PEG對肝素化PCL/PEG人工血管膜材料中肝素釋放的影響

毛迎李超婧王富軍丁雯米杏妍王璐

201620上海，東華大學紡織學院，紡織面料技術教育部重點實驗室

PEG對肝素化PCL/PEG人工血管膜材料中肝素釋放的影響

毛迎李超婧王富軍丁雯米杏妍王璐

201620上海，東華大學紡織學院，紡織面料技術教育部重點實驗室

目的研究聚乙二醇（PEG）的加入對肝素化聚己內酯/聚乙二醇（PCL/PEG）人工血管膜材料中肝素體外釋放的影響。方法通過共混法和冷凍干燥技術制備不同PEG質量分數(shù)（0、5%、10%、15%）的肝素化PCL/PEG膜材料，并通過體外釋放實驗考察PEG的加入對肝素釋放性能的影響。同時，通過X射線衍射、傅里葉紅外光譜和差示掃描熱分析儀探究PEG的加入對基體結構性能的影響。結果PEG的加入降低了肝素從基體釋放的難度，提高了肝素第1天的平均釋放速率和34 d內的累積釋放率，且兩者在一定程度上隨著PEG質量分數(shù)的增加而增大。X射線衍射、傅里葉紅外光譜和差示掃描熱分析結果均表明，肝素的加入會使PCL膜的結晶度在一定程度上有所增大，但整體影響并不顯著，且肝素的加入會促進PEG晶粒的生長，肝素和PEG在基體中呈現(xiàn)共域化分布。結論利用共混法和冷凍干燥技術制備了肝素化PCL/PEG膜材料，并可通過調控PEG的質量分數(shù)在一定程度上實現(xiàn)對肝素釋放行為的控制，進而預測試樣在一定程度上具有抗凝作用，該材料有望用作小口徑人工血管膜材料。

肝素化；共混；藥物緩釋；血管膜材料

Fund program:Natural Science Foundation of China(81371648);Fundamental Research Funds for the Central Universities,China(2016);Project 111(B07024);National Postdoctoral Foundation(2016M590299);Science and Technology Support Program of Shanghai(16441903803)

0 引言

20世紀60年代起,研究者開始利用肝素化來提高材料的抗凝血性[1]，目前肝素化研究仍是一個很熱門的方向。肝素化的定義可概括為肝素或其衍生物在材料上的固定化[2]，它是提高材料血液相容性的重要方式。臨床上通常采用肝素注射的方法來提高抗凝血性，但注射肝素會引起各種并發(fā)癥，從而限制了一些臨床上高難度手術的進行。然而，肝素化的推廣在一定程度上解決了以上問題。目前，許多學者已成功實現(xiàn)了肝素分子在生物材料表面上的固定化，從而大大提高了血液接觸材料的抗凝血性能[3-6]。肝素化的方法有很多，按其固定化力的性質，可分為物理吸附[7]和化學結合兩大類,而化學結合又可進一步分為離子鍵合法和共價鍵合法[8]。雖然肝素以共價鍵和離子鍵的形式結合到血管移植物的管腔內表面，一定程度上阻止了血栓的形成，但仍存在一些問題。共價鍵的結合方式可牢固地將肝素固定在材料表面，但會破壞肝素的功能構象，導致抗凝功能發(fā)揮不充分；而離子鍵的結合方式雖保證了肝素功能的發(fā)揮，但其結合能力較弱，難以實現(xiàn)長期抗凝的功能。相對來說，共混法是實現(xiàn)材料肝素化的最簡單方法，且該法既不會破壞肝素的共價鍵，也不易導致肝素失效；但會導致大多數(shù)肝素或其衍生物被包埋在材料內部而不能發(fā)揮作用[9]，故如何解決肝素的釋放成為了研究的關鍵。本研究利用共混法和冷凍干燥技術制備了肝素化聚己內酯/聚乙二醇（ploy（ε-caprolactone）/polyethylene glycol,PCL/PEG）膜材料，探究了不同PEG質量分數(shù)的肝素化PCL/PEG膜材料的藥物釋放性能，并采用多種表征手段對其結構性能進行了一系列的表征，進一步分析PEG的加入對肝素化PCL/PEG膜材料中肝素釋放的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

