活性自由基聚合法制備多壁碳納米管表面槲皮素分子印跡聚合物及其應(yīng)用

熱薩萊提·伊敏，熱娜古麗·阿不都熱合曼,買買提·吐爾遜,木合塔爾·吐爾洪,2*

(1.喀什大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844000；2.新疆特色藥食用植物資源化學(xué)重點實驗室，新疆 喀什 844000)

活性自由基聚合法制備多壁碳納米管表面槲皮素分子印跡聚合物及其應(yīng)用

熱薩萊提·伊敏1，熱娜古麗·阿不都熱合曼1,買買提·吐爾遜1,木合塔爾·吐爾洪1,2*

(1.喀什大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，新疆 喀什 844000；2.新疆特色藥食用植物資源化學(xué)重點實驗室，新疆 喀什 844000)

為了制備能有效分離富集藥草中槲皮素的固相萃取柱，以丙烯酰胺(AM)修飾的碳納米管為載體，三硫代碳酸酯(DBTTC)為可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移劑(RAFT試劑)，槲皮素為模板，甲基丙烯酸(MAA)為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)為交聯(lián)劑，乙腈為致孔劑，制備了槲皮素分子印跡聚合物，采用紅外光譜、掃描電鏡和熱重分析對印跡材料進(jìn)行表征，通過高效液相色譜(HPLC)研究聚合物的吸附性能和對底物的特異性識別能力。結(jié)果表明，通過活性自由基聚合法合成的多壁碳納米管表面槲皮素分子印跡聚合具有更好的形態(tài)結(jié)構(gòu)和吸附性能，且對槲皮素有很好的特異性識別能力。

活性自由基聚合；多壁碳納米管；表面印跡；槲皮素；吸附性能

分子印跡聚合物是具有特異性識別能力、特定功能基團(tuán)以及孔穴大小和形狀的新型高分子材料。在高效液相色譜[1-2]、電化學(xué)傳感器[3-4]、毛細(xì)管電泳分析、手性分離中用于樣品的預(yù)處理、分離富集和快速檢測等[5-7]。但分子印跡技術(shù)在實際應(yīng)用中仍受到諸多因素的影響和制約，為了克服傳統(tǒng)印跡聚合物呈塊狀、顆粒較大、使用前需研磨過篩的缺點[8]，人們不斷探尋新的制備技術(shù)以改善印跡識別效能，并提高其實際適用性[9]。以具有高比表面積、高比表面能、高反應(yīng)活性等[10]特征的多壁碳納米管為載體的表面印跡技術(shù)近年來受到了研究者的關(guān)注和重視[11-13]。碳納米管表面很難直接修飾印跡聚合物，制備的印跡復(fù)合材料在固相萃取過程中由于吸附力不夠，萃取壓力過大而難以使用，所以使用前必須對其進(jìn)行表面修飾。由于表面修飾的碳納米管表面接枝而制備的印跡聚合物的印跡空穴排列在碳納米管的表面上，從而為質(zhì)量傳遞且在介質(zhì)中對特定化合物的可接近性提供了方便[14-16]。并且為了減少雙分子偶合、歧化終止和鏈轉(zhuǎn)移等副反應(yīng)以及克服聚合反應(yīng)過程難以控制等一些困難[17]，可在聚合反應(yīng)體系中加入可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移(RAFT)自由基，使得形成的聚合物均勻且聚合步驟易于控制。

本文在前期研究工作的基礎(chǔ)上[17]，進(jìn)一步制備出以丙烯酰胺修飾的碳納米管為載體的分子印跡聚合材料，并將其作為高效液相色譜固定相，用于維吾爾中草藥蜀葵花中的活性成分槲皮素的分離分析，發(fā)現(xiàn)表面修飾的槲皮素分子印跡聚合物比傳統(tǒng)分子印跡聚合方法合成的槲皮素聚合物顆粒更加均勻，具有更好的吸附性能，克服了傳統(tǒng)方法合成的聚合物呈塊狀、顆粒較大、需研磨過篩，且聚合物的高度交聯(lián)使其內(nèi)部模板分子洗脫比較困難，印跡孔穴有“深埋”等[8]缺點，為進(jìn)一步開發(fā)利用地方民族醫(yī)藥及其分離富集方面提供新型、先進(jìn)、可靠的檢測技術(shù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

