(yōu)良特點(diǎn)，是制作烤乳豬、臘全豬和腌肉的上乘原料，頗受消費(fèi)者喜愛(ài)。然而市場(chǎng)上銷售的巴馬香豬肉制品真?zhèn)坞y辨，目前對(duì)巴馬香豬的鑒別主要以外觀的描述為主，尚缺乏有效的基因檢測(cè)手段。為了維持巴馬香豬市場(chǎng)秩序，促進(jìn)其產(chǎn)業(yè)發(fā)展，亟需探索一種快捷、準(zhǔn)確地鑒別巴馬香豬肉制品真?zhèn)蔚姆肿訕?biāo)記技術(shù)。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)是繼形態(tài)學(xué)、細(xì)胞學(xué)、生化等遺傳標(biāo)記技術(shù)后能夠穩(wěn)定可靠反映物種遺傳特點(diǎn)的最新分子標(biāo)記技術(shù)(王春俠，仇敬運(yùn)，2007)。與核DNA相比，線粒體DNA具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、嚴(yán)格遵守母系遺傳方式、進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，現(xiàn)已在動(dòng)物的系統(tǒng)發(fā)生、物種鑒定和種群結(jié)構(gòu)等研究中得到廣泛應(yīng)用(劉超等，2003；張俊麗等，2010；李楠楠等，2012)。ISSR(inter-simple sequence repeat)分子標(biāo)記的基本原理是以SSR(simple sequence repeat)的3’端或5’端錨定1～4個(gè)隨機(jī)堿基為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，特異地?cái)U(kuò)增出具有反向排序的微衛(wèi)星區(qū)域間的DNA序列(Zietkiewiczetal.，1994)，具有成本較低、操作簡(jiǎn)單、良好的穩(wěn)定性、重復(fù)性、豐富的多態(tài)性以及能較好地反映物種的遺傳結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性變化等特點(diǎn)。ISSR技術(shù)在動(dòng)物遺傳學(xué)中主要應(yīng)用于遺傳多樣性、資源鑒定與分類、親緣關(guān)系與系統(tǒng)發(fā)育的構(gòu)建以及動(dòng)物標(biāo)記輔助選育等方面(Nagornyuk & Glazko，2007；韓曉磊等，2010；Zamani，2011)。Yang等(2013)在對(duì)5種貂(standard-pitchy mink，sapphire mink，brown mink，black mink，white mink)的基因多樣性進(jìn)行ISSR分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，5種貂具有較高的基因多樣性，UPGMA聚類分析將5種貂分為2組，其中standard-pitchy mink單獨(dú)聚為一類，其他4種聚為一類，說(shuō)明品種間遺傳分化程度低。Maltagliati等(2006)用ISSR方法成功鑒定了2份未知屬于Valenciahispanica樣品。何榆林等(2014)利用ISSR分子標(biāo)記成功地鑒定了陸川豬及其肉制品。因此ISSR分子標(biāo)記是一種有效的種質(zhì)資源鑒定方法。

目前，對(duì)巴馬香豬的研究主要集中在遺傳多樣性和親緣關(guān)系(陳丙波等，2003)；另一方面，用ISSR分子標(biāo)記鑒定哺乳動(dòng)物肉制品源性的研究不多，特別是對(duì)巴馬香豬肉源性真?zhèn)蔚蔫b別研究更少。巴馬香豬與巴馬本地土豬和環(huán)江香豬親緣關(guān)系較近，肉源真?zhèn)尾灰讌^(qū)分，本研究采用線粒體基因和ISSR兩種DNA分子標(biāo)記建立一種可靠、快速鑒別巴馬香豬與巴馬本地土豬和環(huán)江香豬的方法，同時(shí)將該方法推廣到成華豬和藏豬進(jìn)行驗(yàn)證。研究結(jié)果對(duì)于巴馬香豬品牌的保護(hù)和市場(chǎng)的規(guī)范具有重要意義，也對(duì)巴馬香豬等地方豬品種的資源保護(hù)提供重要的遺傳依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉樣品分類及數(shù)量(表1)：巴馬香豬(n=5)，環(huán)江香豬(n=3)，巴馬本地土豬(n=3)，藏豬(n=2)，成華豬(n=3)，1份巴馬產(chǎn)豬肉樣。每種樣品均取自原產(chǎn)地及純種養(yǎng)殖場(chǎng)，可以保證樣品的純種性和真實(shí)性。

