大鼠EZH2基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒以及催化亞基缺失質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

熊顯佳楊冰趙秀娟孫琰趙建松武莉莉劉藝潔張玲

300070天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（熊顯佳、楊冰、趙秀娟、孫琰、武莉莉、劉藝潔、張玲）；300402天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院電氣工程系（趙建松）

大鼠EZH2基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒以及催化亞基缺失質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

熊顯佳楊冰趙秀娟孫琰趙建松武莉莉劉藝潔張玲

300070天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院（熊顯佳、楊冰、趙秀娟、孫琰、武莉莉、劉藝潔、張玲）；300402天津渤海職業(yè)技術(shù)學(xué)院電氣工程系（趙建松）

目的構(gòu)建特異性的大鼠EZH2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒以及EZH2催化亞基SET domain缺失質(zhì)粒，并在293T細(xì)胞中評(píng)估其表達(dá)水平。方法提取大鼠心臟組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，重疊PCR擴(kuò)增催化亞基SET domain缺失的EZH2的cDNA，以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物和載體雙酶切，切膠回收目的片段，經(jīng)T4連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，涂板挑取單克隆搖菌測(cè)序，提取質(zhì)粒，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。結(jié)果Western Blot法和RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果表明，質(zhì)粒在293T細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)EZH2基因的過(guò)表達(dá)。結(jié)論構(gòu)建的2種質(zhì)粒為進(jìn)一步研究EZH2基因與心肌肥厚的關(guān)系及EZH2催化亞基的作用奠定了基礎(chǔ)。

EZH2；催化亞基；重組質(zhì)粒；心肌肥厚

Fund program:NationalNaturalScienceFoundationofChina(81500170);NaturalScienceFoundationofTianjin, China(15JCYBJC25400,16JCQNJC12100,16JCQNJC10300);Tianjin Science and Technology Development Fund Project for Colleges and Universities(20130103);Scientific Research Foundation for Returned Scholars,Ministry of Education,China

0 引言

心臟疾病是死亡率的最高的疾病之一[1-2]。組織損傷和內(nèi)分泌紊亂等可以刺激心臟通過(guò)增生塑性改變維持心肌能量輸出[3-5]。心肌肥厚是最初的適應(yīng)性反應(yīng)，但持久的肥厚最終導(dǎo)致心臟功能衰竭、生命終結(jié)[6]。心肌肥厚的發(fā)生常伴隨多種信號(hào)途徑，并在轉(zhuǎn)錄過(guò)程達(dá)到頂點(diǎn)[7-9]。深入探討心肌肥厚相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有助于心肌肥厚的預(yù)防和治療。

胚胎祖細(xì)胞以及其分化后代是通過(guò)組蛋白甲基化穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄過(guò)程。在生命進(jìn)程中，這種調(diào)節(jié)對(duì)實(shí)現(xiàn)和維持基因的表達(dá)和壓力反應(yīng)可能極為關(guān)鍵。多梳復(fù)合體起到穩(wěn)定心肌相關(guān)基因的表達(dá)的功能，同時(shí)在其他系統(tǒng)中控制著細(xì)胞的特性和后生的記憶[10]。EZH2（enhancer of zeste homolog 2）是多梳抑制復(fù)合體2（polycomb repressive complex 2,PRC2）中主要的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，通過(guò)其高度保守的SET區(qū)域可對(duì)組蛋白H3第27位賴氨酸進(jìn)行三甲基化，調(diào)節(jié)染色體的結(jié)構(gòu)，從而實(shí)現(xiàn)抑制轉(zhuǎn)錄。研究證實(shí)，組蛋白修飾與多種疾病發(fā)生發(fā)展的信號(hào)通路相關(guān)，EZH2在包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。在胚胎心肌祖細(xì)胞分化過(guò)程中，穩(wěn)定EZH2介導(dǎo)的Six1的抑制作用對(duì)于正常心肌生長(zhǎng)和壓力反應(yīng)很重要，對(duì)于抑制致命基因的表達(dá)EZH2起到前示作用，同時(shí)通過(guò)Six1的抑制作用得到加強(qiáng)[11]。

為了揭示EZH2基因?qū)τ谛募》屎癜l(fā)生發(fā)展中的意義，本研究運(yùn)用多種生物學(xué)手段從大鼠心臟組織中構(gòu)建大鼠EZH2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒以及EZH2催化亞基SET domain缺失質(zhì)粒，并在人293T細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

