4-氨基吡啶抑制肺癌細胞SPCA1及PC9增殖及其分子機理的研究

甄艷，黎東明,2，黃玉潔,2，谷紅麗,2，吳斌,2

(廣東醫(yī)科大學 附屬醫(yī)院 1.呼吸疾病研究所; 2.呼吸內(nèi)科，廣東 湛江 524001)

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4-氨基吡啶抑制肺癌細胞SPCA1及PC9增殖及其分子機理的研究

甄艷1，黎東明1,2，黃玉潔1,2，谷紅麗1,2，吳斌1,2

(廣東醫(yī)科大學 附屬醫(yī)院 1.呼吸疾病研究所; 2.呼吸內(nèi)科，廣東 湛江 524001)

目的 探討4-氨基吡啶(4-AP)對肺癌細胞增殖的影響及分子機制。方法 濃度為0、0.195、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25 mmol/L的4-AP分別處理SPCA1和PC9細胞48 h，MTT法測定4-AP對肺癌細胞的抑制率及IC50。濃度為0、4.7或0、6.25 mmol/L的4-AP分別處理SPCA1和PC9細胞0、24、48、72 h或14 d或48 h，MTT法測定肺癌細胞的增殖率或平板克隆形成實驗測定肺癌細胞的增殖或流式細胞儀檢測細胞周期。濃度為0、3、4.7或0、3.125、6.25 mmol/L的4-AP分別處理SPCA1和PC9細胞48 h，利用Western blot檢測PI3K/AKT信號通路和細胞周期相關蛋白。結(jié)果 MTT結(jié)果顯示，4-AP 濃度越高，對肺癌細胞增殖的抑制越強，SPCA1和PC9細胞的IC50分別為4.7 mmol/L和6.25 mmol/L。MTT法顯示，4-AP組細胞生長速度減慢(P<0.01)。平板克隆結(jié)果顯示，與對照組相比，4-AP組細胞平板克隆小且數(shù)量少(P<0.05)。流式細胞儀檢測細胞周期顯示，4-AP組細胞G1期比例增多(P<0.05)。Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，4-AP組細胞中，P21表達上調(diào)，p-PI3K (Tyr458)、p-AKT (Ser473)、CCND1和CDK4表達下調(diào)，PI3K和AKT表達不變。結(jié)論 4-AP抑制肺癌細胞生長，且4-AP可能通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路及下游細胞周期相關蛋白的表達。

4-氨基吡啶; 非小細胞肺癌；生長

近年來肺癌已經(jīng)成為大多數(shù)國家惡性腫瘤死亡的首要原因[1]，5年總體生存率僅為10%左右[2]。手術治療被認為是早中期最有效的治療方法，但由于肺癌早期癥狀大多無特異性，臨床上大部分患者就診時已確診肺癌晚期，錯過手術的最佳時期?；熥鳛檩o助治療手段或晚期肺癌的主要治療方法，仍然是不可缺少的手段。因此，尋找有效的化療藥物成為惡性腫瘤治療研究的熱點之一。

4-氨基吡啶(4-aminopyridine，4-AP)，是一個常用的K+通道阻滯劑，在多種惡性腫瘤中抑制細胞增殖，包括肝癌[3]、急性髓系白血病[4]和神經(jīng)膠質(zhì)瘤[5]等。因此，4-AP可以看作是一個治療惡性腫瘤的潛在藥物。本研究采用不同濃度的4-AP與肺癌細胞體外共培養(yǎng)，然后通過MTT法、平板克隆形成實驗和流式細胞儀檢測細胞周期，探討4-AP對肺癌細胞增殖的影響，同時檢測細胞中PI3K/AKT信號通路及下游細胞周期相關蛋白的變化，為4-AP抗癌作用及其機理研究奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 肺癌細胞株 SPCA1、PC9均由南方醫(yī)科大學腫瘤研究所方唯意教授饋贈，培養(yǎng)基是含10%(φ)胎牛血清的DMEM，在37 ℃、5%(φ)CO2、飽和濕度的條件下傳代培養(yǎng)，細胞生長狀態(tài)良好時用于實驗。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司)；胎牛血清(BI公司)；0.25%胰酶(吉諾生物)；4×SDS上樣緩沖液(TAKARA公司)； MTT、DMSO、4-AP (Sigma公司)；細胞周期檢測試劑盒(碧云天)；磷酸酶抑制劑(申能博彩)；蛋白Marker(Fermantas公司)；RIPA、PMSF蛋白裂解液及增強型化學發(fā)光檢測試劑盒(碧云天)； CCND1、p-PI3K (Tyr458)、p-AKT(Ser473)、PI3K、AKT、CCND1、CDK4和P21抗體及HRP標記的抗鼠、抗兔二抗(Cell Signaling Technology公司)；β-actin抗體(Proteintech公司)。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)；超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)；流式細胞儀(BD公司)；Model 680酶標儀、垂直凝膠電泳系統(tǒng)及蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜、高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