肝素（效價≥170 U/mg）、PEG（相對分子質量為4 000 u）、乙酸（分析純）、甲苯胺藍（相對分子質量為305.8）（國藥集團化學試劑有限公司），PCL（相對分子質量為80 000 u）（深圳市光華偉業(yè)實業(yè)有限公司）。

X85-2S恒溫磁力攪拌器（上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司），F(xiàn)D-1A-50冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司），TS-100C恒溫搖床（上海柏欣儀器設備廠），TU-1901紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），D/max-2550PC X射線多晶衍射儀（日本Rigaku公司），Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），DSC4000差示掃描熱分析儀（美國PerkinElmer公司）。

1.2 方法

1.2.1 肝素化PCL/PEG膜的制備

將總質量為2.2 g的PCL和PEG按一定質量比溶于22 ml乙酸中，磁力攪拌，完全溶解后向其中加入2.2 ml質量分數(shù)為1%的肝素水溶液，混勻并將其倒入干凈的玻璃皿中，冷凍干燥后得不同PEG質量分數(shù)（0、5%、10%、15%）的肝素化PCL/PEG膜。

1.2.2 體外緩釋

準確稱取0.5 g肝素化PCL/PEG膜，將其放入含150 ml磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）的白口瓶中；將白口瓶放入恒溫搖床中，搖床溫度設為37℃，轉速設為120 r/min；分別于1、4、8、24 h（1 d）、96 h（4 d）、192 h（8 d）、312 h（13 d）、456 h（19 d）、624 h（26 d）和816 h（34 d）時從白口瓶中抽取2．5 ml浸提液，按對應的編號做好標記，再補充2.5mlPBS至白口瓶中；根據(jù)甲苯胺藍分光光度法[10]，分別向浸提液中加入2.5 ml甲苯胺藍溶液后置于恒溫搖床中，37℃反應0.5 h，使肝素鈉與甲苯胺藍反應形成配合物；再加入2 ml正己烷，充分振蕩1 min，將配合物萃取至有機層，未絡合的甲苯胺藍則仍留在水相中；取下層水相，使用分光光度計測其在631 nm處的吸光度值，進一步分析獲得不同時間點對應的浸提液中肝素鈉的含量。

1.2.3 測試與表征

（一）X射線衍射分析

使用X射線多晶衍射儀分別測定PCL/PEG膜、肝素和肝素化PCL/PEG膜的結晶結構。衍射源為Cu/K-α1，電壓為40 kV，電流為200 mA，掃描速度為3°/min，掃描范圍為5°～60°。

（二）傅里葉變換紅外光譜分析

使用傅里葉變換紅外光譜儀分別對肝素、PCL膜、PCL/PEG膜和肝素化PCL/PEG膜的化學結構進行比較和表征，波數(shù)掃描范圍為500～4 000 cm-1。

（三）差示掃描熱分析

采用差示掃描熱分析儀對不同PEG質量分數(shù)的試樣進行測試。單次測試樣品質量為5 mg，氣氛為氮氣，升/降溫速率為10℃/min，溫度掃描范圍為-30～80℃。

圖2 不同聚乙二醇質量分數(shù)的肝素化聚己內酯/聚乙二醇膜的肝素釋放特征圖

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS Statistics 23.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 體外釋放

不同PEG質量分數(shù)（0、5%、10%、15%）的肝素化PCL/PEG膜的肝素釋放曲線和特征圖分別如圖1和2所示。由圖1、2可看出，不添加PEG時，肝素被包裹在PCL基體內難以釋放出來；4 d內肝素的累積釋放率基本不發(fā)生變化，后期隨著PCL基體的溶脹，肝素漸漸釋放出來，但34 d內肝素的累積釋放率＜15%。當加入PEG之后，第1天的肝素平均釋放速率和34 d內的肝素累積釋放率均大幅提高（均P＜0.001）；在一定范圍內，隨著PEG質量分數(shù)的增加，肝素第1天的平均釋放速率和34 d內的累積釋放率均逐漸增加。此外，由于PCL膜材料疏水且降解較慢，在釋放第1天，被包裹在膜內的肝素隨著PEG的溶出而產生突釋；在第2～8天，加入PEG的共混膜中幾乎無肝素釋放出來，推測PEG在第1天即已從共混膜中完全溶出，且8 d內PCL膜在中性環(huán)境中可能還未發(fā)生降解；后來隨著浸提液侵入PCL基體內部，材料發(fā)生溶脹，肝素才漸漸釋放出來，預計隨著材料的降解肝素能在后期被緩慢釋放出來。