2×Trams Taq HiFi PCR SuperMix II、高保真PCR擴(kuò)增試劑（北京全式金生物技術(shù)有限公司），載體Lenti-pCDH-CMV-puro-VECTOR（蘇州金唯智生物科技有限公司），293T細(xì)胞（美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA純化回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司），質(zhì)粒中提試劑盒（美國(guó)Biomiga公司），T4 DNA連接酶、DH5a感受態(tài)細(xì)胞、限制性內(nèi)切酶BamHI、限制性內(nèi)切酶Not 1（大連寶生物工程有限公司），鼠源β-actin單克隆抗體（上海艾博抗貿(mào)易有限公司），兔源EZH2單克隆抗體、兔源H3單克隆抗體、兔源H3K27me3單克隆抗體（德國(guó)密理博有限公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗（美國(guó)Cell signaling），SYBR Green Master Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司），胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基（上海玉博生物科技有限公司），胰蛋白酶（上海生工生物工程有限公司），ECL化學(xué)發(fā)光液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。Tanan 4500全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析儀（濟(jì)南博鑫生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 EZH2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

依據(jù)GeneBank大鼠EZH2 mRNA序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，上下游分別引入BamHI、Not1酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)的引物序列：上游引物5'CGGGATCCATGGGCCAGACTGGGAAGA 3'，下游引物5'TCCCCCGGGTCAAGGGATTTCCATTTCTCGTTC 3'。以大鼠心肌提取RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA為模版進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系：滅菌水13.3 μl，10×Pyrobest Buffer II 2 μl，dNTP Mixture（2.5 mmol/L）1.6 μl，Pyrobest DNA Polymerase（5 U/μl）0.1 μl，模板DNA 1 μl，Primer 1（10 μmol/L）1 μl，Primer 2（10 μmol/L）1 μl。反應(yīng)條件98℃10 s、60℃30 s、72℃92 s，30個(gè)循環(huán)。

1.2.2 EZH2催化亞基SET domain缺失質(zhì)粒構(gòu)建

采用重疊PCR法，設(shè)計(jì)的引物序列——F1：CGGGATCC ATGGGCCAGACTGGGAAGAAAT；R1：GCTGTATTTAGAGCCCCGCTGAATG；F2：TCTA

AATACAGCCAGGCTGATGCCC；R2：TTGCGGCCGCTCAAGGGATTTCCATTTCTCG。分別用引物F1和R2及F2和R1進(jìn)行配對(duì)，進(jìn)行PCR。PCR條件：2×TransTaq HiFi PCR SuperMix II，94℃5 min、94℃15 s、55.5℃30 s、68℃3 min（1～2 kb/min），30個(gè)循環(huán)之后68℃8 min。分別回收第2步所得2條PCR產(chǎn)物。將第3步所得2份PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合使其互為模板及引物，加入dNTP及Taq酶進(jìn)行PCR。PCR條件：2×TransTaq HiFi PCR SuperMix II，94℃5 min、94℃15 s、55.5℃30 s、68℃3 min（1～2 kb/min），30個(gè)循環(huán)之后68℃8 min。

1.2.3 PCR產(chǎn)物和載體雙酶切

PCR產(chǎn)物雙酶切（Not 1和BamHI）體系：Not 1（10 U/μl）1 μL，BamHI（15 U/μl）1 μl，10×T Buffer 1 μl，0.1×BSA 2 μl，Substrate PCR DNA 1 μg，補(bǔ)ddH2O到20 μl，反應(yīng)條件為30℃3 h。

載體雙酶切體系：Not 1（10 U/μl）1 μl，BamHI（15 U/μl）1 μl，10×T Buffer 1 μl，0.1×BSA 2 μl，Substrate載體DNA 1 μl，補(bǔ)ddH2O到20 μl。反應(yīng)條件為30℃3 h。PCR產(chǎn)物和載體酶切產(chǎn)物分別進(jìn)行DNA凝膠電泳并進(jìn)行膠回收，2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離，QIAquick Gel Extraction Kit試劑盒純化回收DNA片段。

1.2.4 質(zhì)粒連接

體系：T4 DNA連接酶350 U/μl 1 μl、10×T4 DNA連接酶緩沖液2 μl、膠回收后的PCR酶切產(chǎn)物0.4 μg、膠回收后的載體酶切產(chǎn)物0.2 μg、補(bǔ)充ddH2O到總體積為20 μl、反應(yīng)溫度25℃2 h，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆于LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基中，送菌液進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

