苦參生物堿和黃酮體外抑菌活性比較

黃琦，屈玟珊，高世軍，馬俊琳，劉龍?jiān)?，徐麟，馬鴻雁

(廣東藥科大學(xué) 1.中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 3.醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東中山 528453； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

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苦參生物堿和黃酮體外抑菌活性比較

黃琦1，屈玟珊1，高世軍2，馬俊琳1，劉龍?jiān)?，徐麟1，馬鴻雁1

(廣東藥科大學(xué) 1.中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 3.醫(yī)藥化工學(xué)院，廣東中山 528453； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的 探討苦參生物堿、黃酮及其單體(苦參堿、氧化苦參堿、苦參酮、槐屬二氫黃酮G、5-methyl-Kushenol C、三葉豆紫檀苷和高麗槐素)對(duì)不同菌株的體外抑菌作用。方法 采用96孔板微量稀釋法測(cè)定藥物的最小抑菌濃度(MIC)；薄層色譜-直接生物自顯影法測(cè)定藥物的抑菌檢測(cè)限(LOD)；紙片擴(kuò)散法測(cè)定苦參黃酮單體的抑菌圈直徑大小。結(jié)果 苦參總生物堿、總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC值范圍分別為4.95～31.64 mg/mL和7.50～31.64 mg/mL，對(duì)大腸埃希菌的MIC值范圍分別為1～4 mg/mL和1～4 mg/mL?？鄥⑸飰A單體對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的LOD值均大于10 μg；黃酮單體對(duì)金黃色葡萄球菌的LOD值為1.3～2.5 μg，對(duì)大腸埃希菌的LOD值小于1.3 μg。各黃酮單體中，槐屬二氫黃酮G抑菌作用最強(qiáng)，其次是苦參酮和高麗槐素，三葉豆紫檀苷無抑制作用。結(jié)論 對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌，苦參總黃酮及單體的抑菌效果均優(yōu)于苦參總生物堿及其單體。

苦參； 生物堿； 黃酮； 微量稀釋法； 薄層色譜-直接生物自顯影； 紙片擴(kuò)散法； 抑菌作用

苦參(SophoraflavescensAit.)為豆科槐屬植物，是我國(guó)歷史悠久的傳統(tǒng)藥物之一，具有清熱燥濕、殺蟲、利尿的功效，臨床常用于濕疹、皮膚瘙癢、滴蟲性陰道炎等[1],療效顯著。生物堿成分一直被認(rèn)為是苦參的主要有效成分，但并非苦參專屬性成分，山豆根、苦豆子等同科中藥具有與苦參非常相似的生物堿，卻具有明顯不同的臨床應(yīng)用[2-4]，這提示僅用生物堿成分來評(píng)價(jià)苦參的質(zhì)量和藥效是有局限性的，苦參中除生物堿外可能另有起關(guān)鍵作用的有效成分。近年來，大量研究表明苦參中含有豐富的黃酮類成分，具有抗菌、抗感染、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等多方面的生物活性[5]。有關(guān)苦參生物堿和黃酮抑菌作用的已有很多研究報(bào)道[6-9]，但兩者抑菌活性孰強(qiáng)孰弱，目前僅有杜思邈等[10]對(duì)此進(jìn)行了研究。本文采用微量稀釋法、薄層色譜-直接生物自顯影法和紙片擴(kuò)散法比較苦參生物堿和黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、傷寒桿菌、大腸埃希菌、痢疾志賀氏菌和銅綠假單胞菌的抑制作用，為苦參新型抑菌制劑的合理開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與試藥

1.1 儀器與設(shè)備

FA(N)/IA(N)電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；AY120萬分之一天平(日本島津公司)；KQ-2200B超聲波清洗器(鞏義市予華有限公司)；WZT-1M細(xì)菌濁度儀(麥?zhǔn)蠁挝?，上海勁佳科學(xué)儀器有限公司)；電熱恒溫培養(yǎng)箱HPX-9162MBE(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；GF254薄層板(青島海洋化工廠分廠)；96孔板(Costar公司)。

1.2 藥物與試劑

15個(gè)產(chǎn)地的苦參藥材由廣東藥學(xué)院生藥研究室馬鴻雁副教授提供和鑒定，經(jīng)鑒定均為豆科植物苦參(SophoraflavescensAit.)的干燥根(表1)；苦參堿對(duì)照品(批號(hào)PS15040201)和氧化苦參堿對(duì)照品(批號(hào)PS14042001)均購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司，純度≥98%；苦參酮、槐屬二氫黃酮G、三葉豆紫檀苷、高麗槐素和5-methyl-Kushenol C均為自制對(duì)照品，經(jīng)HPLC峰面積歸一化法計(jì)算，純度均大于98%；普通營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(BS1002；BS1003；杭州百思生物技術(shù)有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑顯色劑(TTC，Amresco公司)；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽顯色劑(MTT，Aladdin 公司)；其他試劑均為分析純。

表1 15個(gè)產(chǎn)地苦參樣品的來源Table 1 Origins of Sophora flavescens Ait.