1.2 MTT實驗檢測4-AP對肺癌細胞增殖的影響

按5 000個/孔接種細胞于96孔板中，每組5個復孔，每孔體積200 μL，同時設空白對照(僅加培養(yǎng)基)。待細胞貼壁后，棄掉孔內(nèi)原培養(yǎng)液，加入4-AP至終濃度為0、0.195、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25 mmol/L，培養(yǎng)48 h?；蚣尤?-AP至終濃度為0、4.7或0、6.25 mmol/L，培養(yǎng)0、24、48、72 h。每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入DMSO 150 μL，室溫避光搖床振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，以空白對照孔調(diào)零，用酶標儀(λ=490 nm)測定各孔吸光度值(A值)，以相應的A值表示細胞生長能力。各組取平均值，重復3次，繪制生長曲線。

1.3 平板克隆形成實驗檢測4-AP對肺癌細胞生長的影響

取狀態(tài)良好的細胞，制備成單細胞懸液，于6孔板中按照每孔100個細胞接種，每組設2個復孔，待細胞貼壁后，加入4-AP至終濃度為0、4.7或0、6.25 mmol/L，5%CO237 ℃孵箱培養(yǎng)約14 d，至肉眼清晰可辨的細胞克隆形成，棄培基，D-hanks清洗3次，空氣干燥；甲醇固定10 min后，棄甲醇空氣干燥；用蘇木素染色5 min，流水緩慢吸取染液，空氣干燥后計數(shù)形成的克隆數(shù)(≥50個細胞為1個克隆)。實驗重復3次。

1.4 流式細胞術檢測4-AP對肺癌細胞周期的影響

將狀態(tài)良好的細胞接種于6孔板中，每組2個復孔。待細胞匯合度達60%時，棄掉孔內(nèi)原培養(yǎng)液，加入4-AP至終濃度為0、4.7或0、6.25 mmol/L，培養(yǎng)48 h；胰酶處理使細胞分散，用PBS離心洗滌細胞2次，棄上清，加入1 mL 70%(φ)冰乙醇混勻，固定待用，4 ℃可保存1周，-20 ℃可保存1月；PBS洗滌離心細胞1次，加入500 mL PBS，25 μL PI(5 ng/mL)及5 μL RNase A染色30 min；冰上避光15 min，上機檢測。

1.5 Western blot檢測PI3K/AKT信號通路及細胞周期相關蛋白的變化

制膠。取30 μg蛋白質(zhì)，用4×SDS上樣緩沖液按3∶1體積比混合，95 ℃水浴變性，加樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，室溫搖床孵育1 h(含3% BSA的TBST溶液)。棄封閉液，分別加入目的蛋白的抗體(1∶1 000)及β-actin鼠抗人單克隆抗體(1∶1 000)，室溫搖床孵育1 h，4 ℃孵育過夜。次日，TBST洗膜5 min×3次，然后分別按照1∶1 000的比例加入抗兔或抗鼠二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜5 min×3次。ECL化學發(fā)光檢測與曝光。用Image Lab軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 4-AP對肺癌細胞SPCA1和PC9的IC50