槲皮素(中國藥品生物制品檢定所)，山萘酚對照品(中國藥品生物制品檢定所)；多壁碳納米管(MWCNTs，直徑30～40 nm，純度>95%)，丙烯酰胺(AM,分析純,天津市福晨化學(xué)試劑廠)；甲基丙烯酸(MAA,分析純,天津大茂化學(xué)試劑廠,使用前減壓蒸餾處理)；氯化芐、二硫化碳(分析純，天津化學(xué)試劑有限公司)；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA，分析純，山東煙臺云開化工有限責(zé)任公司)；偶氮二異丁腈(AIBN，化學(xué)純，上海試四赫維化工有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；四正丁基溴化胺(分析純，上海試劑總廠)，實驗用水為高純水，其它試劑均為分析純。

島津LC-20AT高效液相色譜儀(配有SPD-M20A 二極管陣列檢測器,DGU-20A5 在線脫氣機(jī),LC-solution 工作站)；STA7200熱重分析儀；IR200紅外分析儀；ZK-82B 真空干燥箱(上海市實驗儀器總廠)；KQ-200VDB型雙頻聲控超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器廠)；分析天平(FA2104型)；80-1型沉淀離心器(上海手術(shù)器械廠)；SHA-C型水浴恒溫振蕩器(江蘇金壇億通電子有限公司)。

1.2 多壁碳納米管的表面修飾與接枝分子印跡聚合物

由于多壁碳納米管表面直接修飾印跡聚合物很困難，而且制備的印跡高分子材料進(jìn)行固相萃取時具有吸附力不夠、萃取壓力過大等缺點，因此需先對碳納米管進(jìn)行修飾。稱取1.000 0 g MWCNTs，加入30 mL濃硝酸和90 mL水，回流反應(yīng)8 h，完成MWCNTs的羧基化，用微孔濾膜抽濾、真空干燥24 h，再加入二氯亞砜100 mL回流反應(yīng)24 h進(jìn)行酰氯化，抽濾、真空干燥24 h后，以DMF為溶劑加入兩倍的丙烯酰胺完成表面修飾。

合成分子印跡聚合物：稱取表1所示的各反應(yīng)物之后將反應(yīng)器密封，溶液超聲10 min，通氮氣10 min，靜置1 h后，于60 ℃下沉淀聚合24 h。反應(yīng)完成后，聚合物冷卻至室溫，真空干燥24 h后，濾紙包裝好聚合物裝在索氏提取器中，用體積比為1∶4的醋酸-甲醇溶液反復(fù)洗滌24 h，以除去模板分子及未聚合的功能單體和交聯(lián)劑，然后用甲醇洗脫醋酸6 h，聚合物真空干燥24 h,得到聚合物MWCNTs-MIP1～MWCNTs-MIP4。

表1 合成聚合物 MIP1～ MIP4所需反應(yīng)物的量Table 1 Amount of each reactant required for the synthesis of polymer MWCNTs -MIP1～ MWCNTs -MIP4

1.3 分子印跡聚合物的表征

采用掃描電子顯微鏡對真空干燥后 MIP1～ MIP4的微觀形貌進(jìn)行觀察，用紅外光譜儀掃描聚合物的吸收(用KBr壓片制樣，在分辨率為4 cm-1，4 000～500 cm-1區(qū)間內(nèi)測定)，采用STA7200型熱重分析儀測定重量隨溫度變化的特性，測試條件為：流動氮氣氣氛，流速為200 mL/min，升溫速率10 ℃/min，溫度范圍30～700 ℃。

1.4 吸附等溫線測定

稱取分子印跡聚合物 MIP1～ MIP4各20 mg，置于10 mL吸附管中，分別加入5，10，20，40，60，80，100，120 μg/mL濃度的槲皮素甲醇溶液，室溫下振蕩4 h，上清液以3 000 r/min離心15 min，用HPLC 檢測上清液濃度，平行測定3 次，取平均值。根據(jù)差減法計算印跡材料對槲皮素結(jié)合量，計算其吸附量。