1.3 菌株

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC29213)、大腸埃希菌(Escherichiacoli，ATCC25922)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae，ATCC49619)、傷寒桿菌(Salmonellatyphi，ATCC14028)、痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae，CMCC51252)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，ATCC2783)均購(gòu)于廣東省微生物菌種保藏中心，經(jīng)廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院微生物教研室進(jìn)行傳代培養(yǎng)，并由馬艷高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定確認(rèn)后惠贈(zèng)。將上述菌種接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂中,置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 培養(yǎng)基制備

普通營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂均按說明書方法配制，121 ℃高壓滅菌30 min，備用。

2.2 顯色劑

TTC顯色劑：用蒸餾水配制成2.5 mg/ml TTC溶液，避光保存，備用。

MTT顯色劑：用PBS緩沖液配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT-PBS溶液。

2.3 苦參總生物堿提取物的制備

取15個(gè)產(chǎn)地苦參飲片10.0 g，加蒸餾水100 mL，煎煮30 min，趁熱濾過，殘?jiān)?00 mL蒸餾水同法煎煮1次，濾過；合并濾液，濃縮至含生藥500 mg/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 苦參總黃酮提取物的制備

參照文獻(xiàn)[11]方法制備得到15個(gè)產(chǎn)地苦參總黃酮提取液，濾液蒸干，取適量浸膏配成質(zhì)量濃度為32 mg/mL的儲(chǔ)備液。實(shí)驗(yàn)時(shí)取適量?jī)?chǔ)備液過0.45 μm微孔濾膜，用蒸餾水配成質(zhì)量濃度為8 mg/mL的初始濃度藥液。

2.5 溶液的制備

取苦參堿、氧化苦參堿、苦參酮、槐屬二氫黃酮G和5-methyl-Kushenol C對(duì)照品，分別加甲醇配成初質(zhì)量濃度為2 mg/mL對(duì)照品溶液，然后倍比稀釋成1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL甲醇溶液，備用。

取三葉豆紫檀苷、槐屬二氫黃酮G、苦參酮、高麗槐素，分別精密稱定1.0 mg，用蒸餾水配成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的藥物原液，備用。

配制質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的氨芐西林藥液作為陽性對(duì)照，備用。

2.6 菌懸液制備

受試菌種用液體培養(yǎng)基配成菌懸液后，再用細(xì)菌濁度儀配制成濃度為5×108CFU/mL的菌液，備用。

2.7 微量稀釋法測(cè)MIC值

參照文獻(xiàn)[12]采用微量稀釋法測(cè)定樣品對(duì)不同菌株的MIC值，96孔板置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，培養(yǎng)結(jié)束前3 h每孔加入2.5 mg/mL TTC溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1～3 h后觀察生長(zhǎng)情況，有細(xì)菌生長(zhǎng)孔呈紅色，以肉眼觀察不到菌落生長(zhǎng)的最低藥物濃度為該藥物對(duì)該種細(xì)菌的MIC。

2.8 薄層色譜-直接生物自顯影評(píng)價(jià)抑菌能力

參照文獻(xiàn)[13]采用直接生物自顯影方法評(píng)價(jià)苦參單體化合物對(duì)大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果。處理過的薄層板在37 ℃下培養(yǎng)10 h；培養(yǎng)結(jié)束后將5 mg/mL MTT-PBS溶液均勻噴灑到薄層板上，37 ℃下培養(yǎng)4～5 h后觀察顯色結(jié)果，有抑菌活性的斑點(diǎn)將在顯色背景下表現(xiàn)出明顯的抑菌圈。

2.9 紙片擴(kuò)散法測(cè)定抑菌圈直徑

取菌懸液0.2 mL涂布于瓊脂培養(yǎng)基上，將滅菌的濾紙片(直徑d0=7 mm)浸泡于藥液中片刻，取出，略干后貼于平板表面，2%吐溫80濾紙片為陰性對(duì)照，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定抑菌圈直徑(d)。

3 結(jié)果

3.1 15個(gè)產(chǎn)地苦參的最小抑菌濃度(MIC)