實(shí)驗(yàn)所用55個(gè)ISSR引物(表2)：其中引物1～34來(lái)自何榆林等(2014)，引物35～43來(lái)自Maltagliati等(2006)，引物44～55來(lái)自Yang等(2013)。自行設(shè)計(jì)了擴(kuò)增巴馬香豬與其他豬種線粒體差異基因位點(diǎn)的引物A：上游引物5’-AACAAGGTGCTATTC-AGTC-3’，下游引物5’-TCTTTAGGATCTGGAGGG-3’。

表1 實(shí)驗(yàn)樣品種類、編號(hào)及來(lái)源Table 1 Details of the pig breeds tested in the study

表2 ISSR引物序列Table 2 ISSR primer sequence

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀(Bio-Rad PTC-200)，瓊脂糖凝膠電泳儀(Bio-Rad Powerpace Basic)，凝膠成像分析儀(Universal Hood Ⅱ，Bio-Rad)，超微量蛋白核酸分析儀(BioDrop μLite)。

1.3 方法

1.3.1 樣品DNA提取及純度檢驗(yàn) 稱取生鮮豬肉樣品0.5 g，液氮研磨，按照說(shuō)明書提取DNA(天根血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit)。0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，并通過(guò)超微量蛋白核酸分析儀檢測(cè)所提取的DNA質(zhì)量以及OD260nm和OD280nm濃度，測(cè)定DNA純度OD260nm/OD280nm。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR 反應(yīng)及產(chǎn)物檢測(cè) 反應(yīng)體系：模板DNA 1.5 μL、引物1 μL、2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，退火45 s(引物A的退火溫度為55 ℃，引物53的退火溫度為51 ℃)，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。線粒體基因分析中的PCR產(chǎn)物送Invitrogen公司進(jìn)行直接測(cè)序。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析 ISSR電泳成像后，利用Quantity One對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行UPGMA聚類分析，并比較個(gè)體間的相似性。

2 結(jié)果

2.1 ISSR分子標(biāo)記鑒別巴馬香豬結(jié)果與分析

2.1.1 ISSR分子標(biāo)記結(jié)果 實(shí)驗(yàn)對(duì)5種豬肉全基因組進(jìn)行了PCR擴(kuò)增和帶型分析，在55個(gè)ISSR引物中篩選出了1個(gè)多態(tài)性好、條帶清晰的引物——引物53：5’-(ATG)6-3’，可用于區(qū)別巴馬香豬、環(huán)江香豬、巴馬本地土豬、藏豬和成華豬。如圖1所示，引物53在環(huán)江香豬(B1、B2、B3)和藏豬(D1、D2)的樣品中擴(kuò)增獲得1條1 300 bp左右的特異性條帶，而巴馬香豬沒(méi)有該條帶。同樣地，該引物在巴馬本地土豬(C1、C2、C3)和成華豬(E1、E2、E3)中能夠擴(kuò)增出1條700～800 bp的特異性條帶，而巴馬香豬沒(méi)有此條帶。說(shuō)明此引物能夠?qū)婉R香豬與環(huán)江香豬、巴馬本地土豬、藏豬和成華豬區(qū)分開(kāi)。ISSR分子標(biāo)記結(jié)果顯示，未知肉樣C’的條帶與巴馬香豬的條帶一致，因此可以初步判定C’為巴馬香豬樣品。

圖1 引物53擴(kuò)增出的5個(gè)品種豬肉的電泳圖譜Fig. 1 Electrophoresis fingerprinting of amplification products from pork of five different breeds

