基于核殼金@鉑納米粒子的Ag+比色檢測方法

陳銘銘，吳亮亮，謝正軍，彭池方

(江南大學(xué) 食品學(xué)院 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 ，江蘇 無錫 214122)

基于核殼金@鉑納米粒子的Ag+比色檢測方法

陳銘銘，吳亮亮，謝正軍，彭池方*

(江南大學(xué) 食品學(xué)院 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室 ，江蘇 無錫 214122)

金核鉑殼納米粒子(Au@Pt NPs)具有出色的類過氧化物酶活性，而Ag+對其催化活性表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑制；基于此，構(gòu)建了高靈敏的Ag+比色檢測方法。在最佳反應(yīng)條件下，Au@Pt NPs比色檢測Ag+的線性范圍為0.1～10 nmol/L，檢出限可達(dá)0.05 nmol/L。該方法對汞離子(Hg2+)也表現(xiàn)出高靈敏的響應(yīng)，比色檢測Hg2+的線性范圍為10～200 nmol/L。將其應(yīng)用于實際水樣中Ag+的檢測，在添加濃度為10，50，100 nmol/L時，回收率為83.8%～97.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～9.6%，該方法具有操作簡單、靈敏度高、成本低等優(yōu)點。關(guān)鍵詞：Au@Pt納米粒子；模擬酶；比色檢測；銀離子；汞離子

Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

銀是一種人們熟知的重金屬，因其具有良好的導(dǎo)電、導(dǎo)熱、延展性以及反光性，而被廣泛地應(yīng)用于電子、影像等行業(yè)[1]。但是，全球每年含銀廢液的排放量高達(dá)2 500噸，其中約有150噸的廢液以淤泥的形式被排放，約80噸的廢液進(jìn)入地表水中[2]。由于銀離子與巰基、氨基基團(tuán)有良好的親和力，所形成的復(fù)合物會累積到肝、皮膚和毛發(fā)中[3]，因此，一旦長期暴露在高濃度的銀離子環(huán)境中，會對生物體造成一定的損害[4-5]。而與其他形式相比，銀的離子狀態(tài)(Ag+)毒性最大[6]。目前常用的Ag+檢測方法主要包括原子吸收分光光度法[7]、電化學(xué)法[8]、原子發(fā)射光譜法[9]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法[10]、高效液相色譜法[11]。但這些方法均存在不同的弊端，如耗時較長、儀器昂貴、需專業(yè)操作人員、不便攜帶等[12]。因此，開發(fā)經(jīng)濟(jì)、簡單、高靈敏和高選擇性的Ag+檢測方法，具有重要的應(yīng)用價值。 近年來，納米技術(shù)的發(fā)展為研究者開發(fā)重金屬離子的檢測方法提供了新思路。人們基于納米粒子的特性設(shè)計開發(fā)了許多Ag+的檢測方法。如劉毅等[13]利用富含C，G堿基序列的DNA在熒光染料硫黃素T(ThT)的誘導(dǎo)下折疊成四鏈體結(jié)構(gòu)，并加強(qiáng)ThT的熒光強(qiáng)度，而Ag+則可以破壞這一四鏈體結(jié)構(gòu)，基于此設(shè)計了一種新型免標(biāo)記Ag+傳感器；He等[14]利用Au-N之間的相互作用合成肌酐-納米金粒子，這種納米金由于粒徑小而只能產(chǎn)生較弱的等離子共振峰，加入Ag+后，等離子共振峰增強(qiáng)且納米金由無色變紫色，基于此建立了比色方法檢測Ag+；Yang等[15]利用Ag+能和富含C堿基的DNA構(gòu)成C-Ag+-C結(jié)構(gòu)而被綠色熒光染料識別，構(gòu)建了一種簡單快速檢測Ag+的方法。盡管上述各類基于納米粒子的光學(xué)和電化學(xué)等特性，成功開發(fā)了許多性能出色的方法，但是，目前報道的Ag+比色檢測方法的靈敏度和特異性等還需進(jìn)一步提高。