2.2 X射線衍射分析

圖3為肝素化PCL/PEG膜材料的X射線衍射圖。由圖3可知，低相對分子質量的肝素為完全非結晶的物質；在19°附近是PEG的特征衍射峰[11]，峰值較小但峰形尖銳，21°附近是PCL的特征衍射峰[12]，峰值高而峰形尖銳，24°附近是PEG和PCL特征衍射峰的疊加。此外，PCL/PEG膜的結晶度為73.57%，而肝素化的PCL/PEG膜的結晶度為79.65%，可推斷肝素的加入對試樣結晶度的提升并不顯著。但是，從19°附近PEG的特征衍射峰可看出，加入肝素后，試樣的峰值變強，這說明肝素的加入能促進PEG晶體的生長；從側面也反映出肝素和PEG在PCL基體中呈現(xiàn)共域化分布的趨勢[13]，而這種分布有利于肝素從基體中被釋放出來。

2.3 傅里葉紅外光譜分析

圖4和圖5分別為肝素化PCL膜和PCL/PEG膜材料的傅里葉紅外光譜圖。研究結果顯示，肝素在3 450 cm-1和1 620 cm-1附近具有明顯的特征峰，其中3 450 cm-1附近的特征峰分布較寬；PCL膜在3 000 cm-1和1750 cm-1附近具有明顯的特征峰，其中1750cm-1附近的特征峰非常尖銳；在PCL膜中加入肝素后，試樣的特征峰在3 450 cm-1和1 620 cm-1附近略有變化，其他特征峰位置基本無變化，但試樣的峰強度有所增強；而在PCL膜中加入PEG則使試樣的峰強度變大，但變化不太明顯；當在PCL膜中同時加入PEG和肝素時，試樣的峰強度明顯增大，結合X射線衍射的分析結果可推斷肝素對PEG的結晶具有一定的促進作用。

2.4 差示掃描熱分析

不同PEG質量分數(shù)的肝素化PCL/PEG膜的差示掃描熱分析結果如圖6所示。PCL膜的熔融溫度在60℃左右；當PCL膜中加入PEG后，熔融峰值向高溫偏移，能稍微提高PCL膜的熔融溫度，但熔融峰面積明顯減小，說明PEG的加入在一定程度上可使PCL膜的結晶度降低；當PCL膜中混入肝素時，PCL膜的熔融峰變得很寬，幾乎出現(xiàn)了雙峰值，且熔融溫度降低；當肝素化PCL/PEG膜中PEG的質量分數(shù)增至15%時，熔融性能又恢復。這說明肝素的加入對基體的結晶性能具有一定的影響，而PEG的加入可在一定程度上降低肝素對PCL膜結晶性能的改變?？傊?，PEG的加入在一定程度上降低了肝素從試樣中的釋放難度。

3 討論與結論

肝素是一類重要的抗凝血藥物，應用于臨床已有80多年[14-15]。肝素主要由葡萄糖胺、L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替組成，其分子中含有兩類活性基團,分別是—SO3-及—COO-等負離子和—OH及—NH—等官能團[9,16]。其中，負離子上的抗衡離子可進行離子交換；而—OH及—NH—上的氫能發(fā)生一系列的功能性反應。因此，利用離子交換反應及活潑氫原子的反應可將肝素分別以離子鍵和共價鍵固定在高分子的主鏈或側鏈上，實現(xiàn)本體材料的肝素化，但這或多或少會破壞肝素的活性。將肝素或其衍生物直接混入高分子材料中是實現(xiàn)材料肝素化的最簡單方法，且不會破壞肝素的活性，但該法會導致大多數(shù)肝素或其衍生物被包埋在材料內部而不能發(fā)揮其作用[9]，故如何解決肝素的釋放成了研究的關鍵。