4-AP對肺癌細胞的抑制作用呈濃度依賴關系，SPCA1和PC9細胞的IC50分別為4.7 mmol/L和6.25 mmol/L(圖1)。

圖1 SPCA1和PC9細胞經(jīng)不同濃度4-AP處理后的存活率

Figure 1 Effect of 4-AP on the viability of SPCA1 and PC9 cells

2.2 4-AP對肺癌SPCA1和PC9細胞增殖的影響

與control(不加4-AP細胞)相比，4-AP組細胞生長減慢，差異有統(tǒng)計學意義(SPCA1F=330.062,P<0.01；PC9F=3 491.852,P<0.01)(圖2)。

2.3 4-AP對肺癌SPCA1和PC9細胞克隆形成能力的影響

與control相比，4-AP組細胞平板克隆小且數(shù)量少，差異有統(tǒng)計學意義(SPCA1t=5.031，P=0.007；PC9t=6.647，P=0.003)(圖3)。

2.4 4-AP對肺癌SPCA1和PC9細胞周期的影響

與control相比，4-AP組G1期細胞比例增多，S期細胞比例減少，差異有統(tǒng)計學意義(G1∶SPCA1t=-5.373,P=0.006；PC9t=-6.687，P=0.003；S∶SPCA1t=6.916 ，P=0.002；PC9t=5.847，P=0.004)(圖4)。

圖2 4-AP處理SPCA1和PC9細胞的生長曲線

Figure 2 Effect of 4-AP on the growth curves of SPCA1 and PC9 cells

圖3 4-AP對SPCA1和PC9細胞平板克隆形成能力的影響

Figure 3 Effect of 4-AP on the colony formation of SPCA1 and PC9 cells

圖4 流式細胞術檢測4-AP對SPCA1和PC9細胞周期的影響
Figure 4 Effect of 4-AP on the cell cycle of SPCA1 and PC9 cells

2.5 4-AP對肺癌細胞SPCA1和PC9的PI3K/AKT信號通路及下游細胞周期相關蛋白的影響

以β-actin為內(nèi)參，結(jié)果顯示∶與control相比，4-AP組細胞中，P21表達上調(diào)，p-PI3K (Tyr458)、p-AKT(Ser473)、CCND1和CDK4表達下調(diào)，PI3K和AKT表達不變(圖5)。

1. SPCA1-Ctr; 2. SPCA1-3 mmol/L; 3. SPCA1-4 mmol/L; 4. PC9-Ctr; 5. PC9-3.125 mmol/L; 6. PC9-6.25 mmol/L。

圖5 Western blot檢測4-AP處理SPCA1和PC9后p-PI3K (Tyr458)、p-AKT (Ser473)、PI3K、AKT、CCND1、P21和CDK4蛋白的表達水平

Figure 5 Effect of 4-AP on the expression of p-PI3K (Tyr458),p-AKT (Ser473),PI3K,AKT,CCND1,P21 and CDK4 in SPCA1 and PC9 cells

3 討論

4-AP是一個常用的K+通道阻滯劑，抑制多種惡性腫瘤細胞增殖[3-5]，但是其在肺癌中功能及具體的分子機制目前還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)4-AP可能通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路及其下游細胞周期相關蛋白的變化，抑制肺癌細胞生長，并且抑制細胞周期G1期到S期轉(zhuǎn)化。

PI3K/AKT是一條經(jīng)典的信號傳導通路，通過影響下游多種效應分子的活化狀態(tài)，可以抑制細胞凋亡和促進細胞周期進程，與人類多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[6-8]。本研究發(fā)現(xiàn)4-AP抑制肺癌細胞生長，Western blot檢測PI3K/AKT信號通路相關蛋白，發(fā)現(xiàn)p-PI3K (Tyr458)和p-AKT (Ser473)表達下調(diào)，PI3K和AKT表達不變，提示4-AP可能通過抑制PI3K/AKT信號通路，抑制細胞生長。