2.1.2 UPGMA聚類分析 為了進(jìn)一步了解巴馬香豬和其他4種豬的親緣關(guān)系，對(duì)巴馬香豬、環(huán)江香豬、巴馬本地土豬、藏豬和成華豬進(jìn)行聚類分析(圖2)。UPGMA結(jié)果顯示，5個(gè)豬種分為2個(gè)類群，成華豬和巴馬本地土豬為一個(gè)類群，藏豬、環(huán)江香豬和巴馬香豬為一個(gè)類群。根據(jù)《中國(guó)豬品種志》(《中國(guó)家畜家禽品種志》編委會(huì)，《中國(guó)豬品種志》編寫組，1986)，巴馬香豬和環(huán)江香豬同屬于華南型香豬，藏豬屬于高原型地方豬，均屬于小型豬。說(shuō)明通過(guò)UPGMA聚類能很好地區(qū)分不同品種的豬。在小型豬類群中，巴馬香豬聚為一類，而藏豬和環(huán)江香豬聚為一類?？梢钥闯霭婉R香豬因其特殊的封閉式近親繁殖方式使得其分化程度低，從發(fā)育樹(shù)中可以看到未鑒別的C’與巴馬香豬聚為一類，與上述的指紋圖譜中得到的結(jié)果一致，可以判定C’為巴馬香豬肉樣，也說(shuō)明引物53能夠有效地鑒別巴馬香豬與其他4種豬。

2.2 用線粒體基因區(qū)別巴馬香豬和藏豬

ISSR分子標(biāo)記的PCR擴(kuò)增電泳圖譜中，與巴馬香豬相比，藏豬的1 300 bp左右的特異性條帶比較模糊。為了進(jìn)一步鑒別巴馬香豬與藏豬，將NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中巴馬香豬和藏豬線粒體基因進(jìn)行初步比對(duì)，與巴馬香豬相比，藏豬在簡(jiǎn)短重復(fù)序列的重復(fù)數(shù)量上有差異。針對(duì)該差異設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增線粒體基因組的差異位點(diǎn)，擴(kuò)增的片段為線粒體基因組第663至第1 489位堿基，片段大小約800 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物由Invitrogen公司直接測(cè)序比對(duì)，結(jié)果如表3所示。研究發(fā)現(xiàn)，在擴(kuò)增的區(qū)域中，與巴馬香豬比較，藏豬具有特異的短串聯(lián)重復(fù)序列“TGTGTACGCA”(圖3)。因此，可以利用此差異位點(diǎn)區(qū)分藏豬與巴馬香豬。

圖2 ISSR分析中5種豬肉的UPGMA聚類分析Fig. 2 Cluster analysis of the ISSR band patterns of pork of different breed with Quantity One software表3 線粒體基因組差異位點(diǎn)Table 3 Loci difference in mtDNA

樣品重復(fù)片段位置長(zhǎng)度/bp重復(fù)數(shù)重復(fù)序列A1444～6971025CGTGTACGCAA2457～7191026CGTGTACGCAA3455～6971024CGTGTACGCAA4456～7221026CGTGTACGCAA5455～7111025CGTGTACGCAD1587～645106TGTGTACGCA456～7191020CGTGTACGCAD2586～646106TGTGTACGCA457～7001018CGTGTACGCA

3 討論

巴馬香豬為珍稀的地方優(yōu)勢(shì)品種豬，2005年國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢疫總局發(fā)布公告，宣布巴馬香豬為國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品并實(shí)施保護(hù)。常用的屠宰指標(biāo)和失水率、色澤、剪切力等肉質(zhì)指標(biāo)因受飼養(yǎng)環(huán)境和生物