研究表明，一些金屬納米粒子(NPs，如Fe3O4NPs、Pt納米簇、Co3O4NPs等)具有出色的類似天然酶的活性[16]，人們稱其為“納米模擬酶”，如鉑納米材料含有超氧化物歧化酶活、過氧化氫酶活、氧化酶活和過氧化物酶活4種酶活[17]。Fan等[18]利用去鐵蛋白包被合成含74% PtO和26% Pt2+的Pt納米粒子，它對TMB的米氏常數(shù)為0.22 mmol/L，對H2O2的米氏常數(shù)為187.25 mmol/L。Fu等[19]以DNA為模板合成2.9 nm的Pt納米酶，其對TMB的親和力是辣根過氧化物酶的8倍。與天然酶分子相比，納米模擬酶不僅價格便宜，而且對熱、酸、堿的耐受性高[20]。因此，納米模擬酶的應(yīng)用獲得了廣泛關(guān)注；并且，基于金屬納米粒子的類酶特性，研究建立了一些重金屬離子的檢測方法。如Li等[17]利用Hg2+與牛血清蛋白包裹的鉑納米顆粒之間存在相互作用，從而能夠抑制鉑納米粒子的催化活性，構(gòu)建了一種靈敏檢測Hg2+的方法。Yang等[21]研究發(fā)現(xiàn)MnO2納米棒可作為氧化酶模擬物催化TMB產(chǎn)生陽離子自由基，谷胱甘肽會阻礙陽離子自由基的產(chǎn)生使TMB由藍(lán)色變?yōu)闊o色，而Hg2+的存在會導(dǎo)致TMB溶液重新顯色。基于此，該課題組研究出一種簡單快速檢測Hg2+的方法；Li等[22]基于Pb2+會與含T30695核苷酸序列的Au納米粒子形成Au-Pb合金及核苷酸-Pb2+復(fù)合物而增強(qiáng)Au納米粒子的過氧化物酶活性，建立了Pb2+的檢測體系，其檢測限低至0.05 nmol/L；同樣，Pb2+結(jié)合到兒茶素修飾的金納米顆粒上會形成Pb-兒茶素復(fù)合物以及Au-Pb合金，從而增強(qiáng)金納米顆粒的過氧化物酶樣活性催化AUR顯色，Wu等[23]利用此原理檢測了湖泊、池塘和尿液中的Pb2+含量。

本文則利用Au@Pt NPs的高過氧化物酶活性以及Ag+對其催化活性的強(qiáng)烈抑制作用，構(gòu)建了高靈敏的Ag+比色直接檢測方法。該方法具有操作簡單、穩(wěn)定性高、超高靈敏以及低成本等優(yōu)點。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

氯金酸、5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、檸檬酸三鈉(美國Sigma公司)；L-抗壞血酸、六氯鉑酸鉀(阿拉丁公司)；過氧化氫(H2O2)溶液、一水合檸檬酸、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉為國藥分析純試劑；汞、錳、鍶、鋅、鐵、鈷、鉻、銅、鉍、鎳、鎘、鋁、鋇、鉛等單元素標(biāo)準(zhǔn)品購自中國科學(xué)計量研究院；實驗用水為18.2 MΩ·cm的Millipore超純水。上述試劑除了特殊說明外均為分析純。

Biotek Eon微孔板分光光度計(美國Biotek公司)；JEM-2100透射電鏡(日本電子株式會社)；UV-2802pcs紫外光譜儀(美國優(yōu)尼柯公司)；Multiskan MK3 酶標(biāo)儀(美國Thermo公司)；Eppendorf可調(diào)式移液器(美國艾本德產(chǎn)品)；恒溫振蕩器(無錫沃信儀器有限公司)；電子天平、數(shù)顯pH計(梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司)；XW-80A微型旋渦混合儀(金壇市盛藍(lán)儀器制造有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 Au@Pt NPs的合成 Au NPs的制備：于一個潔凈的錐形瓶中，加入97.5 mL 水和2.5 mL 氯金酸溶液(0.4%)，勻速攪拌、加熱，沸騰5～6 min 后，快速加入2.0 mL 1.0%檸檬酸三鈉溶液，繼續(xù)加熱攪拌，溶液從無色變?yōu)榛疑僮優(yōu)榧t色時，待到顏色穩(wěn)定繼續(xù)加熱10 min后，停止加熱，繼續(xù)攪拌，冷卻至室溫，放入4 ℃冰箱備用[24]。計算AuNPs溶液的初始濃度為3.0 nmol/L[25]。

Au@Pt NPs的制備在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上略作改動[26]。具體如下：于一個潔凈的錐形瓶中，加入30 mL 上述合成的Au NPs溶液，再加入10 mL 1.0 mmol/L的六氯鉑酸鉀溶液，加熱至80 ℃。之后緩慢加入10 mL 5 mmol/L的L-抗壞血酸溶液，勻速攪拌30 min，待溶液由紅色變咖啡色后，停止加熱，持續(xù)攪拌，冷卻至室溫，放入4 ℃冰箱備用。計算Au@Pt NPs溶液的初始濃度約為1.2 nmol/L。