測(cè)序無(wú)誤后的細(xì)菌于LB培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，質(zhì)粒中提。293T細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞增殖到80%左右時(shí)，進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞以適宜的密度接種到6孔培養(yǎng)板上，待細(xì)胞達(dá)到90%匯合度左右時(shí)，配置所需溶液。每孔：溶液1：200 μl無(wú)血清培養(yǎng)基+10 μl脂質(zhì)體2000，溫育10 min；溶液2：X μl無(wú)血清培養(yǎng)基+4 μg質(zhì)粒，將2種溶液混合，室溫30 min，同時(shí)用無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗6孔板中的細(xì)胞，沖洗2遍后，加入2 ml無(wú)血清培養(yǎng)基，逐滴將2種溶液的混合液加入孔中，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，混合均勻。在37℃、5%的CO2中培養(yǎng)8～12 h后，更換含有血清的完全培養(yǎng)基；再于37℃、5%的CO2中培養(yǎng)48～72 h，加嘌呤霉素進(jìn)行藥篩。

1.2.6 Western Blot檢測(cè)融合蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)

將病毒感染藥篩后的細(xì)胞培養(yǎng)，待達(dá)到一定匯合度后，胰酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液，1 200 r/min離心5 min；棄去上清，加入PBS清洗，1 200 r/min離心5 min；棄去上清，加入細(xì)胞裂解液，充分混勻，冰浴30 min，4℃，12 000 r/min，離心20 min；轉(zhuǎn)移上清至新的1.5 ml離心管中，按BCA蛋白質(zhì)在定量試劑盒說(shuō)明書，用分光光度計(jì)對(duì)蛋白進(jìn)行定量。向蛋白液中加入4×Loddingbuffer，混勻，100℃，煮沸10min，保證蛋白質(zhì)充分變性。配置聚丙烯酰胺凝膠，按定量的結(jié)果，取50 μg上樣量，80 V待Marker分開(kāi)，120V跑至溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，300mA 2h，將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上；用含5%脫脂牛奶的TBST封閉NC膜2 h，兔單抗EZH2（1∶1 000），H3K27me3（1∶3 000），H3（1∶5 000），鼠單抗β-actin（1∶3 000），4℃孵育過(guò)夜，用TBST于搖床上洗3次，每次10min；用山羊抗兔和山羊抗鼠二抗（1∶3 000）室溫孵育2 h，TBST于搖床上洗3次，每次10 min；ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，Tanan 4500全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析儀掃描，ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄水平EZH2的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)分為3組：①CD510-B-1空載組。②CD510-B-1-EZH2過(guò)表達(dá)組。③CD510-B-1-EZH2-SET1組。收集3組經(jīng)嘌呤霉素藥篩后的細(xì)胞，加入Trizol，充分混勻，按Trizol法提取細(xì)胞中總的RNA，取出1 μg RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，RT-PCR擴(kuò)增cDNA片段，引物序列：EZH2上游5'gttggcggaagcgtgtaaagactin 3'，下游5'gtatccttcgctgcttccattc3'，β-actin上游5'TTGCTGACAGGATGCAGAAG3'，下游5'ATCCACATCTGCTGGAAGGT3'。PCR反應(yīng)體系：Mix 10 μl，primer F 0.4 μl，primer R 0.4 μl，Rox 0.4 μl，cDNA 2 μl，ddH2O 6.8 μl。反應(yīng)條件：95℃5 min；95℃15 s，60℃1 min，共循環(huán)40次，95℃15 s，60℃1 min，95℃30 s，60℃15 s。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

Western Blot結(jié)果以Bandscan軟件圖像分析。使用SPSS10.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件ANOVE和Tukey對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，所有數(shù)值以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒鑒定結(jié)果

Lenti-pCDH-CMV-puro-VECTOR圖譜及EZH2基因SET domain位置如圖1所示，BamHI和Not 1為雙酶切位點(diǎn)，同時(shí)在目的基因EZH2示意圖中標(biāo)示出SET domain位置。