個(gè)體差異不能可靠地鑒定巴馬香豬品種。DNA分子標(biāo)記技術(shù)可以反映物種分子水平上的差異，而現(xiàn)有的對(duì)巴馬香豬的研究主要集中在遺傳多態(tài)性的分析。吳豐春等(2000)對(duì)巴馬小型豬群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA分析顯示，廣西巴馬小型豬個(gè)體間相似系數(shù)為0.78～0.96，其多態(tài)性頻率僅為27.7%，顯著低于一般品種豬的水平。說(shuō)明巴馬小型豬個(gè)體的選育程度和個(gè)體相似程度較高，具有較好的遺傳一致性和遺傳穩(wěn)定性。劉中祿等(2001)應(yīng)用PCR-RFLP、PCR-SSCP和PCR直接測(cè)序?qū)χ袊?guó)3種實(shí)驗(yàn)用小型豬(西雙版納近交系小耳豬、廣西巴馬小型豬和貴州小型豬)線粒體DNA D-loop多態(tài)性分析觀察單鏈構(gòu)象多態(tài)性和序列多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)3種豬之間mtDNA多態(tài)性貧乏，說(shuō)明其親緣關(guān)系近且母系起源進(jìn)化上具有一致性，因此上述方法不能作為3種實(shí)驗(yàn)用小型豬品種品系的鑒定依據(jù)。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)中，ISSR分子標(biāo)記已被證明是分析基因多樣性的一種高效、經(jīng)濟(jì)的方式，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于種類鑒定和遺傳關(guān)系分析。ISSR分子標(biāo)記在種類鑒定方面與其在植物研究中的應(yīng)用相比，在動(dòng)物中特別是哺乳動(dòng)物的研究中還處于起步階段(林杰君等，2012)。何榆林等(2014)利用ISSR分子標(biāo)記鑒定陸川豬及其肉制品中篩選出3個(gè)ISSR引物能夠鑒別陸川豬和巴馬香豬，與本實(shí)驗(yàn)有相似之處，但沒(méi)有進(jìn)一步研究巴馬香豬與其他豬品種的鑒別方法。本研究選擇了不同的小型豬樣本(巴馬香豬、環(huán)江香豬、藏豬)和普通豬樣本(巴馬本地土豬和成華豬)，從55條ISSR引物中成功篩選出1條有效引物能夠鑒別巴馬香豬和其他4種豬。通過(guò)聚類分析發(fā)現(xiàn)，普通豬樣本聚為一類，而小型豬樣本聚為一類，因此UPGMA聚類分析能夠有效地驗(yàn)證ISSR擴(kuò)增結(jié)果。綜上所述，結(jié)合ISSR分子標(biāo)記和線粒體基因分析可快速準(zhǔn)確地鑒定巴馬香豬、環(huán)江香豬、藏豬、巴馬本地土豬和成華豬。研究結(jié)果對(duì)保障巴馬香豬品種純正，規(guī)范巴馬香豬市場(chǎng)和推動(dòng)巴馬香豬產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程有重要意義，同時(shí)有助于巴馬香豬養(yǎng)殖開(kāi)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化體系的建立。ISSR分子標(biāo)記成功鑒別巴馬香豬有利于調(diào)動(dòng)地方保種的積極性，并為我國(guó)珍稀豬品種遺傳資源的保護(hù)工作提供參考。

圖3 巴馬香豬與藏豬線粒體基因短串聯(lián)重復(fù)序列比較Fig. 3 Comparison of tandem repeat sequence between Bama miniature pig and Tibetan pig

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Species Authentication of Bama Miniature Pig through Inter-simple Sequence Repeat

JIN Yulan1， LI Wanli2， LI Song2， LI Xiyang2， YANG Yang2， CHEN Qiuhong3， SUN Qun2*

(1. College of Light Industry， Textile and Food Engineering， Sichuan University， Chengdu 610064，China;2. College of Life Sciences， Key Laboratory of Bio-resource and Eco-environment of Ministry of Education， Sichuan University，Chengdu 610064， China; 3. Guangxi Zhuang Autonomous Region for Analysis and Test Research， Nanning 530022， China)

In this study， species identification of Bama miniature pig was carried out by DNA fingerprinting of meats from Tibetan pig， Huanjiang miniature pig， Bama native pig， and Chenghua pig through inter-simple sequence repeat (ISSR) and mitochondrial DNA (mtDNA) analysis. One clear and repeatable primer pair named No. 53 was selected from 55 primers， which successfully separated Bama miniature pig from the other four pigs. To further differentiate Bama miniature pig and Tibetan pig， specific tandem repeat sequence of Tibetan pig ‘TGTGTACGCA’ was found out in the mtDNA. According to the results of ISSR and UPGMA cluster analysis， primer No. 53 was able to attribute to the identification of the five different pigs and one unknown pig. Therefore， ISSR coupled with UPGMA and mtDNA analysis represented an effective tool in species identification.

Bama miniature pig; identification; mitochondrial gene; inter-simple sequence repeat (ISSR)

10.11984/j.issn.1000-7083.20160017

2016-01-11 接受日期：2016-04-05 基金項(xiàng)目：廣西科學(xué)研究與技術(shù)開(kāi)發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(12118011-2B)

金玉蘭(1992—)， 碩士， 主要研究領(lǐng)域?yàn)槭称房茖W(xué)， E-mail:jin199271@126.com

*通信作者Corresponding author， 女， 教授， 博士， 研究方向?yàn)槭称钒踩?E-mail:qunsun@scu.edu.cn

Q959.8； Q78

A

1000-7083(2016)04-0569-05