1.2.2 Ag+的的檢測 將Au@Pt NPs稀釋至10倍，取100 μL，加入425 μL超純水和175 μL磷酸鹽緩沖溶液(0.05 mol/L，pH 7.0)，混合均勻后標(biāo)記為A溶液；向390 μL超純水中，加入1 170 μL檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH 4.0)，560 μL氫氧化鈉溶液(10%)，以及880 μL的TMB溶液(1 mmol/L)，混合均勻標(biāo)記為B溶液。取20 μL A溶液加入酶標(biāo)板微孔中，加入80 μL不同濃度的Ag+溶液，輕輕混合，室溫振蕩反應(yīng)20 min，再加入100 μL的B溶液，室溫振蕩反應(yīng)15 min。最后，通過酶標(biāo)儀在652 nm處讀取反應(yīng)液的吸光值(A652 nm)；以吸光值對Ag+的濃度繪制校正曲線。

a.black solution at CPE，b.CAP at CPE，c.CAP at GR-CPE，

d.CAP at GR/SDS-CPE

2 結(jié)果與討論

2.1 Au@Pt NPs的表征

采用吸收光譜(UV-Vis)對AuNPs和Au@Pt NPs進(jìn)行分析。從圖1可以看到，AuNPs的吸收峰在520 nm處(曲線a)，當(dāng)加入六氯鉑酸鉀和L-抗壞血酸后，溶液由紅色變成咖啡色，在紫外圖上無明顯的吸收峰(曲線b)。通過透射電鏡(TEM)觀察，可見AuNPs粒徑約為15 nm，而Au@Pt NPs 的平均粒徑為20 nm(圖2)。另外，還可觀察到Au@Pt NPs的表面非常粗糙。Au@Pt NPs的EDX譜圖也表明，有Au和Pt兩種元素同時存在。以上結(jié)果表明已成功制備Au@Pt NPs。

2.2 Au@Pt NPs比色檢測Ag+

單獨(dú)TMB與H2O2存在時，幾乎無吸收峰(見圖3)，而加入Au@Pt NPs后，可在652 nm處觀察到強(qiáng)烈的吸收，表明Au@Pt NPs具有過氧化物酶活性，能催化H2O2氧化TMB。加入200 nmol/L的Ag+溶液孵育后，吸收峰強(qiáng)度顯著下降，表明Ag+能夠抑制Au@Pt NPs的催化能力。圖3插圖為Au@Pt NPs催化TMB-H2O2反應(yīng)的動態(tài)時間曲線，從圖3插圖可見，Au@Pt NPs可以催化TMB-H2O2顯色，具有過氧化物酶活性，且隨著時間的延長，吸光值逐漸上升，并在15 min左右趨于穩(wěn)定?；谏鲜鲆种艫u@Pt NPs催化活性的作用，有望發(fā)展靈敏的Ag+比色檢測方法。為了獲得對Ag+更靈敏的響應(yīng)，考察了磷酸鹽緩沖溶液以及底物H2O2和TMB濃度的影響。

2.2.1 磷酸鹽緩沖溶液pH值的影響 考察了pH值分別為5.7，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0的磷酸鹽緩沖液對Ag+的響應(yīng)分析。結(jié)果表明，當(dāng)磷酸鹽緩沖液的pH值為7.0時，10 nmol/L Ag+產(chǎn)生的響應(yīng)所導(dǎo)致的吸光度差值(A0-A)最大。因此后續(xù)實驗選用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液用于Ag+檢測。

2.2.2 H2O2濃度的影響 考察了不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)(5.0%，6.0%，7.5%，10%,15%,30%)的H2O2溶液對Ag+的響應(yīng)。結(jié)果表明，當(dāng)H2O2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時，10 nmol/L Ag+產(chǎn)生的響應(yīng)所導(dǎo)致的吸光值變化明顯高于其它濃度，故選用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的H2O2溶液用于后續(xù)的Ag+檢測。

2.2.3 TMB濃度的影響 進(jìn)一步考察了不同濃度(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mmol/L)的TMB溶液對Ag+檢測的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)TMB溶液為1.0 mmol/L時，10 nmol/L Ag+產(chǎn)生的響應(yīng)所導(dǎo)致的吸光值變化最大。繼續(xù)提高其濃度，吸光度差值緩慢下降，這一現(xiàn)象與天然酶類似，可能是由于底物濃度過高導(dǎo)致對納米模擬酶活性抑制的效應(yīng)。故選用濃度為1.0 mmol/L的TMB溶液用于后續(xù)檢測。

2.2.4 Ag+檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線 在優(yōu)化的緩沖液和底物條件下，應(yīng)用Au@Pt NPs檢測濃度分別為0，1，2，5，10，20，50，100，150，200，300 nmol/L的Ag+溶液，并以Ag+濃度(X,nmol/L)作為橫坐標(biāo)，以吸光值(Y)作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示，Ag+的濃度在0.1～10 nmol/L范圍內(nèi)與其吸光值呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=-0.023 99X+0.805 64，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.99。以3倍信噪比計算，可得該方法對Ag+的檢出限為0.05 nmol/L，遠(yuǎn)低于我國飲用水設(shè)定的限量標(biāo)準(zhǔn)0.5 mol/L[27]。