圖1 Lenti-pCDH-CMV-puro-VECTOR圖譜與基因EZH2的SET domain位置

EZH2/Lenti-pCDH-CMV-puro-VECTOR圖譜及EZH2-SET1/Lenti-pCDH-CMV-puro-VECTOR重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果如圖2所示。1～6分別為DNA Marker，EZH2基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)BamHI、Not 1雙酶切，EZH2基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)BamHI單酶切，DNAMarker，EZH2催化亞基SET domain缺失質(zhì)粒經(jīng)BamHI、Not 1雙酶切，EZH2催化亞基SET domain缺失質(zhì)粒經(jīng)BamHI、Not 1單酶切。如圖1所示，2種重組質(zhì)粒經(jīng)BamHI/Not 1雙酶切以及BamHI單酶切鑒定后，所得片段與預(yù)期片段吻合。

圖2 E2H2/Lenti-pCDH-CMV-puro-VECTOR及EZH2-SET1/LentipCDH-CMV-puro-VECTOR重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果

此外，分別采用PCR和重疊PCR法獲得目的序列產(chǎn)物，產(chǎn)物與載體分別雙酶切，酶切產(chǎn)物切膠回收后進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物涂板，挑取單菌落測(cè)序，經(jīng)GeneBank BLAST比較，測(cè)序結(jié)果與目標(biāo)片段序列吻合。（圖3）

2.2 EZH2與H3K27me3蛋白在293T細(xì)胞中的表達(dá)

經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染并經(jīng)嘌呤霉素藥篩后的細(xì)胞，培養(yǎng)起來(lái)后收集細(xì)胞提取蛋白。采用Western Blot法分別檢測(cè)了EZH2和H3K27me3蛋白的表達(dá)量（圖4）。如圖所示，對(duì)于EZH2過(guò)表達(dá)組，可在293T細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)EZT2蛋白（P＜0.01）與H3K27me3蛋白（P＜0.05）的過(guò)表達(dá)；但對(duì)于EZH2催化亞基SET domain缺失組，僅可在293T細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)EZH2蛋白的過(guò)表達(dá)（P＜0.01），而在H3K27me3蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化。此外，對(duì)于E3K27me3蛋白表達(dá)水平，EZH2過(guò)表達(dá)組與EZH2催化亞基SET domain缺失組相比其表達(dá)量增加，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與正常293T細(xì)胞相比，感染后的細(xì)胞的EZH2蛋白表達(dá)量以及其作用下游蛋白H3K27me3的表達(dá)量明顯上調(diào)，從蛋白水平上說(shuō)明EZH2基因在293T細(xì)胞當(dāng)中成功實(shí)現(xiàn)了過(guò)表達(dá)。

2.3 EZH2 mRNA在293T細(xì)胞中的表達(dá)

經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，收集細(xì)胞加入Trizol提取RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增目的基因EZH2，結(jié)果如圖5所示。與正常293T細(xì)胞組相比，感染組EZH2 mRNA的表達(dá)量明顯上調(diào)（P＜0.001），從mRNA水平上驗(yàn)證EZH2基因在293T細(xì)胞中成功實(shí)現(xiàn)了過(guò)表達(dá)。

3 討論與結(jié)論

心臟病是危害人類健康和生命的3大疾病之一[12]。心肌肥厚是在如壓力，神經(jīng)體液因子以及心肌基因突變等作用下心肌細(xì)胞出現(xiàn)的一種適應(yīng)性反應(yīng)。早期的心肌肥厚對(duì)維持心肌正常的功能有益，但肥厚過(guò)程提高了心肌耗氧量，引起心肌順應(yīng)性下降。因此，持續(xù)的心肌肥厚將導(dǎo)致心力衰竭和死亡。心肌肥厚是多種心臟疾病發(fā)生發(fā)展中的一個(gè)較為重要的階段，但其形成機(jī)制目前尚未完全闡明。近年來(lái)的研究揭示了一些與心肌肥厚相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路，包括Ca2+及其相關(guān)的通路，PIP3激酶通路，以及MAPK通路和JAK、STAT通路等。研究方法主要集中在通過(guò)構(gòu)建心肌肥厚動(dòng)物模型來(lái)揭示心肌肥厚的形成機(jī)制。因此，研究心肌肥厚的分子機(jī)制，進(jìn)而找到一個(gè)有效而精準(zhǔn)的治療方法對(duì)于增加心肌肥厚患者的存活率極為重要。

圖3 A EZH2基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果;B EZH2催化亞基SET domain缺失質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果