本研究通過簡單的共混法和冷凍干燥技術將具有天然抗凝性的肝素鈉引入PCL/PEG材料中，得到了一種肝素化PCL/PEG膜材料。研究結果顯示，PEG的加入降低了肝素從基體釋放的難度，提高了肝素第1天的平均釋放速率和34 d內的累積釋放率，且兩者在一定程度上隨著PEG質量分數(shù)的增加而增大。PEG具有良好的水溶性，當其與體液接觸時易于從基體中溶出，從而為肝素的釋放提供了通道；同時，肝素和PEG在基體中呈現(xiàn)一種共域化分布，這些對肝素從基體中的釋放均是有利的。總之，本研究利用共混法和冷凍干燥技術制備了肝素化PCL/PEG膜材料，并可通過調控PEG的質量分數(shù)在一定程度上實現(xiàn)對肝素釋放性能的控制，進而預測試樣在一定程度上具有抗凝作用，該材料有望用作小口徑人工血管膜材料。

利益沖突無

（圖1、3～6見插頁6-11）

[1]Gott VL,Whiffen JD,Dutton RC.H eparin bonding on colloidal graphite surfaces[J].Science,1963,142(3597):1297-1298.

[2]譚紹早,沈家瑞,劉崇進.聚合物的肝素化[J].化工新型材料, 1998(5):16-18.

Tan SZ,Shen JR,Liu CJ.The heparinization of polymer[J].New Chem Mater,1998(5):16-18.

[3]包驥,孫赳,周永杰,等.去細胞化支架材料肝素化修飾及抗凝性能研究[J].生物醫(yī)學工程學雜志,2015,32(3):594-598.DOI: 10.7507/1001-5515.20150108.

Bao J,Sun J,Zhou YJ,et al.Anticoagulant ability and heparinization of decellularized biomaterial scaffolds[J].J Biomed Eng,2015,32(3): 594-598.DOI:10.7507/1001-5515.20150108.

[4]宋玉民,缐萍,李清萍,等.肝素雜化材料的制備及抗凝血性質的初步研究[J].無機化學學報,2011,27(4):631-636.

Song YM,Xian P,Li QP,et al.Preparation and preliminary study of anticoagulant properties of heparin hybrid materials[J].Chin J Inorg Chem,2011,27(4):631-636..

[5]You I,Kang MS,Byun Y,et al.Enhancement of blood compatibility of poly(urethane)substrates by mussel-inspired adhesive heparin coating[J].Bioconjug Chem,2011,22(7):1264-1269.DOI:10.1021/ bc2000534.

[6]Wei HL,Han LL,Ren J,et al.Anticoagulant surface coating using composite polysaccharides with embedded heparin-releasing mesoporous silica[J].ACS Appl Mater Interfaces,2013,5(23):12571-12578.DOI:10.1021/am403882x.

[7]Li GC,Xie B,Pan CJ,et al.Facile conjugation of heparin onto titanium surfaces via dopamine inspired coatings for improving blood compatibility[J].J Wuhan Univ Technol-Mater Sci Ed,2014,29(4): 832-840.DOI:10.1007/s11595-013-1005-5.

[8]Degoutin S,Jimenez M,Casetta M,et al.Anticoagulant and antimicrobial finishing of non-woven polypropylene textiles[J].Biomed Mater,2012,7(3):035001.DOI:10.1088/1748-6041/7/3/035001.

[9]文志紅,鄔素華,陳維濤.醫(yī)用肝素化抗凝血高分子材料的研究進展[J].塑料,2005,34(2):26-30.DOI:10.3969/j.issn.1001-9456. 2005.02.005.

Wen ZH,Wu SH,Chen WT.Heparinized medical and anticoagulativepolymericmaterials[J].Plastics,2005,34(2):26-30.DOI:10.3969/ j.issn.1001-9456.2005.02.005.

[10]劉秀英,張超燦,徐衛(wèi)林.甲苯胺藍分光光度法測定肝素鈉的研究[J].化學試劑,2009,31(4):271-274．DOI:10.3969/j.issn.0258-3283.2009.04.009. Liu XY,Zhang CC,Xu WL.Studies on spectrophotometric determination of heparin with toluidine blue[J].Chem Reag,2009,31(4): 271-274.DOI:10.3969/j.issn.0258-3283.2009.04.009.