苦參總生物堿和總黃酮的MIC結(jié)果見圖1。由結(jié)果可知，不同產(chǎn)地苦參均有一定的抑菌作用，苦參總生物堿對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC值范圍分別為4.95～31.64 mg/mL和7.50～31.64 mg/mL；苦參總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC值的范圍均為1～4 mg/mL。通過比較苦參總生物堿和總黃酮的MIC，15個(gè)產(chǎn)地中湖南邵陽(6)所產(chǎn)苦參的抑菌效果最好，其次是河南南陽(1)和云南曲靖(7)。

圖1 15個(gè)產(chǎn)地苦參總生物堿和總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌(A)和大腸埃希菌(B)的MICs

Figure 1 MICs of extracts from differentSophoraflavescensAit. againstStaphylococcusaureus(A) andEscherichiacoli(B)

3.2 苦參生物堿和黃酮單體的抑菌檢測(cè)限(LOD)

苦參堿、氧化苦參堿、槐屬二氫黃酮G、苦參酮和5-methyl-Kushenol C抑菌作用的結(jié)果見圖2?？鄥A、氧化苦參堿對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的LOD值均大于10 μg；槐屬二氫黃酮G、苦參酮和5-methyl-Kushenol C對(duì)金黃色葡萄球菌的LOD值為1.3～2.5 μg，對(duì)大腸埃希菌的LOD值均小于1.3 μg。結(jié)果表明，相同濃度下，無論是金黃色葡萄球菌還是大腸埃希菌，黃酮單體的抑菌效果都明顯優(yōu)于生物堿單體。

3.3 苦參黃酮單體的抑菌圈直徑

5個(gè)苦參黃酮單體抑菌作用的結(jié)果見表2?？梢?，槐屬二氫黃酮G、苦參酮和高麗槐素對(duì)細(xì)菌均有抑制作用；槐屬二氫黃酮G抑菌作用最強(qiáng)，對(duì)革蘭陽性菌(金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌)和革蘭陰性菌(大腸埃希菌、傷寒桿菌和痢疾志賀菌)均有一定抑制作用；苦參酮和高麗槐素抑菌作用相當(dāng)，都只對(duì)革蘭陽性菌有抑制作用，對(duì)革蘭陰性菌無抑制作用；三葉豆紫檀苷作用最弱，對(duì)革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均無抑制作用；氨芐西林和苦參各成分對(duì)革蘭陰性菌銅綠假單胞菌均無抑制作用。

A.苦參堿； B.氧化苦參堿； C.槐屬二氫黃酮G； D.苦參酮； E.5-methyl-Kushenol C。

圖2 直接TLC生物自顯影比較苦參生物堿和黃酮單體化合物對(duì)金黃色葡萄球菌(左)和大腸埃希菌(右)的抑制作用

Figure 2 Comparison ofSophoraflavescensalkaloid and flavonoid monomers againstStaphylococcusaureus(left) andEscherichiacoli(right) by TLC-direct bioautography

表2 苦參黃酮單體的抑菌圈直徑

注：濾紙片直徑d0=7 mm?！?”表示對(duì)相應(yīng)供試菌種無抑制效果。

4 討論

苦參主要成分是以苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿、氧化槐果堿、槐定堿等為主的生物堿類化合物和以苦參酮、槐屬二氫黃酮G、三葉豆紫檀苷、Kushenol I等為主的黃酮類化合物。生物堿提取常用三氯甲烷、三氯甲烷+濃氨水、水等作為提取溶劑，由于三氯甲烷有毒，而三氯甲烷+濃氨水溶液提取法操作繁瑣、耗時(shí)，目前生物堿提取主要是用水煎煮或回流提取[14-15]；黃酮提取常用甲醇、乙醇、乙酸乙酯等超聲提取，其中以乙酸乙酯超聲提取法對(duì)苦參黃酮類成分提取效率最高，雜質(zhì)斑點(diǎn)較少，故本文選用該法提取苦參總黃酮[11,16]。本文采用微量稀釋法、薄層色譜-直接生物自顯影法和紙片擴(kuò)散法同時(shí)比較苦參總生物堿和總黃酮對(duì)不同細(xì)菌的抑制作用，結(jié)果顯示苦參黃酮化合物的抑菌效果明顯強(qiáng)于生物堿，與杜思邈等[10]報(bào)道的結(jié)果一致。