1.5 吸附動力學(xué)測定

稱取20 mg分子印跡聚合物 MIP1～MIP4，置于25 mL吸附管中，加入100 μg/mL槲皮素甲醇溶液，室溫下振蕩，每隔40 min取上清液2 mL，直至500 min，3 000 r/min離心15 min，用HPLC 檢測上清液濃度，平行測定3 次，取平均值。根據(jù)差減法計算印跡材料對槲皮素的結(jié)合量，計算其吸附量。計算公式：Qa=(C0-C1)V/M，其中Qe為吸附量(μg/mL)，C0和C1分別為槲皮素甲醇溶液吸附前后濃度(μg/mL)，V為槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液體積，M為加入表面修飾過的碳納米管質(zhì)量(20 mg)。

1.6 固相萃取選擇性實驗

考察了分子印跡聚合物對模板槲皮素和結(jié)構(gòu)相似的山萘酚的吸附性能，色譜柱為Agilent HC-C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)，以甲醇-0.4%磷酸(50∶50)為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長為360 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL色譜條件下以聚合物 MIP4為萃取柱分離測定蜀葵花中的槲皮素和山萘酚。

樣品處理：準(zhǔn)確稱取干燥、粉碎、過篩(60目)的蜀葵花粉末2.0 g(維吾爾藥材蜀葵花于2013年7月購自喀什地區(qū)沙車縣維吾爾醫(yī)院生藥庫房的干燥花)，以固液比為1∶25加入65%乙醇回流提取1 h，提取2次，抽濾，合并濾液進(jìn)行濃縮至干，冷卻至室溫，用甲醇定容至50 mL，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜后進(jìn)行HPLC分析。

固相萃?。壕_稱取300 mg印跡分子 MIP4置于放置板的固相萃取柱中，并用篩板蓋住，以10 mL甲醇對柱子進(jìn)行活化后，用水淋洗柱子，量取10 mL 已處理的蜀葵花提取液以5 mL/min 的流速通過萃取柱，并用甲醇洗掉分子印跡聚合物上的非特異性吸附的其他物質(zhì)，收集淋洗液，待HPLC檢測，然后用40 mL甲醇-醋酸溶液將模板分子洗脫下來，收集洗脫液濃縮后用甲醇定容，采用HPLC 檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合條件對于分子印跡聚合物結(jié)構(gòu)形態(tài)的影響

從圖1可知，在反應(yīng)體系中加入RAFT試劑合成的聚合物 MIP4的形狀比不加RAFT試劑合成的聚合物 MIP2的顆粒形狀均勻，空隙分布好，原因可能是由于傳統(tǒng)方法的聚合反應(yīng)過程較難以控制。

2.2 聚合物的紅外掃描結(jié)果

2.3 聚合物的熱重分析結(jié)果

圖3為MWCNTs和MIP4在30～700 ℃范圍內(nèi)的熱重分析結(jié)果，從圖中可以看出，在30～100 ℃有1個失重峰，失重率為3.96%，這是聚合物表面吸附的水和未干燥完全的溶劑的失重；100 ～600 ℃內(nèi)MWCNTs無失重，而聚合物MWCNTs-MIP4有兩次失重，一個在302.5 ℃，這是聚合物非特異性即物理性包覆造成的，另一個在570.7 ℃左右，是聚合物的特異性即化學(xué)性包覆造成的。對比MWCNTs和聚合物MIP4的熱重圖并且扣除100 ℃前溶劑的失重，估算出碳納米管表面其他分子的接枝率為95.0%(總失重率為98.96%)。

2.4 印跡材料的吸附性能

吸附等溫線能很好地反映聚合物的吸附性能，為研究聚合物對槲皮素的結(jié)合特異性，分別采用MIP1～MIP4對8種不同初始質(zhì)量濃度的槲皮素甲醇溶液進(jìn)行吸附試驗，從圖4可以看出，對于相同濃度的槲皮素甲醇溶液，MIP4和MIP2與MIP3和MIP1的吸附性能差異較大，相比之下，MIP4具有更好的吸附性能，因為此印跡聚合物上，有模板分子槲皮素洗脫之后留下的對槲皮素有特異性識別功能的 “空穴”；而合成空白組MIP3時，不加入槲皮素，所以不具有這種特異性吸附能力的結(jié)合點，吸附均為非特異性吸附，吸附能力較低。

2.5 印跡材料的吸附動力學(xué)