[11]張樹鵬.聚乙二醇/功能化石墨烯層狀納米復合材料熱穩(wěn)定性的提高[J].化學學報,2012,70(12):1394-1400.

Zhang SP.Layer-aligned polyethylene glycol/functionalized graphene composites with improved thermal stability[J].Acta Chimica Sinica, 2012,70(12):1394-1400.

[12]李韻卒,楊益琴,楊勤武,等.鈦酸正丁酯催化纖維素纖維接枝聚己內酯[J].南京林業(yè)大學學報(自然科學版),2015,39(3):113-118.DOI:10.3969/j.issn.1000-2006.2015.03.021.

Li YZ,Yang YQ,Yang QW,et al.Catalytic grafting of cellulose fibers with polycaprolactone by tetrabutyl titanate[J].J Nanjing Fore Univ(Nat Sci Ed),2015,39(3):113-118.DOI:10.3969/j.issn.1000-2006.2015.03.021.

[13]Liu KL,Widjaja E,Huang YY,et al.A new insight for an old system:protein-PEG colocalization in relation to protein release from PCL/PEGblends[J].MolPharm,2011,8(6):2173-2182.DOI:10.1021/ mp200513b.

[14]Lyu Q,Cao CB,Zhu HS.A novel solvent system for blending of polyurethane and heparin[J].Biomaterials,2003,24(22):3915-3919. DOI:10.1016/S0142-9612(03)00266-7.

[15]劉章,姬勝利,王鳳山.低分子肝素的藥理作用和臨床應用研究進展[J].藥物生物技術,2014,21(6):573-578.

Liu Z,Ji SL,Wang FS.Research progress of the pharmacological effects and clinical applications of low molecular weight heparins[J]. Pharm Biotechnol,2014,21(6):573-578.

[16]Zia F,Zia KM,Zuber M,et al.Heparin based polyurethanes:A state-of-the-art review[J].Int J Biol Macromol,2016,84:101-111. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2015.12.004.

Influence of PEG on heparin release of heparin-loading PCL/PEG vascular prosthesis membranes

Mao Ying,Li Chaojing,Wang Fujun,Ding Wen,Mi Xingyan,Wang Lu
Textile College,Key Laboratory of Textile Technology,Ministry of Education of China,Donghua University,Shanghai 201620,China

ObjectiveToinvestigatetheinfluenceofpolyethyleneglycol(PEG)onheparinreleaseofheparinloaded polycaprolactone/polyethylene glycol(PCL/PEG)membranes used in artificial vascular peosthesis.Methods Heparin-loaded PCL/PEG membrane samples with different PEG mass contents of 0,0.5%,10%and 15%were prepared by blending method and freeze-drying technology.The influence of PEG on heparin release was experimental studied in vitro.The influence of PEG on the structural characteristics of the samples were investigated by X-ray diffraction,Fourier transform infrared spectrum and differential scanning calorimeter.ResultsThe addition of PEG reduced the heparin release resistance.The results showed that the average release rate of heparin in the first day and the release amount for 34 d were improved.Both these parameters increased with the increase of PEG mass content.The X-ray diffraction,Fourier transform infrared spectroscopy and differential scanning calorimetry showed that the crystallinity of PCL membrane was slightly enhanced by the addition of heparin,but the overall effect was not significant.In addition,the addition of heparin could promote the crystalline grain growth of PEG,and a common distribution of heparin and PEG in the matrix was observed.ConclusionsThe heparin release control can be achieved by adjusting the PEG mass content in heparin-loading PCL/PEG membranes prepared by blending method and freeze-drying technology.The proposed samples may have anticoagulant effect,which can be expected to be used as small-diameter artificial vascular prosthesis material.

Heparinization;Blending;Sustained release;Vascular membrane material

s:Wang Fujun,Email:wfj@dhu.edu.cn;Wang Lu,Email:wanglu@dhu.edu.cn

國家自然科學基金（81371648）；中央高?；究蒲袠I(yè)務費基地項目（2016）；“111計劃”（B07024）；中國博士后科學基金（2016M590299）；上海市科技支撐項目（16441903803）

2016-07-11）

王富軍，Email:wfj＠dhu．edu．cn；王璐，Email:wanglu＠dhu．edu．cn

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．06．007