圖4 EZH2和H3K27me3在293T中的蛋白表達(dá)水平

圖5 EZH2的mRNA的表達(dá)量

隨著基因組學(xué)研究的發(fā)展，疾病發(fā)生機(jī)制中基因的表觀遺傳修飾日益受到重視，主要包括DNA以及組蛋白的甲基化和乙?；揎棧渲修D(zhuǎn)錄水平修飾被認(rèn)為與很多信號(hào)通路以及疾病的發(fā)生相關(guān)。EZH2作為PRC2復(fù)合體中主要的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，可引起組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化。有報(bào)道稱，MicroRNA-214通過(guò)抑制EZH2發(fā)揮，可促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大[13-14]。同時(shí)，EZH2以及相關(guān)的H3K27三甲基化在心肌細(xì)胞中表達(dá)，使H3K27三甲基化的水平在心肌祖細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞過(guò)程中增加，能夠誘導(dǎo)和調(diào)控干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化[15]。但是關(guān)于EZH2與心肌肥厚的關(guān)系尚存爭(zhēng)論，有研究顯示，增加EZH2的穩(wěn)定以及功能可抑制心肌肥厚的產(chǎn)生[16]，而前期的研究也表明EZH2與心肌肥厚可能存在關(guān)聯(lián)。

EZH2基因SET domain區(qū)域在結(jié)構(gòu)上高度保守，對(duì)于EZH2發(fā)揮甲基化功能至關(guān)重要。EZH2基因本身片段比較大，SET domain區(qū)域缺失減少了目的基因的片段長(zhǎng)度，導(dǎo)致形成重組質(zhì)粒的幾率更大。因此，與EZH2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒相比，SET domain缺失質(zhì)粒在293T細(xì)胞中表達(dá)效率更高，感染幾率更大。在研究EZH2基因與心肌肥厚關(guān)系中，探究SET domain區(qū)域的缺失對(duì)于EZH2基因與心肌肥厚的相互關(guān)聯(lián)中具有重要意義。

為了研究EZH2在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用，以及EZH2催化亞基的作用，本研究構(gòu)建了大鼠特異性EZH2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒與EZH2催化亞基缺失SET domain質(zhì)粒，并通過(guò)測(cè)序證實(shí)。Western Blot與RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的EZH2蛋白與mRNA實(shí)現(xiàn)了過(guò)表達(dá)。研究結(jié)果為下一步大鼠中EZH2與心肌肥厚的關(guān)系以及EZH2催化亞基對(duì)EZH2的整體重要性的研究提供了基礎(chǔ)。

利益沖突無(wú)

[1]Loffredo F S,Steinhauser M L,Jay SM,et al.Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy[J].Cell,2013,153(4):828-839.DOI:10.1016/j.cell. 2013.04.015

[2]Yang Y,Ago T,Zhai P,Abdellatif M,Sadoshim J.Thioredoxin 1negatively regulates angiotensin II-induced cardiac hypertrophy through upregulation of miR-98/let-7[J].Circ Res,2011,108(3): 305-313.DOI:10.1161/circresaha.110.228437

[3]Fiedler J,Thum T.MicroRNAs in myocardial infarction[J].Arterios Thromb Vas Biol,2013,33(2):201-205.DOI:10.1161/atvbaha.112. 300137

[4]Li M,Yu M,Liu C,et al.MiR-34c works downstream of p53 leading to dairy goat male germline stem-cell(mGSCs)apoptosis[J].Cell Prolif,2013,46(2):223-231.DOI:10.1111/cpr.12013

[5]KathirvelP,RameshKumarG,SankaranarayananK.A computational prediction of conserved microRNA targets of ion channels in vertebrates[J].Curr Bioinform,2013,8(1):93-111.DOI: 10.2174/1574893611308010015

[6]Vincenzo L,Ventura C.Regenerative medicine approach to repair the failing heart[J].Vas Pharmacol,2013,58(3):159-63.DOI: 10.1016/j.vph.2013.01.002

[7]Roche P,Czubryt M P,Wigle J T.MolecuLar mechanisms of cardiac development[J].Car Adapt,2013,4(6):19-39.DOI:10.1007/978-1-4614-5203-4_2

[8]Li S,Zhu J,Zhang W,et al.Signature microRNA expression profile of essential hypertension and its novel link to human cytomegalovirus infection[J].Circulation,2011,124(2):175-184.DOI:10.1161/circulationaha.110.012237