隨著吸附時間的增加，MIP4和MIP2對槲皮素的吸附量呈增加的趨勢(圖5)，相比之下MIP4對模板有更好的吸附性能，且吸附量在前140 min內(nèi)急劇增加，在140 min時達(dá)640 μg/g(最大為700 μg/g)，之后吸附量增速逐漸降低并基本接近飽和。原因是開始階段槲皮素先吸附在聚合物表面特異性識別的孔穴，這種表面吸附的傳質(zhì)阻力小，有利于聚合物對槲皮素的快速吸附，而表面孔穴達(dá)到吸附飽和后，槲皮素透過聚合物表面?zhèn)鞯絻?nèi)部空穴，受到的阻力較大，導(dǎo)致其吸附速度下降，在較長時間后才達(dá)到吸附平衡。

2.6 聚合物對底物的選擇性吸附

選擇聚合物MIP4為萃取柱，按照“1.6”實驗條件，對蜀葵花(Althaea rosea L)中槲皮素進(jìn)行了分離富集，表明利用槲皮素分子印跡聚合物固相柱可萃取蜀葵花中槲皮素，并與山萘酚有明顯的分離。標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性范圍均為12.5～125 μg/mL，r分別為0.999 9和0.998 8。洗脫液中槲皮素的濃度為81 μg/mL(RSD為3.9%，n=4)，最大載樣量為552 μg/g，吸附率達(dá)到86%。從圖6可以看出，蜀葵花提取液通過槲皮素分子印跡聚合物萃取后，大量槲皮素被印跡聚合物特異性吸附，而山萘酚也有吸附，這是因為分子印跡聚合物對山萘酚有一定的非特異性吸附，即物理性吸附，但這種吸附并不強(qiáng)，這說明分子印跡聚合物MIP4上的模板分子槲皮素洗脫之后留下了對槲皮素有特異性識別功能的 “空穴”。因此，印跡聚合物MIP4作為固相萃取柱并用于藥草中槲皮素的分離和富集是可行的。

圖6 分子印跡聚合物的固相萃取色譜圖

Fig.6 Chromatograms of selectivity of molecularly imprinted solid extraction

A.HPLC of Althaea rosea L solution；B.HPLC of solution after extraction；C.HPLC of eluate；peak a：quercetin；b：kaempferol

3 結(jié) 論

本文以丙烯酰胺修飾的碳納米管為載體，以DBTTC為可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移劑，槲皮素為模板，MAA功能單體，EGDMA為交聯(lián)劑，乙腈作為致孔劑，制備了槲皮素分子印跡聚合物，并將碳納米管表面印跡的槲皮素印跡聚合物作為HPLC固定相，將其用于維吾爾中草藥蜀葵花中槲皮素的分離分析。結(jié)果表明，通過活性自由基聚合法合成的多壁碳納米管表面槲皮素分子印跡聚合物具有更好的形態(tài)結(jié)構(gòu)和吸附性能，并且對槲皮素有很好的特異性識別能力，在分離富集蜀葵花中槲皮素時，吸附率達(dá)到86%。以本文合成的聚合物MIP4作為固相萃取柱為在中草藥中槲皮素的分離富集提供了可能。

[1] Rong J F，Wei H，Huang H S，Li Y J，Xu M Z.J.Instrum.Anal.(榮杰峰，韋航，黃伙水，李亦軍，許美珠.分析測試學(xué)報),2016，35(1)：8-15.

[2] Zhang H B，Zhang C H，Nie Y，Hu Y F，Zou H Y，Yao S Z.Chin.J.Anal.Chem.(張華斌，張朝暉，聶燕，胡宇芳，鄒海英，姚守拙.分析化學(xué))，2009,7：955-959.

[3] Peng Y Y.J.Instrum.Anal.(彭友元.分析測試學(xué)報)，2013，32(12)：1427-1432.

[4] Tang T，Tang C G，Zeng Y B，Li L，Pan Y D，Xu Q X，Xiao P X，Ye B Q.J.Instrum.Anal.(唐婷，湯傳貴，曾延波，李蕾，潘樣丹，徐啟祥，肖平秀，葉冰青.分析測試學(xué)報)，2015，34(11)：1253-1258.

[5] Qiu X Z，Peng C H，Wang S L，Guo H S，Lu L Q.J.Instrum.Anal.(丘秀珍，彭翠紅，王少玲，郭會時，盧呂泉.分析測試學(xué)報)，2015，34(12)：1403-1407.