2.3 Au@Pt NPs檢測重金屬離子的特異性

為考察該比色檢測方法的選擇性，選擇常見金屬離子溶液，包括Hg2+,Mn2+,Sr2+,Zn2+,Fe3+,Co2+,Cr2+,Cu2+,Bi2+,Ni2+,Cd2+,Al3+,Ba2+,Pb2+和Hg2+作干擾離子，檢驗該方法對Ag+的特異性。結(jié)果表明，Au@Pt NPs對500 nmol/L的Ag+和Hg2+顯示出強(qiáng)烈的響應(yīng)，而對其它高濃度的Mn2+，Sr2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，Pb2+，Ba2+(10 μmol/L)產(chǎn)生的響應(yīng)幾乎可忽略，對高濃度(10 μmol/L)的Fe3+，Cr2+，Bi2+，Ni2+，Cd2+和Al3+等離子的響應(yīng)也非常小。該方法對Hg2+的檢測范圍為10～200 nmol/L，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.99。以3倍信噪比計算，可得該方法對Hg2+的檢出限為5.0 nmol/L，滿足我國飲用水設(shè)定的限量標(biāo)準(zhǔn)5.0 nmol/L[28]。實際測樣過程中，可在樣品中加入EDTA等絡(luò)合劑以消除Hg2+對Ag+的干擾。

2.4 樣品的加標(biāo)回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

采集本實驗室的自來水作為樣品基質(zhì)，經(jīng)ICP-MS分析其含量。向該樣品中添加不同量的Ag+，使Ag+濃度達(dá)到10，50，100 nmol/L。然后用超純水稀釋10倍，經(jīng)0.22 μm微孔過濾膜過濾后，在優(yōu)化條件下進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，其3個加標(biāo)濃度下的回收率分別為83.8%，90.4%和97.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為9.6%，6.4%和3.0%。上述結(jié)果表明，應(yīng)用該Au@Pt NPs在實際樣品中檢測Ag+具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性。

3 結(jié) 論

本研究基于Ag+抑制Au@Pt NPs的催化活性，構(gòu)建了一種高靈敏、高選擇性檢測Ag+的比色法，并考察了磷酸鹽緩沖液的pH值，H2O2和TMB濃度對Ag+檢測的影響。結(jié)果表明，在優(yōu)化條件下，Au@Pt NPs對Ag+的檢測線性范圍為0.1～10 nmol/L，檢出限為0.05 nmol/L。同時，該方法對Hg2+也顯示了良好的響應(yīng)，對Hg2+的檢測線性范圍為10～200 nmol/L，檢出限為5.0 nmol/L。將該方法應(yīng)用于添加Ag+的自來水測試，回收率為83.8%～97.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～9.6%。該方法檢測Ag+具有操作簡單、靈敏度高、使用成本低等優(yōu)點，有望進(jìn)一步應(yīng)用于環(huán)境中Ag+的檢測。

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Colorimetric Detection of Silver Ions Based on Au@Pt Nanoparticles

CHEN Ming-ming，WU Liang-liang，XIE Zheng-jun，PENG Chi-fang*

(State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and

Au@Pt NPs have an excellent peroxidase-like activity，and silver ions(Ag+) could intensively inhibit the catalytic ability of Au@Pt NPs.Based on this，a colorimetric detection of Ag+was performed in a linear range of 0.1- 10 nmol/L with a detection limit of 0.05 nmol/L.The sensing system also showed a sensitive response to Hg2+.A linear range of 10-200 nmol/L and a detection limit of 5.0 nmol/L were achieved in the colorimetric detection for Hg2+.The method was applied in detection of tap water spiked with Ag+(10，50,100 nmol/L)，and the recoveries ranged from 83.8% to 97.7% with relative standard deviations(RSD) of 3.0%-9.6%.This method has the advantages of simplicity，sensitivity and low cost.

Au@Pt nanoparticles；enzyme mimics；colorimetric detection；Ag+；Hg2+

2016-06-05；

2016-06-20

十二五國家科技支撐計劃項目(2015BAD17B02)；國家自然科學(xué)基金資助項目(31371767)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.11.023

O657.3;O614

A

1004-4957(2016)11-1496-05

*通訊作者：彭池方，博士，教授，研究方向：納米傳感分析新技術(shù)，Tel：0510- 85919189，E-mail：pcf@jiangnan.edu.cn