[9]Stauffer B L,Russell G,Nunley K,et al.MiRNA expression in pediatric failing human heart[J].J Mol Cell Cardiol,2013,57(4):43-46.DOI:10.1016/j.yjmcc.2013.01.005

[10]Ryu S,Mcdonnell K,Choi H,et al.Suppression of miRNA-708 by polycomb group promotes metastases by calcium-induced cell migration[J].Cancer Cell,2013,23(1):63-76.DOI:10.1016/j.ccr. 2012.11.019

[11]Delgado-olguín P,Huang Y,Li X,et al.Epigenetic repression of cardiac progenitor gene expression by Ezh2 is required for postnatal cardiac homeostasis[J].Nat Genet,2012,44(3):343-347.DOI: 10.1038/ng.1068

[12]陸曉華,夏靈.基于離子通道的心肌細(xì)胞建模與仿真研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程分冊(cè),2005,28(5):286-289. Lu X H,Xia L.Progress in ion-channel-based myocardium modeling and simulation[J].Biomed Eng Foreign Med Sci,2005,28(5):286-289.

[13]Yang T,Zhang GF,Chen XF,et al.MicroRNA-214 provokes cardiac hypertrophy via repression of Ezh2[J].Biochem Biophys Res Commun,2013,436(4):578-584.DOI:10.1016/j.bbrc.2013.05.079

[14]Yang T,Gu HH,Chen XF,et al.Cardiac hypertrophy and dysfunction induced by overexpression of miR-214 in vivo.J Surg Res,2014,192(2):317-325.DOI:10.1016/j.jss.2014.06.044

[15]孫麗莉,李建遠(yuǎn).胚胎干細(xì)胞的定向心肌分化及其調(diào)控機(jī)制[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程分冊(cè),2005,28(5):261-264. Sun L L,Li J Y.Progress in ion-channel-based myocardium modeling and simulation[J].Biomed Eng Foreign Med Sci,2005,28(5):261-264.

[16]Mathiyalagan P,Okabe J,Chang L,et al.The primary microRNA-208b interacts with Polycomb-group protein,Ezh2,to regulate gene expression in the heart[J].Nucleic Acids Res,2014,42(2):790-803. DOI:10.1093/nar/gkt896

Construction and identification for the EZH2 gene overexpression plasmid and EZH2 catalytic subunit SET domain deletion plasmid in rats

Xiong Xianjia,Yang Bing,Zhao Xiujuan,Sun Yan,Zhao Jiansong,Wu Lili,Liu Yijie,Zhang Ling
School of Basic Medical Sciences,Tianjin Medical University,Tianjin 300070,China(Xiong XJ,Yang B,Zhao XJ, Sun Y,Wu LL,Liu YJ,Zhang L);Department of Electrical Engineering,Tianjin Bohai Vocational Technical College, Tianjin 300402,China(Zhao JS)

ObjectiveTo constructe the rat-specific EZH2 overexpression plasmid and the EZH2 catalytic subunit SET domain deletion plasmid,as well as assess their levels of expression in 293T cells.MethodsThe RNA extracted from rat cardiac tissue was reverse-transcribed into cDNA,the cDNA of catalytic subunit SET domain deleted EZH2 was amplified by overlap PCR,then the PCR amplification was achieved using the EZH2 gene as template.Products through PCR amplification and vector were cut with double enzyme,and then ligated the target fragments,purified by gel extraction,using T4 ligase.The ligated products were transferred into competent cells.After plate coating,monoclonal picking,shaking cultivation and sequencing procedures,the plasmids were extracted and transfected into 293T cells using liposome-mediated method.ResultsWestern Blot and RT-PCR assays showed recombinant plasmids DNA can successfully overexpress EZH2 gene in 293T cells.ConclusionsTwo plasmids were successfully constructed.This study laid the foundation for the further study on the relationship between EZH2 and myocardial hypertrophy,and the function of EZH2 catalytic subunit.

EZH2;Catalytic subunit;Recombinant plasmid;Cardiac hypertrophy

Zhang Ling,Email:zhanglsl@tmu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金（81500170）；天津市自然科學(xué)基金（15JCYBJC25400，16JCQNJC12100，16JCQNJC10300）；天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計(jì)劃項(xiàng)目（20130103）；教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金資助項(xiàng)目

2016-08-12）

張玲，Email：zhanglsl@tmu.edu.cn

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．06．002