[6] Chen X J，Wang J，She Y X，Ye Q，Cao W Q.J.FoodSaf.Qual.(陳孝建，王靜，佘永新，葉青，曹維強(qiáng).食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報)，2014，5(5)：1459-1467.

[7] Zhao Y F，Zhang W H.J.Instrum.Anal.(趙永福，張文華.分析測試學(xué)報)，2015，34(8)：953-957.

[8] Yang W H，Yan S L，Wei C，Wang Q Z.ActaPolym.Sin.，2010,(10):1163-1169.

[9] Liu H,Shi Y,Wang D,Yang G,Yu A,Zhang H.J.Pharm.Biomed.Anal.,2003,32：479-485.

[10] Li H，Li Y Z，Li Z P,Li Y N，Peng X Y.J.Funct.Mater.(李輝，李玉琢，李志平，李亞男，彭夕洋.功能材料)，2012，43(6)：684-687.

[11] Yang LW，Liu H M，Qu H M，Zeng S J，Xiong Y Q，Xu W J.Chin.J.Appl.Chem.，2008，25(2)：137-141.

[12] Kan X，Zhao Q，Zhang Z，Wang Z，Zhu J.Talanta，2008，75：22-26.

[13] Gao D,Zhang Z,Wu M,Xie C,Guan G，Wang D.J.Am.Chem.Soc.，2007，129：7859-7866.

[14] Claudio B，Patrizia B，Cristina G，Laura A，Cinzia P，Gianfranco G.J.Chromatogr.A，2011，1218：1828-1834.

[15] Tan C J，Hong Chu G，Ker K H，Tong Y W.Anal.Chem.，2008，80(3)：683-692.

[16] Baggiani C，Anfossi L，Baravalle P，Giovannoli C，Giraudi G，Barolo C，Viscardi G.J.Sep.Sci.，2009,32(19)：3292-3300.[17] Tursun M，Emin R，Dawut G，Chu G H，Jelil M，Turhon M.Chem.J.Chin.Univ.(買買提·吐爾遜，古麗巴哈爾·達(dá)吾提，熱薩萊提·伊敏，楚剛會，買合木提江·杰力，木合塔爾·吐爾洪.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報)，2015,36(12):2402-2408.

Preparation of Quercetin Imprinted Polymer on Surface of Multi-walled Carbon Nanotubes by Living Radical Polymerization and Its ApplicationResalat EMIN1,Renagul ABDURAH

MAN1,Mamat TURSON1,Muheta'er TUERHONG1,2*

(1.Chemistry and Environmental Science College,Kashgar University,Kashgar 844000,China；2.Key laboratory of Xinjiang Native Medicinal and Edible Plant Resources Chemistry,Kashgar 844000,China)

In order to prepare the solid phase extraction column for the effective separation and enrichment of quercetin in the medicinal herb,a novel surface molecularly imprinted polymer was synthesized by a reversible addition fragmentation chain transfer(RAFT) polymerization method,combining molecular imprinting with living radical polymerization techniques,using acrylamide(AM) modified multi-walled carbon nanotubes(MWCNTs) as supporting matrix，dibenzyltrithiocarbonate(DBTTC) as reversible RAFT reagent,quercetin as template molecule,methacrylic acid(MAA as functional monomer and acetonitrile as pore former.The multi-walled carbon nanotubes molecularly imprinted polymers were characterized by Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR),scanning electronic microscopy(SEM) and thermogravimetric analysis(TG).The adsorption properties and specific recognition ability of the polymer were tested by HPLC.The results showed that a stable imprinted layer was successfully grafted on the MWCNTs surface.And the imprinted polymers with good morphology and adsorption property have a specific recognition ability for quercetin.

living radical polymerization；multi-walled carbon nanotubes；molecularly imprinted polymer；quercetin;adsorption rate

2016-04-09；

2016-05-17

自治區(qū)高?？蒲杏媱澢嗄杲處熆蒲袉踊?XJEDU2014S055)

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.11.015

O657.72；TQ460.72

A

1004-4957(2016)11-1456-05

*通訊作者：木合塔爾·吐爾洪，教授，研究方向：環(huán)境及藥物分析，Tel:0998-2892332，E-mail：tumut@sohu.com