中藥及其有效部位的抑菌機(jī)制較為復(fù)雜且不完善，主要是通過改變藥物的親脂性,改變菌體細(xì)胞膜和離子通道的滲透性,抑制或干預(yù)菌體生物功能的合成、轉(zhuǎn)化過程等來改變抑菌活性[17]。革蘭陽性菌和革蘭陰性菌結(jié)構(gòu)、成分、性質(zhì)和功能的差異[18]，以及生物堿和黃酮結(jié)構(gòu)的差異都會(huì)影響抑菌的效果。就構(gòu)效關(guān)系而言，生物堿的抑菌活性與其氮原子的存在方式和結(jié)構(gòu)修飾有關(guān)[19]，黃酮的抑菌活性主要與A、B、C環(huán)上的羥基化和A、C環(huán)上的O、S、N取代有關(guān)，其中大多數(shù)異戊烯黃酮自身結(jié)構(gòu)的特異性(容易羥基化和異戊烯基化)能增強(qiáng)其抑菌或殺菌活性[20-22]。Kohanski等[23]發(fā)現(xiàn)，殺菌性抗菌藥能刺激革蘭氏菌生成高度有害的羥基自由基，增加殺菌性抗菌藥的殺菌效果，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，而抑菌性抗菌藥并不產(chǎn)生羥基自由基。這提示藥物的抑菌效果可能與其羥基自由基的合成和藥物濃度也有關(guān)系，為更好地篩選殺菌性抗菌藥和抑菌性抗菌藥，以及研究藥物的殺菌活性和抑菌活性提供了科學(xué)依據(jù)。

生物堿和黃酮都是廣泛存在于植物中較為復(fù)雜的化合物，也是藥用植物中的主要活性成分，均具有廣譜的藥理活性和較低毒性。本文結(jié)果表明，苦參總黃酮及其單體均是有潛力的抗菌藥物，提示研究苦參制劑抑菌作用時(shí)，可同時(shí)考慮其生物堿和黃酮作為有效部位。生物堿和黃酮對(duì)苦參的貢獻(xiàn)是單獨(dú)作用、協(xié)同作用，還是拮抗作用，還有待在今后繼續(xù)研究。

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(責(zé)任編輯：陳翔)

Comparison ofinvitroantibacterial activity of alkaloids and flavonoids ofSophoraflavescensAit.

HUANG Qi1,QU Wenshan1,GAO Shijun2,MA Junlin1,LIU Longyuan3,XU Lin1,MA Hongyan1

(1.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China; 2.SchoolofTraditionalChineseMedicine,GuangzhouUniversityofChineseMedicine,Guangzhou510006,China; 3.SchoolofChemistryandChemicalEngineering,GuangdongPharmaceuticalUniversity,Zhongshan528453,China)

Objective To studyinvitroantibacterial activity of alkaloids,flavonoids and their monomers (matrine,oxymatrine,kurarinone,sophoraflavanone G,5-methyl-kushenol C,trifolirhizin and maackiain) ofSophoraflavescensAit. Methods Broth microdilution method with 96-well plate was used to determine MICs of extracts ofSophoraflavescensAit. The limit of detection (LOD) against different bacteria was determined by thin-layer chromatography (TLC)-direct bioautography. Disk diffusion method was used to determine the diameters of inhibition zone of flavonoid constituents. Results MICs of tatal alkaloids and total flavonoids againstStaphylococcusaureusandEscherichiacoliwere 4.95～31.64 mg/mL,7.50～31.64 mg/mL,1～4 mg/mL,and 1～4 mg/mL,respectively. The LODs of alkaloid monomers againstStaphylococcusaureusandEscherichiacoliwere both more than 10 μg,while flavonoid monomers′ were 1.3～2.5 μg and less than 1.3 μg,respectively. Sophoraflavanone G had the strongest antibacterial activity against the testing bacteria among all flavonoid monomers,followed by Kurarinone and Maackiain,while Trifolirhizin had no antibacterial activity. Conclusion The total flavonoids and flavonoid monomers ofSophoraflavescenshad a stronger antibacterial activity against bothStaphylococcusaureusandEscherichiacolithan tatal alkaloids and alkaloid monomers.

SophoraflavescensAit.; alkaloids; flavonoids; broth microdilution method; TLC-direct bioautography; disk diffusion method; antimicrobial

2016-07-10

清華信息科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目(44548071)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014A020212416)；廣東藥學(xué)院2013年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201310573004)

黃琦(1991—)，女，2014級(jí)碩士研究生，Email：459995268@qq.com；通信作者：馬鴻雁(1981—)，女，副教授，博士，主要從事中藥的活性成分及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。

時(shí)間：2016-10-08 11:38

http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20161008.1138.001.html

R285.5

A

1006-8783(2016)05-0577-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016071001