細胞周期失控可導致細胞增殖異常，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。在細胞周期中存在G1/S轉(zhuǎn)換點(R點)，細胞一旦通過了此限制點，將會自主的完成增殖周期[9]。因此對于調(diào)控細胞周期進展關鍵基因及G1/S轉(zhuǎn)換的研究，將有助于揭示腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。參與調(diào)控細胞周期的主要分子有∶細胞周期蛋白(cyclin)、細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)。cyclin是細胞周期核心因子，在G1/S轉(zhuǎn)換中CCND1起重要作用，在受到外源增殖信號刺激時，其表達明顯上調(diào)，cyclin與CDK組成復合體，引導細胞從G1期通過R點，細胞周期將自主進行。CKI能夠負性調(diào)節(jié)cyclin-CDK組成復合體[10]，可阻止細胞通過R點。本研究發(fā)現(xiàn)4-AP抑制肺癌細胞增殖，并且抑制細胞周期G1期到S期轉(zhuǎn)化，Western blot檢測細胞周期相關蛋白表達，發(fā)現(xiàn)CCND1和CDK4表達下調(diào)，起負調(diào)控作用的P21表達上調(diào)，提示4-AP可能通過下調(diào)CCND1和CDK4的表達且上調(diào)P21的表達導致細胞通過G1/S期R點受阻，抑制細胞生長。

基于上述的研究結(jié)果，明確4-AP通過調(diào)控PI3K/AKT信號通路及下游細胞周期相關蛋白抑制NSCLC細胞生長，為非小細胞肺癌的治療提供一些新的思路。

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(責任編輯：幸建華)

Inhibition of 4-aminopyridine on cell growth of lung cancer SPCA1 and PC9 cells and its molecular mechanism

ZHEN Yan1,LI Dongming1,2,HUANG Yujie1,2,GU Hongli1,2,WU Bin1,2

(1.InstituteofRespiratoryDiseases,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524001,China; 2.DepartmentofRespiratoryMedicine,AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalUniversity,Zhanjiang524001,China)

Objective To explore the effect and molecular mechanism of 4-aminopyridine (4-AP) on the proliferation of human lung cancer cells. Methods SPCA1 and PC9 cells were cocultured with 4-AP at different concentrations (0,0.195,0.39,0.78,1.56,3.125,6.25,12.5 and 25 mmol/L) for 48 h and then MTT method was used to determine the inhibition rate of lung carcinoma cells and IC50. SPCA1 and PC9 cells were cocultured with 4-AP at different concentrations (0,4.7 or 0,6.25 mmol/L) for 0,24,48,72 h or 14 d or 48 h,respectively,and then MTT method,colony formation assay and FACS cytometry assay were adopted for detection of the proliferation,growth and cell cycle of lung carcinoma cells.SPCA1 and PC9 cells were cocultured with 4-AP at different concentrations (0,3,4.7 or 0,3.125,6.25 mmol/L) for 48 h,and western blot was used to examine the expression of PI3K/AKT signaling and cell cycle-associated proteins. Results IC50s of 4-AP on SPCA1 and PC9 cells were 4.7 mmol/L and 6.25 mmol/L,respectively.Treatment with 4-AP significantly inhibited the cell growth (P<0.01) and proliferation (P<0.05) of SPCA1 and PC9 cells.4-AP blocked cell cycle transition from G1 to S and G2 phase in PC9 and SPCA1 cells (P<0.05).Meantime,4-AP increased the expression of P21 and decreased the expression of p-PI3K (Tyr458),p-AKT (Ser473),CCND1 and CDK4,whereas total protein levels of PI3K and AKT remained unchanged. Conclusion 4-AP inhibits the proliferation of lung carcinoma cells by modulation of the PI3K/AKT signaling and downstream cell cycle-associated proteins.

4-AP; NSCLC; growth

2016-06-27

國家自然科學基金項目(81401906);廣東醫(yī)科大學附院博士基金(BJ20150003)

甄艷(1984—)，女，博士，助理研究員，Email：yingshuang288@163.com，主要從事肺癌發(fā)病機制研究；通信作者：吳斌(1962—)，女，教授，碩士生導師，主要從事呼吸疾病研究，Email：wubin621011@126.com。

時間：2016-09-30 10:22

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160930.1022.004.html

R734.2

A

1006-8783(2016)05-0613-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016062701